Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Özet

Burada, Drosophila larva beyninin canlı bir hazırlığında son derece hareketli dendritik filopodia'yı görüntülemek için uyguladığımız yöntemi ve dendritin kantitatif değerlendirmeleri için hızlandırılmış 3D görüntüleme veri kümelerini ölçmek için geliştirdiğimiz protokolü anlatıyoruz. nöronlar gelişmekte dinamikleri.

Özet

Son derece hareketli dendritik filopodia erken gelişim evrelerinde nöronlarda yaygın olarak mevcuttur. Bu araştırmacı dinamik dallar çevredeki ortamı örneklemektedir ve potansiyel sinaptik ortaklarla temaslar başlatır. Dendritik dal dinamiği ile sinaptogenez arasındaki bağlantı iyi kurulmuş olsa da, gelişimsel ve aktiviteye bağlı süreçlerin dendritik dal dinamiği nasıl düzenlediği tam olarak anlaşılamamıştır. Bunun nedeni kısmen canlı görüntüleme ve in vivo sistemi kullanılarak bu ince yapıların kantitatif analizleri ile ilgili teknik zorluklardır. Drosophila larva ventral lateral nöronlar (LNvs) kullanarak dendrit dinamiği incelemek için bir yöntem oluşturduk, bu yöntem genetik yaklaşımlar kullanılarak ayrı ayrı etiketlenebilir ve canlı görüntüleme için erişilebilir. Bu sistemden yararlanarak, tüm dendritik çardakların dal dinamiklerini yakalamak için protokoller geliştirdik. Daha sonra sürüklenme düzeltme ve dekonvolution yoluyla görüntü kalitesini artırmak için post-processing gerçekleştirdik ve ardından tüm şube terminallerinin mekansal konumlarını ekleyerek tek dal düzeyinde dal dinamiklerini analiz ettik. Son olarak, terminal izleme tarafından oluşturulan koordinat bilgilerini kullanarak şube dinamiklerini ölçmek için R komut dosyaları(Tamamlayıcı Dosya)ve özel parametreler geliştirdik. Topluca, bu protokol bize yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük ile nöronal dendritik arbor dal dinamikleri ayrıntılı bir nicel açıklamasını elde etmek için izin verir. Geliştirdiğimiz yöntemler genellikle hem in vitro hem de in vivo koşullarda seyrek etiketli nöronlar için geçerlidir.

Giriş

Dendritler duyusal ve sinaptik girişi alan ve işleyen özel nöronal bölmelerdir. Dendritik çardakların karmaşık ve basmakalıp yapısı, keşiflerinden bu yana yoğun bir soruşturma altında. Model sistemleri, Xenopus optik tectal nöronlar, civciv retinaganglion hücreleri ve drosophila sisteminde dendritik arborization (da) nöronlar da dahil olmak üzere, geliştirme, remodeling ve plastisite incelemek için kurulmuştur nöronal dendritler^1,2,3,4. Drosophila ventral lateral nöronlar (LNvs) görsel projeksiyon nöronlar bir grup başlangıçta sinek davranışları sirkadiyen düzenleme önemli işlevleri için tanımlanan⁵. Çalışmalar da larva fotoreseptörleri doğrudan postsinaptik hedef olarak larva LNvs rolünü ortaya (PRs)^6,7. Daha da önemlisi, farklı ışık rejimlerinde gelişmekte olan larvaların kültürlenerek LNvs 'dendritik arbors boyutunu güçlü etkiler, dendritik plastisite eğitimi için yeni bir model olarak LNvs uygunluğunu gösteren⁷. Grubumuzdan son çalışmalar daha lnv dendrit boyutu ve dendritik dalların dinamik davranış deneyim bağımlı plastisite⁸,⁹görüntülemek gösterir. Bu çalışmanın bir parçası olarak, 2^{veya 3} instar larvasından LNvs'nin dendrit dinamiği üzerinde analiz yapmak için yeni bir canlı görüntüleme ve niceleme protokolü geliştirdik.

Drosophila larva beyninin şeffaf doğası onu canlı görüntüleme için ideal hale getirir. Ancak, LNvs dendritik arbors larva beyin lob^merkezindeyoğun innerve larva optik nöropil (LON) bulunmaktadır 6 . Bozulmamış beyin dokusunda ince dendrit dalları ve filopodia görüntüleri yakalamak için, biz ışık penetrasyon derinliğini artırır ve canlı görüntüleme deneyleri sırasında fototoksisite azaltır iki foton mikroskopi, kullanmak¹⁰. Bu kurulumu kullanarak, nöronun belirgin morfolojik bozulmasını gözlemlemeden LNvs üzerinde 30 dakikadan fazla canlı görüntüleme deneyleri gerçekleştirdik. Buna ek olarak, Flip-out tekniğini kullanarak genetik manipülasyonlar bize bir membran gfp etiketli ile bireysel LNvs etiketlemek için etkin, hangi da bireysel dalların hareketlerini izlemek için kritik^11,12,13 .

LNv dendritik arbor'daki tüm dalların dinamik davranışını optimum optik çözünürlüğe sahip olarak yakalamak için, 10 ila 30 dakika boyunca kare başına 1 dk yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip, yeni diseksiyonlu larva beyin ekstrelerinde hızlandırılmış 3D görüntüleme gerçekleştirdik. dendritler son derece dinamiktir ve dalların büyük bir yüzdesi 10 dk'lık pencerede gözlemlenebilir değişiklikler gösterir. Bu, dendrite dinamiğinin incelenmesinde, 4B görüntü veri kümelerine dayalı dal davranışının ölçülmesinde en önemli teknik zorluklardan birine yol açar. Daha önce kurulan yöntemler, doğruluk eksikliği ve aşırı zaman gereksinimi de dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar vardır. Bu nedenle, görüntü işleme sonrası, şube terminallerinin manuel işaretleme ve görüntü ek açıklama yazılımı kullanarak otomatik 4D nokta izleme birleştiren yarı otomatik bir yöntem geliştirdik. Şube terminallerinin hareketlerini noktalardaki 3B koordinatları esas alınabılarak farklı zaman noktalarında hesaplıyoruz. Veriler daha sonra dışa aktarılır ve şube dinamiğinin nicel ölçümlerini üretmek için analiz edilir. Bu yöntem, mevcut dalların uzatma ve geri çekilme olaylarının süresini ve kapsamını ve yeni dalların oluşumunu doğru bir şekilde değerlendirerek çok sayıda nöronda dendrite dinamiklerini izlememizi sağlar.

Protokol

DİkKAT: Bu protokol sınıf IV lazerlerin kullanımını içerir ve uygun eğitim ve güvenlik yönergeleriuyulmasını gerektirir. Doğrudan veya dağınık lazer ışığına göz veya cilt maruz kaçının.
NOT: Protokol altı adım dan oluşur. İş akışı Şekil 1A'dagösterilmiştir.

1. Flip-out Tekniğini Kullanarak Bireysel Nöronların Etiketlemi

NOT: LNvs tek etiketleme flippase aracılı stokastik etiketleme kullanarak tek LNvs mCD8 ifade ederek elde edilir::GFP. Sinek hattının genotip: hs-flp; Pdf-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8::GFP^11,12,13. LNv etiketli tek bir elde etme sıklığı %10 civarındadır. Sinek stokları sirkadiyen ve nem kontrollü 25 °C kuvözlerde standart ortamda muhafaza edilir.

1. Maya takviyesi ile bir üzüm suyu tabağı üzerinde 2 saat pencere sonrası döllenme içinde 100-200 yumurta toplayın. Embriyoları 25 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın ve yeni yumurtadan çıkan ilk instar larvalarını bir sonraki adım için toplayın.
2. Isı şoku 37.5 °C'de yeni yumurtadan çıkan ilk instar larvaları 40 dk iki kez, arada 40 dk geri kazanım süresi.
3. Kültür sirkadiyen ve nem kontrolleri ile 25 °C'de istenilen gelişim aşaması(lar).

2. Diseksiyon ve Montaj Larva Beyin Ekspekte

1. Fizyolojik dış salin çözeltisinde larva beyinlerinin diseksiyonu (120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO_3,10 mM Glikoz, 10 mM Sakkaroz, 5 mM TES, 10 mM HEPES, 2 mM Ca²⁺, PH 7.2) diseksiyon mikroskobu altında (4.5xnifikasyon büyütme) güç) iki çift #5 standart uç diseksiyonu forceps (11 cm) ile. Larva gövdesini yerinde tutmak için bir çift forceps kullanın ve diğerini de beyni dikkatlice parçala. Göz disklerini, beyin loblarını ve ventral sinir kordonu koruyun. Görüntüleme sırasında örnek hareketlerini en aza indirmek için bağlı kasları çıkarın.
2. Cam bir slayt hazırlayın (25 x 75 x 1,0 mm³⁾ve vakum gresile kare bir oda çizmek için bir şırınga kullanın.
3. Gres bariyerli kare haznesine 20 μL harici tuzlu çözelti ekleyin.
4. Kesitlenmiş larva beyinlerini çiller kullanarak cam kaydıraktaki odaya aktarın. Disksiyon kapsamı altında beynin konumunu ayarlayarak sırt tarafının yukarı yada dönük olduğundan emin olun.
5. Odayı cam kapak lı (22 x 22 x 0,15 mm³⁾kapatın. Larva beyni artık harici tuzlu çözeltisi ile dolu bir oda içinde slayt üzerine monte edilir (Şekil 1B).
   NOT: Kapak kaymasına hafifçe basmak beyni sınırlar ve sonraki görüntüleme seansında numunenin sürüklenmesini azaltır.

3. Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme

NOT: Multifoton lazerle donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak hızlandırılmış görüntüleme deneyleri yapıyoruz. Edinme parametrelerinin diğer görüntüleme kurulumları için ayarlanması gerekir.

1. 40X su daldırma hedefi (NA 1.3) ve epifloresan ışık kaynağı kullanarak tek tek etiketlenmiş nöronlar içeren beyin eksgelenetiği tanımlayın. Görüntü koleksiyonu için, 920 nm'ye ayarlanmış iki fotonlazer lazer ve descanned olmayan (NDD) dedektörü kullanın.
2. Kare başına 512 x 512 piksel ve 10 dakika boyunca Z-stack başına 1 dk görüntü toplamak. 1). Ayarlar tipik bir x-y-z çözünürlüğü 0,11 x 0,11 x 0,25 μm³görüntüler oluşturur.
3. Beyin diseksiyonu 30 dakika içinde zaman atlamalı görüntü serisi toplayın. Aşırı sürüklenme veya belirgin morfolojik bozulma içeren veriler post-processing ve nicelleştirme dışında tutulmalıdır.

4. Drift Düzeltme ve Deconvolution

NOT: Görüntü kalitesine bağlı olarak, her iki adım da isteğe bağlıdır, ancak şiddetle önerilir.

1. Edinilmiş bir resim dosyanı bir sürüklenme düzeltme yazılımıyla açın. Deney için kullanılanlarla eşleşecek mikroskobik parametreleri edin. Yazılım için (bkz. Malzeme Tablosu), Yap | Mikroskobik parametreleri edin. İki foton seçeneği yoksa iki fotonlu görüntüler için mikroskop türünü geniş alan olarak ayarlayın ve yazılım tarafından tanımlanan iş akışını izleyin. Örneğin, Deconvolution sekmesini açın | Nesne Sabitleyicive sabitle'nin zaman çerçevelerinisabitle'yi seçin.
2. Deconvolution yazılımındaki sürüklenme düzeltilmiş görüntüyü açın ve iş akışını izleyin. Yazılım için (Bkz. Malzeme Tablosu),stabilize edilmiş görüntüyü seçin ve ardından Deconvolution | Deconvolution Express. Daha iyi bir sonuç elde etmek için, Deconvolution Sihirbazıkullanarak parametreleri ince ayar.
3. 4B verileri çözümleme ve görüntüdeki tanımlı noktaların uzamsal koordinatlarını raporlama yeteneğine sahip sonraki görüntü ek açıklama yazılımı tarafından desteklenen bir dosya türünde deconvolved görüntüyü kaydedin (Bkz. Malzeme Tablosu).

5. Görüntü Ek Gösterimi

1. Görüntü ek açıklama yazılımındaki deconvolved görüntüyü açın. Şube ipuçlarını 3B olarak tüm zaman noktalarında inceleyin ve işaretleyin. Görüntü ek açıklama yazılımı, işaretli şube ipuçlarının uzamsal ve zamansal koordinatlarını bildirir ve saklar. Sonraki hesaplamalar için koordinat bilgilerini .csv dosyası olarak dışa aktarın.
   NOT: Aşağıdaki iki adım, kullandığımız ek açıklama yazılımına özgüdür (bkz. Malzeme Tablosu). İş akışı diğer yazılımlar için farklı olabilir.
2. Noktalar modülü içinde "Otomatik oluşturmayı atla, el ile değiştir" seçeneğini tıklayın ve alttaki " OtomatikBağlanın seçili Spot" onay kutusunu işaretleyin ( Şekil3A). Zaman serisindeki çerçevelerin üzerinden gidin ve ek açıklama için bir dal seçin. Shift tuşunu basılı tutun ve bir nokta eklemek için şube terminal ucunu tıklatın. Tüm zaman noktaları üzerinden tıklayın.
   NOT: Görüntü ek açıklama yazılımı kareler arasındaki noktaları bağlar ve otomatik olarak bir yörünge oluşturur. Şube ipuçlarının mekansal ve zamansal bilgileri artık işaretli noktalarla ilişkilidir. Tüm şube uçları açıklamalı olana kadar bu adımları tekrarlayın(Şekil 3B).
3. Noktalar modülünde İstatistikler sekmesini tıklatın, Ayrıntılı'yı seçin ve Belirli Değerler'i seçin | Pozisyon. Kaydedilen mekansal ve zamansal koordinat bilgileri sergilenecek. Bu bilgileri .csv dosyası olarak dışa aktarmak için Altyap'ı tıklatın (Şekil 3C).

6. Dendritik Dal DinamiğiNin Hesaplanması

NOT: Koordinat bilgileri kullanılarak, şube uçlarının 3B olarak yer değiştirmesi kolayca hesaplanabilir. Çalışmamızda tüm dendritik dal hareketleri Uzatma veya Geri Çekmeolarak kategorize edilir. Aşağıdaki adımlar, .csv dosyalarının özel yazılmış R komut dosyalarını(Tamamlayıcı Dosya)kullanarak ve manuel düzenleme yoluyla yön bilgilerini ekleyerek nasıl işleneceğiaçıklanmıştır.

1. .csv dosyasını elektronik tablo olarak açın. İzLE Kimliği sütununa tıklayın, En Küçükten En Büyüğe Sırala seçeneğini tıklatın ve seçimi genişlet'i kabul edin. Sıralamadan sonra, Track ID her benzersiz dendritik dalı tanımlar ve aynı daldaki noktalar aynı Track KIMLIĞINI paylaşır. Zaman sütunu farklı zaman dilimlerinin bilgilerini depolar.
2. Elektronik tabloya Bir Mesafe sütunu ekleyin. Koordinatlarını kullanarak her iki zamansal bitişik noktanın uzaklıklarını hesaplayın ve değerleri Uzaklık sütununa koyun(Şekil 4A).
3. Tek voxel düzeyinde küçük hareketler. Görüntüleme ayarlarına göre, 0,3 μm genellikle düzeltilmemiş sürüklenen veya kusurlu görüntü ek açıklama gelen eserlerdir. 0,3 μm'den 0'a kadar olan tüm Mesafe değerlerini sıfırlayarak bu hareketleri filtreleyin. Birden çok .csv dosyayı el ile işleyin veya R komut dosyası toplu sütun filtrelememizi kullanın. R (Ek Dosya).
4. Elektronik tabloda Yer değiştirme adlı yeni bir sütunel olarak oluşturun. Uzaklık sütunundaki değerleri yer değiştirme sütununa kopyalayın. Her şube ucu için uzantı ve geri çekme olaylarını el ile atayın. Bu bir uzantıysa, değiştirilen değeri değiştirmeden bırakın, bu da pozitif bir değerdir. Bu bir geri çekilme ise, karşılık gelen Yer Değiştirme değerini negatif bir değere (örneğin, 0,35'ten -0,35'e)değiştirin( Şekil 4B).
5. Olayadlı yeni bir sütun oluşturun. Bu sütunda, tek tek uzantı ve geri çekme olayları için Yer Değiştirme değerlerini el ile toplayın (Şekil 4B).
6. Değiştirilen elektronik tabloyu işleyip, R komut dosyası toplu sütun toplamını kullanarak uzantı ve geri çekme olaylarını yer değiştirme değerlerine göre ölçün. R (Ek Dosya). Çıkış parametreleri uzantı olay sayısı, geri çekme olayı sayısı, Kümülatif uzunluk uzatılmış, Kümülatif uzunluk geri çekilir, Net uzunluk değiştive toplam uzunluk .

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan canlı görüntüleme protokolünü kullanarak, sonraki analizler ve niceleme için yüksek çözünürlüklü görüntü yığınları yakalarız. Ek Video 1, tek tek etiketli lnv. Şekil 2B, görüntü serisinin sekiz karesinin ilgili montajını gösteren bir temsilciden toplanan maksimum yoğunluklu (MIP) görüntü serisini gösterir. Her iki panelde de ok uçları geri çekme olaylarını işaretle...

Tartışmalar

Burada, Drosophila larva beyinlerinde tek tek etiketlenmiş nöronlarda dendritik dalların dinamik davranışını kaydetmek ve ölçmek için geliştirdiğimiz bir protokolü tanımlıyoruz. Özellikle, canlı görüntüleme protokolümüz, bir larva LNv'nin dendritik arbor'unu yakalamamızı ve dendrit dallarının dinamik durumunu küresel olarak görmemizi sağlayan özel parametreler içerir. Ancak, sayısallaştırma yöntemlerimiz ağırlıklı olarak dal terminallerinin ek açıklamalarına dayandığı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chameleon Vision II multiphoton laser	Coherent
High vacuum grease	Dow Corning	79751-30
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope	Carl Zeiss		upright configuration
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Software
Excel	Microsoft		for processing .csv files
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	for drift correction and deconvolution
Imaris	Oxford Instruments		for 3D visualization and image annotation
Reagents
Glucose
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Sucrose
TES