Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Resumo

Aqui, nós descrevemos o método que nós empregamos à imagem filopódia dendríticas altamente motile em uma preparação viva do cérebro larval da Drosophila , e o protocolo que nós desenvolvemos para quantificar conjuntos de dados da imagem latente do lapso de tempo 3D para avaliações quantitativas do dendrito dinâmica no desenvolvimento de neurônios.

Resumo

O filopódia dendríticas altamente motile é extensamente atual nos neurônios em estágios desenvolventes adiantados. Essas ramificações dinâmicas exploratórias amostram o ambiente circundante e iniciam contatos com potenciais parceiros sinápticos. Embora a conexão entre a dinâmica do ramo dendrítico e a sinaptogênese esteja bem estabelecida, como os processos de desenvolvimento e dependentes da atividade regulam a dinâmica do ramo dendrítico não é bem compreendido. Isto é em parte devido às dificuldades técnicas associadas com a imagem latente viva e análises quantitativas destas estruturas finas usando um sistema in vivo. Nós estabelecemos um método para estudar a dinâmica do dendrito usando os neurônios laterais ventral da Drosophila larval (lnvs), que podem individualmente ser etiquetados usando aproximações genéticas e são acessíveis para a imagem latente viva. Aproveitando-se deste sistema, nós desenvolvemos protocolos para capturar a dinâmica do ramo de todo o mandril dendrítico de um único rotulado LNv através de imagens ao vivo de lapso temporal. Em seguida, realizamos pós-processamento para melhorar a qualidade da imagem através da correção de deriva e deconvolução, seguido pela análise dinâmica de ramo no nível de filial única, anotando posições espaciais de todos os terminais de filial. Por fim, desenvolvemos scripts R (arquivo suplementar) e parâmetros específicos para quantificar a dinâmica de ramificação usando as informações de coordenadas geradas pelo rastreamento do terminal. Coletivamente, este protocolo permite-nos alcançar uma descrição quantitativa detalhada da dinâmica do ramo do mandril dendrítico neuronal com alta resolução temporal e espacial. Os métodos que nós desenvolvemos são geralmente aplicáveis aos neurônios escassamente etiquetados em condições in vitro e in vivo.

Introdução

Os dendrites são compartimentos neuronais especializados que recebem e processam a entrada sensorial e sináptica. A estrutura complexa e estereotipada de mandris dendríticos tem sido intensa investigação desde a sua descoberta. Um número de sistemas do modelo, incluindo neurônios tectal de Xenopus ótico, pilhas retinal do gânglio do pintainho, e os neurônios dendríticas da arborização (da) no sistema de Drosophila , foram estabelecidos para estudar o desenvolvimento, a remodelação e a plasticidade de dendritos neuronal^1,2,3,4. Os neurônios laterais da Drosophila ventral (lnvs) são um grupo de neurônios de projeção Visual inicialmente identificados por suas importantes funções na regulação circadiana de comportamentos de mosca⁵. Os estudos igualmente revelaram o papel de lnvs larval como o alvo pós-sináptica direto dos FOTORRECEPTORES larval (PRS)^6,7. É importante ressaltar que a cultura do desenvolvimento de larvas em diferentes regimes de luz afeta fortemente o tamanho dos mandris dendríticos do LNvs, demonstrando a adequação dos LNvs como um novo modelo para o estudo da plasticidade dendrítica⁷. O trabalho recente do nosso grupo indica ainda que tanto o tamanho do dendrito LNV quanto o comportamento dinâmico dos galhos dendríticos exibem a plasticidade dependente da experiência^8,9. Como parte deste trabalho, desenvolvemos um novo protocolo de imagem e quantificação ao vivo para realizar análises sobre a dinâmica dendrito de lnvs de larvas^{de 2 ou} 3^RD instar.

A natureza transparente do cérebro de Drosophila larval fá-lo ideal para a imagem latente viva. No entanto, os mandris dendríticos de lnvs estão situados no neurópilo óptico larval densamente inervado (lon) no centro do lobo cerebral larval⁶. Para captar imagens de galhos de dendrito finos e filopónicos no tecido cerebral intacto, utilizamos microscopia de dois fótons, o que aumenta a profundidade da penetração da luz e reduz a fototoxicidade durante experimentos de imagem ao vivo¹⁰. Usando esta configuração, realizamos com sucesso experimentos de imagem ao vivo em LNvs por mais de 30 min sem observar a deterioração morfológica óbvia do Neuron. Além disso, as manipulações genéticas utilizando a técnica flip-out permitiram-nos rotular os lnvs individuais com uma membrana etiquetada GFP, que também é fundamental para o monitoramento dos movimentos de ramos individuais^11,12,13 .

Para capturar o comportamento dinâmico de todas as filiais no mandril dendríticas de LNV com definição ótica óptima, nós executamos a imagem latente do tempo-lapso 3D em explantes de cérebro larval recentemente dissecados com uma definição espacial elevada em 1 minuto por o frame para 10 a 30 minutos. desenvolvendo LNV dendritos são altamente dinâmicos, com uma grande percentagem dos ramos exibindo mudanças observáveis dentro da janela de 10 min. Isso leva a um dos principais desafios técnicos no estudo da dinâmica dendrito, quantificando o comportamento do ramo baseado nos conjuntos de dados de imagem 4D. Os métodos previamente estabelecidos têm várias limitações, incluindo a falta da exatidão e a exigência de tempo excessiva. Conseqüentemente, nós desenvolvemos um método semiautomático que combine o borne-processamento da imagem, a marcação manual dos terminais da filial, e o traçado 4D automático do ponto usando um software da anotação da imagem. Calculamos os movimentos dos terminais de filial em diferentes pontos temporais com base nas coordenadas 3D das manchas. Os dados são então exportados e analisados para produzir medições quantitativas da dinâmica da filial. Este método avalia com precisão a duração e extensão dos eventos de prorrogação e retração das ramificações existentes, bem como a formação de novos ramos, permitindo-nos monitorar a dinâmica dendrito em um grande número de neurônios.

Protocolo

Atenção: Este protocolo envolve o uso de lasers de classe IV e exigirá orientações adequadas de treinamento e segurança a serem seguidas. Evite a exposição dos olhos ou da pele à luz laser direta ou dispersa.
Nota: O protocolo inclui seis etapas. O fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1a.

1. rotulagem neurônios individuais usando a técnica flip-out

Nota: A única rotulagem de LNvs é conseguida expressando mCD8:: GFP em únicos LNvs usando a rotulagem estocástica mediada por flippase. O genótipo da linha de mosca é: HS-FLP; PDF-Gal4; Uas-FRT-CD2-Stop-FRT-mCD8:: GFP^11,12,13. A frequência de obter um único rotulado LNv é de cerca de 10%. Os estoques da mosca são mantidos no meio padrão em incubadoras de 25 ° c Circadian-e umidade-controladas.

1. Colete 100-200 ovos dentro de um 2 h janela pós fertilização em uma placa de suco de uva com suplemento de levedura. Incubar os embriões a 25 ° c por 24 h e coletar larvas de primeiro instar recém-eclodidas para a próxima etapa.
2. Choque térmico as larvas recém-eclodidas do primeiro instar a 37,5 ° c por 40 min duas vezes, com um período de recuperação de 40 min no meio.
3. Cultura das larvas a 25 ° c com controles circadianos e umidade para o estágio de desenvolvimento desejado (s).

2. dissecação e montagem explantes cerebrais larval

1. Dissecar os cérebros larvares na solução fisiológica salina externa (120 mM NaCl, 4 mM MgCl_2,3mm KCl, 10 mm NaHCO₃, 10 mm de glicose, 10 mm de sacarose, 5 mM tes, 10 mm HEPES, 2 mm CA^{2 +}, pH 7,2) um microscópio de dissecção (ampliação de 4,5 x de alimentação) com dois pares de #5 pinça de dissecção de ponta padrão (11 cm). Use um par de fórceps para prender o corpo larval no lugar e o outro para dissecar com cuidado o cérebro. Preserve os discos oculares, lóbulos cerebrais e o cordão nervoso ventral. Remova os músculos anexados para minimizar os movimentos da amostra durante a imagem.
2. Prepare uma lâmina de vidro (25 x 75 x 1,0 mm³) e use uma seringa para desenhar uma câmara quadrada com graxa a vácuo.
3. Adicionar 20 μL de solução salina externa à câmara quadrada com barreiras de graxa.
4. Transferência de cérebros larval dissecados para a câmara na lâmina de vidro usando fórceps. Ajuste a posição dos cérebros o âmbito de dissecção para garantir que o lado dorsal virado para cima.
5. Cubra a câmara com um deslizamento de cobertura de vidro (22 x 22 x 0,15 mm³). O cérebro larval é montado agora na corrediça dentro de uma câmara enchida com a solução salina externa (Figura 1B).
   Nota: Pressionando suavemente na lamínula limita o cérebro e reduz a deriva de amostra na sessão de imagem subseqüente.

3. tempo-lapso de imagem ao vivo

Nota: Realizamos experimentos de imagem de lapso de tempo usando um microscópio confocal equipado com um laser multifóton. Os parâmetros de aquisição precisam ser ajustados para outras configurações de imagem.

1. Identifique explantes cerebrais contendo neurônios individualmente rotulados usando um objetivo de imersão de água 40X (NA 1,3) e uma fonte de luz epifluorescente. Para a coleta de imagem, use um laser de dois fótons sintonizado para 920 nm e um detector não-descanned (NDD).
2. Colete imagens em 512 x 512 pixels por quadro e 1 min por Z-Stack por 10 min. Ajuste o zoom óptico e digital para obter uma resolução x-y-Z suficiente, assegurando a cobertura de todo o mandril dendrítico dentro de 1 min (Figura 2, vídeo complementar 1). as configurações geram imagens com uma resolução típica x-y-z de 0,11 x 0,11 x 0,25 μm³.
3. Colete a série da imagem do lapso de tempo dentro de 30 minutos da dissecção do cérebro. Os dados com desvio excessivo ou deterioração morfológica óbvia devem ser excluídos do pós-processamento e da quantificação.

4. correção de deriva e deconvolução

Nota: Dependendo da qualidade da imagem, ambas as etapas são opcionais, mas fortemente recomendadas.

1. Abra um arquivo de imagem adquirido com um software de correção de drift. Edite parâmetros microscópicos para corresponder àqueles usados para o experimento. Para o software (consulte a tabela de materiais), clique em Editar | Edite parâmetros microscópicos. Defina o tipo de microscópio como Widefield para imagens de dois fótons se não houver opção de dois fótons e siga o fluxo de trabalho definido pelo software. Por exemplo, abra a guia deconvolution | Estabilizador de objetoe escolha estabilizarprazos.
2. Abra a imagem corrigida por deriva no software deconvolução e siga seu fluxo de trabalho. Para o software (consulte a tabela de materiais), selecione a imagem estabilizada e clique em deconvolução | Deconvolução Express. Para obter um resultado melhor, ajuste os parâmetros usando o Assistente de deconvolução.
3. Salve a imagem descomplicada em um tipo de arquivo que é suportado pelo software de anotação de imagem subseqüente capaz de analisar dados 4D e relatar as coordenadas espaciais de pontos definidos na imagem (ver tabela de materiais).

5. anotação de imagem

1. Abra a imagem seções no software de anotação de imagem. Examine e marque dicas de ramificação em todos os pontos de tempo em 3D. O software de anotação de imagem relata e armazena as coordenadas espaciais e temporais das dicas de ramificação marcadas. Exporte as informações de coordenadas como um arquivo. csv para cálculos subsequentes.
   Nota: As duas etapas a seguir são específicas para o software de anotação que usamos (consulte tabela de materiais). O fluxo de trabalho pode ser diferente para outro software.
2. Dentro do módulo spots, clique em "pular criação automática, editar manualmente" e marque a caixa de seleção inferior "conectar automaticamente ao Spot selecionado" (Figura 3a). Vá sobre os quadros na série temporal e selecione uma ramificação para anotação. Segure a tecla Shift e clique na ponta do terminal de ramificação para adicionar um ponto. Clique em todos os pontos de tempo.
   Nota: O software de anotação de imagem conecta os pontos entre quadros e gera uma trajetória automaticamente. As informações espaciais e temporais das dicas de ramificação agora estão associadas a pontos marcados. Repita essas etapas até que todas as dicas de ramificação sejam anotadas (Figura 3B).
3. Dentro do módulo spots, clique na guia estatísticas , escolha detalhado e selecione valores específicos | Posição. As informações de coordenadas espaciais e temporais gravadas serão exibidas. Clique na parte inferior salvar para exportar essas informações como um arquivo. csv (Figura 3C).

6. calculando a dinâmica do ramo dendrítico

Nota: Usando as informações de coordenadas, o deslocamento das dicas de ramificação em 3D pode ser facilmente calculado. Em nosso estudo, todos os movimentos do ramo dendrítico são categorizados como extensão ou retração. As etapas abaixo descrevem como processar os arquivos. CSV usando scripts R personalizados (arquivo complementar) e adicionando as informações direcionais por meio da edição manual.

1. Abra o arquivo. csv como uma planilha. Selecione a coluna Track ID , clique na opção classificar menor para maior e aceite expandir a seleção. Após a classificação, o Track ID identifica cada ramificação dendrítica exclusiva e os pontos da mesma ramificação compartilham a mesma ID de faixa. A coluna de tempo armazena as informações de diferentes períodos de tempo.
2. Na planilha, adicione uma coluna de distância . Calcule a distância de cada dois pontos temporalmente adjacentes usando suas coordenadas e coloque os valores na coluna de distância (Figura 4a).
3. Movimentos menores no nível de VOXEL único. Com base nas configurações de imagem, 0,3 μm geralmente são artefatos de uma anotação de imagem não corrigida à deriva ou imperfeita. Filtre esses movimentos, redefinindo todos os valores de distância menores que 0,3 μm a 0. Processe vários arquivos. csv manualmente ou use nossa filtragem de coluna de lote de script R . R (arquivo complementar).
4. Gere manualmente uma nova coluna denominada deslocamento na folha de cálculo. Copie os valores da coluna Distance para a coluna de deslocamento . Atribua manualmente os eventos de extensão e retração para cada dica de ramificação. Se for uma extensão, deixe o valor de deslocamento inalterado, que é um valor positivo. Se for uma retração, altere o valor de deslocamento correspondente para um valor negativo (por exemplo, 0,35 para-0,35) (Figura 4B).
5. Gere uma nova coluna denominada Event. Nesta coluna, soma manualmente os valores de deslocamento para eventos de extensão e retração individuais (Figura 4B).
6. Processe a planilha modificada e quantifique os eventos de extensão e retração com base em seus valores de deslocamento usando a soma de coluna do lote de script R . R (arquivo complementar). Os parâmetros de saída incluem o número de eventos de extensão, o número de eventos de retração, o comprimento cumulativo estendido, o comprimento cumulativo recolhido, o comprimento líquido alteradoe o comprimento total viajado .

Resultados

Usando o protocolo de imagem ao vivo descrito acima, capturamos pilhas de imagens de alta resolução para as análises e quantificação subsequentes. O vídeo complementar 1 mostra a série da imagem projetada da intensidade máxima (MIP) coletada de um representante individualmente etiquetado LNV. a Figura 2B mostra a montagem correspondente de oito quadros da série de imagens. Em ambos os painéis, os setas marcam evento...

Discussão

Aqui, nós descrevemos um protocolo que nós desenvolvemos para registrar e quantificar o comportamento dinâmico de filiais dendríticas em neurônios individualmente etiquetados no cérebro larval da Drosophila . Notavelmente, nosso protocolo de imagens ao vivo contém parâmetros específicos que nos permitem capturar todo o mandril dendrítico de um LNV larval e fornecer uma visão global do estado dinâmico de seus ramos dendrito. No entanto, como nossos métodos de quantificação dependem fortemente da an...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chameleon Vision II multiphoton laser	Coherent
High vacuum grease	Dow Corning	79751-30
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope	Carl Zeiss		upright configuration
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Software
Excel	Microsoft		for processing .csv files
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	for drift correction and deconvolution
Imaris	Oxford Instruments		for 3D visualization and image annotation
Reagents
Glucose
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Sucrose
TES