זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

Summary

כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו מועסקים התמונה המרצפת הדנדריטי מאוד בהכנה חיה של המוח הזחל Drosophila ילה , ואת הפרוטוקול שפיתחנו לכמת זמן קפיצה 3d מערכות הדמיה עבור הערכות כמותית של דנדט דינמיקה בפיתוח נוירונים.

Abstract

מאוד מורצפת הדנדריטים הדנדרידיה נמצאים באופן נרחב בנוירונים בשלבים התפתחותיים מוקדם. הענפים הדינמיים הללו מדגימות את הסביבה ומפעילים אנשי קשר עם שותפים סינפטיים פוטנציאליים. למרות הקשר בין הדינמיקה של הענף הדנדריטי לבין synaptogenesis הוא מבוסס היטב, כיצד תהליכים התפתחותיים ותלויי פעילות לווסת את הדינמיקה ענף הדנדריטים אינו מובן היטב. זה בחלקו בשל הקשיים הטכניים הקשורים הדמיה חיה ניתוחים כמותיים של אלה מבנים בסדר באמצעות מערכת vivo. הקמנו שיטה לחקור את הדינמיקה של הדנדריטים באמצעות דרוסופילה זחל ונטולי לרוחב נוירונים (lnvs), אשר ניתן לתייג באופן אינדיבידואלי באמצעות גישות גנטיות ונגישים להדמיה חיה. ניצול של מערכת זו, פיתחנו פרוטוקולים כדי ללכוד את הדינמיקה הענף של הארבור הדנדריטים כולו של מסומן בודד באמצעות הדמיה בזמן ההדמיה חי. לאחר מכן בוצעו לאחר עיבוד כדי לשפר את איכות התמונה באמצעות תיקון הסחף ופירוק, ואחריו ניתוח דינמיקת הענף ברמת הענף היחיד על ידי ביאור מיקומים מרחביים של כל מסופי הסניפים. לבסוף, פיתחנו R סקריפטים (קובץ משלים) ופרמטרים ספציפיים כדי לכמת את הענף דינמיקה באמצעות מידע הקואורדינטות שנוצר על ידי מעקב הטרמינל. באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה מאפשר לנו להשיג תיאור כמותי מפורט של הדינמיקה הענף של ארבור הדנדריטי העצבי עם הזמן הגבוה ורזולוציה מרחבית. השיטות שפיתחנו חלות בדרך כלל על נוירונים בעלי תוויות בדלילות הן בתוך מבחנה והן בתנאים vivo.

Introduction

הדנדריטים הם תאי עצבים מיוחדים המקבלים ומעבדים את הקלט החושי והסינפטית. המבנה המורכב והסטרמוקליד של סוכת דנדריטי כבר תחת חקירה אינטנסיבית מאז גילויו. מספר מערכות מודל, כולל הנוירונים האופטיים tectal אופטי, בחורה ברשתית גנגליון תאים, ו arborization הדנדריטים (da) נוירונים במערכת Drosophila ילה , הוקמו כדי ללמוד את הפיתוח, שיפוץ ופלסטיות של . דנדריטים כפתונטים^1,2,3,4 דרוזופילה ונטלי נוירונים לרוחב (lnvs) הם קבוצה של נוירונים הקרנה חזותית מזוהה בתחילה עבור הפונקציות החשובות שלהם בוויסות אחראי של התנהגויות לטוס⁵. מחקרים גם חשפו את התפקיד של זחל החוצה כיעד הפוסט-סינפטיות הישיר של הזחל הפוטוקטורים (PRs)^6,7. חשוב לעשות זאת, כאשר מדובר בפיתוח זחלים במשטרים אור שונים, משפיע בחריפות על גודל הארבורס הדנדריטי, הממחיש את ההתאמה של אינvs כמודל חדש לחקר הפלסטיות הדנדריטי⁷. העבודה האחרונה מהקבוצה שלנו מצביעה עוד על כך שהגודל של הדנדריטים המורק וההתנהגות הדינמית של הענפים הדנדריטים מציגים הפלסטיות התלוי בחוויית החוויה^8,9. כחלק מעבודה זו, פיתחנו הדמיה חדשה ופרוטוקול הקוונפיקציה לבצע ניתוח על הדינמיקה הדנדריטים של lnvs^{מ 2 או} 3 הזחלים סינטסיומאיה.

האופי השקוף של מוח הזחל דרוזוהילה הופך אותו לאידיאלי להדמיה חיה. עם זאת, סוכת הדנדריטים של lnvs ממוקמים בצפיפות innervated זחל אופטית נוירופיל (LON) במרכז האונה המוח זחל⁶. כדי ללכוד את התמונות של ענפים דנדריטים בסדר הרקמה ברקמת המוח שלמים, אנו מנצלים שני פוטון מיקרוסקופ, אשר מגדיל את העומק של חדירה אור ומפחית את הרעילות במהלך ניסויים הדמיה חיה¹⁰. באמצעות התקנה זו, בוצע בהצלחה ניסויים הדמיה חיה על LNvs במשך 30 דקות בלי להתבונן הידרדרות מורפולוגית הברורה של העצב. בנוסף, מניפולציות גנטיות באמצעות הטכניקה להעיף החוצה איפשר לנו לתייג את האינvs הבודד עם קרום מתויג gfp, אשר גם קריטי לניטור התנועות של ענפים בודדים^11,12,13 .

כדי ללכוד את ההתנהגות הדינמית של כל הענפים על הארבור הדנדריטי עם הרזולוציה האופטית האופטימלית, הצלחנו לבצע הדמיה תלת-ממדית על-ידי הדמייה מוחית של זחל טרי עם רזולוציה מרחבית גבוהה ב 1 דקות לכל מסגרת עבור 10 עד 30 דקות. פיתוח מידע דנדריטים הם דינמיים מאוד, עם אחוז גדול של ענפים המציגים שינויים הנצפה בתוך החלון 10 דקות. זה מוביל לאחד האתגרים הטכניים העיקריים של לימוד הדינמיקה של הדנדריטים, התנהגות הענף ככמת מבוסס על ערכות נתוני התמונה 4-d. שיטות שנקבעו בעבר יש מגבלות שונות, כולל חוסר דיוק ודרישות זמן מופרז. לכן, פיתחנו למחצה אוטומטי שיטה המשלבת עיבוד לאחר התמונה, סימון ידני של מסופי הסניפים, ו-4D אוטומטי העקיבה באמצעות תוכנה ביאור תמונה. אנו מחשבים את התנועות של מסופי הענף בנקודות זמן שונות המבוססות על קואורדינטות 3D של הנקודות. לאחר מכן הנתונים יוצאו ונותחו כדי לייצר מדידות כמותיים של דינמיקת הענף. שיטה זו מעריך במדויק את המשך וההיקף של אירועי הארכה והנסיגה של ענפים קיימים, כמו גם היווצרות של ענפים חדשים, ומאפשר לנו לנטר את הדינמיקה של הדנדריטים במספר רב של נוירונים.

Protocol

זהירות: פרוטוקול זה כולל את השימוש של מחלקה IV לייזרים ידרוש הכשרה נאותה והנחיות בטיחות לעקוב. להימנע עין או חשיפה לעור לאור לייזר ישיר או מפוזר.
הערה: הפרוטוקול כולל שישה שלבים. זרימת העבודה מוצגת באיור 1א.

1. תיוג נוירונים בודדים באמצעות טכניקת פליפ-out

הערה: התיוג היחיד של LNvs מושגת על ידי הבעת mCD8:: GFP ב-LNvs בודד באמצעות בזלזול-בתיווך סטוכסטי תיוג. הגנוטיפ של קו הזבוב הוא: hs-flp; Pdf-Gal4; Uas-frt-CD2-להפסיק-frt-mCD8:: gfp^11,12,13. תדירות השגת היחידה המסומנת בתווית אחת היא כ -10%. מניות הזבוב נשמרות במדיום הסטנדרטי בcircadian-ומבוקרת לחות של 25 ° c.

1. לאסוף 100-200 ביצים בתוך 2 החלון h הפריה העמוד על צלחת מיץ ענבים עם תוספת שמרים. מחדש את העוברים ב 25 ° צ' עבור 24 שעות ולאסוף הזחלים הראשונים שבקע הראשון לשלב הבא.
2. מחממים את הזחלים הראשונים שבקעו ב-37.5 ° c במשך 40 דקות, עם תקופת החלמה של 40 דקות באמצע.
3. תרבות הזחלים ב -25 ° c עם שולטת מעגליות ולחות לשלב ההתפתחותי הרצוי.

2. מתנגדים והרכבה זחל המוח הגובר

1. נתח מוחות זחל בתמיסה הפיסיולוגית החיצונית (120 מ"מ מילימטר, 4 מ"מ MgCl₂, 3 מ"מ kcl, 10 Mm נחקו₃, 10 מ"מ סוכר, 10 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ, 10 מ"מ Hepes, 2 מ"מ Ca^{2 +}, PH 7.2) תחת מיקרוסקופ לנתיחה (4.5 x הגדלה כוח) עם שני זוגות של #5 מלקחיים לחיתוך בקצה הרגיל (11 ס מ). השתמש זוג אחד של מלקחיים כדי להחזיק את הזחל הגוף במקום והשני כדי לנתח בזהירות את המוח. שמור על דיסקי העין, אונות המוח וחוט העצב הגחוני. הסר את השרירים המחוברים כדי למזער את התנועות לדוגמה במהלך ההדמיה.
2. להכין שקופית זכוכית (25 x 75 x 1.0 מ"מ³) ולהשתמש במזרק כדי לצייר תא מרובע עם שומן ואקום.
3. הוסף 20 μL של פתרון מלוחים חיצוניים לחדר מרובע עם מחסומי גריז.
4. להעביר את המוח הזחל גזור לתוך התא על שקופית זכוכית באמצעות מלקחיים. התאימו את מיקום המוח מתחת לטווח החיתוך כדי להבטיח את הפנים הצדדיות.
5. כסו את החדר עם כיסוי זכוכית (22 x 22 x 0.15 מ"מ³). המוח הזחל מותקן כעת על השקופית בתוך חדר מלא בתמיסה מלוחים חיצונית (איור 1ב).
   הערה: הקשה בעדינות על הכיסויים מגבילה את המוח ומפחית את מדגם הנסחף בהפעלת ההדמיה הבאה.

3. הזמן פקיעה הדמיה חיה

הערה: אנו מבצעים ניסויים בהדמיה בזמן שימוש במיקרוסקופ מוקדי המצויד בלייזר רב-פוטון. יש לכוונן את פרמטרי הרכישה לצורך הגדרות דימות אחרות.

1. זיהוי מתקני המוח המכילים נוירונים המסומנים בנפרד באמצעות מטרה טבילה במים 40X (NA 1.3) ו מקור אור פלורסנט. עבור אוסף תמונות, השתמש בלייזר שני פוטון מכוון 920 ננומטר וגלאי שאינו מקובץ (NDD).
2. לאסוף תמונות ב 512 x 512 פיקסלים לכל מסגרת ו 1 דקות לכל Z-מחסנית עבור 10 דקות. כוונן את הזום האופטי והדיגיטלי כדי להשיג רזולוציה מספקת של x-y-Z תוך הקפדה על הכיסוי של הארבור הדנדריטים כולה בתוך 1 דקות (איור 2, וידאו משלים 1). ההגדרות יוצרות תמונות ברזולוציה של x-y-z טיפוסית של 0.11 x 0.11 x 0.25 יקרומטר³.
3. לאסוף את הזמן סדרת תמונה בתוך 30 דקות של קרע במוח. נתונים עם סחיפה מוגזמת או הידרדרות מורפולוגית ברורה צריך להיות מחוץ לעיבוד וכימות.

4. תיקון ופירוק הסחף

הערה: בהתאם לאיכות התמונה, שני השלבים הם אופציונליים אך מומלצים מאוד.

1. פתח קובץ תמונה שנרכש עם תוכנת תיקון סחיפה. ערוך פרמטרים מיקרוסקופיים כדי להתאים לאלה המשמשים לניסוי. עבור התוכנה (ראה טבלת חומרים), לחץ על עריכה | ערוך פרמטרים מיקרוסקופיים. קבע סוג מיקרוסקופ כשדה שטח עבור תמונות בשתי פוטון אם אין אפשרות לשני פוטונים ופעל בהתאם לזרימת העבודה המוגדרת על-ידי התוכנה. לדוגמה, פתח את הלשונית לפירוק | מייצב אובייקטובחר באפשרות ' ייצוב מסגרות זמן'.
2. פתח את התמונה מתוקנת להיסחף בתוכנה לפירוק ובצע את זרימת העבודה שלה. עבור התוכנה (ראה טבלת חומרים), בחר את התמונה הייצוב ולאחר מכן לחץ על פירוק | לפירוק האקספרס. כדי לקבל תוצאה טובה יותר, כוונן בצורה משופרת את הפרמטרים באמצעות אשף פירוק.
3. שמור את התמונה לפירוק בסוג קובץ הנתמך על ידי התוכנה ביאור תמונה הבאים מסוגל לנתח נתונים 4D ודיווח על קואורדינטות מרחבית של נקודות מוגדרות בתמונה (ראה טבלת חומרים).

5. ביאור תמונה

1. פתחו את התמונה לפירוק בתוכנת הביאור של התמונה. בדוק וסמן עצות בענף בכל נקודות הזמן ב-3D. תוכנת הביאור של התמונה מדווחת ומאחסנת את הקואורדינטות המרחבית והטמפורלית של תיאורי הענף המסומנים. יצא את מידע הקואורדינטות כקובץ. csv לצורך חישובים עוקבים.
   הערה: שני השלבים הבאים הם ספציפיים לתוכנת הביאור בה השתמשנו (ראה טבלת חומרים). ייתכן שזרימת העבודה שונה עבור תוכנות אחרות.
2. בתוך המודול ' נקודות ', לחץ על 'דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני' ובדוק את תיבת הסימון 'התחבר אוטומטית לספוט שנבחר' (איור 3א). עבור על המסגרות בסידרת הזמן ובחר ענף לביאור. החזק את המקש Shift ולחץ על קצה המסוף של ההסתעפות כדי להוסיף נקודה. לחץ על כל נקודות הזמן.
   הערה: תוכנת הביאור של התמונה מחברת בין הנקודות בין מסגרות ויוצרת מסלול באופן אוטומטי. המידע המרחבי והזמני של תיאורי הענף משויך כעת לנקודות מסומנות. חזור על שלבים אלה עד לקבלת כל תיאורי הסתעפות (איור 3ב).
3. בתוך המודול ' נקודות ', לחצו על הכרטיסייה ' סטטיסטיקה ', בחרו באפשרות ' מפורט ' ובחרו ערכים ספציפיים | . בעמדהשלך מידע הקואורדינטות המרחבי והזמני המוקלט יוצג. לחץ על שמור בתחתית כדי לייצא מידע זה כקובץ Csv (איור 3ג).

6. חישוב הענף הדנדריטים דינמיקה

הערה: באמצעות מידע הקואורדינטות, ניתן לחשב בקלות עקירה של עצות ההסתעפות ב-3D. במחקר שלנו, כל תנועות הענף הדנדריטי מסווגים כשלוחה או הנסיגה. השלבים שלהלן מתארים כיצד לעבד את קבצי ה-. csv באמצעות קבצי script מותאמים אישית של R (קובץ משלים) ועל-ידי הוספת המידע כווני באמצעות עריכה ידנית.

1. פתח את קובץ ה-. csv כגיליון אלקטרוני. בחרו בעמודת מזהה הרצועה , לחצו על האפשרות ' מיון קטן לגדול ביותר ' ולקבלת הרחבת הבחירה. לאחר המיון, מזהה הרצועה מזהה כל ענף דנדריטי ייחודי, וכתמים מאותו ענף חולקים את אותו מזהה רצועה. העמודה Time מאחסנת את המידע של מסגרות זמן שונות.
2. בגיליון האלקטרוני, הוסף עמודת מרחק . חשב את המרחק של כל שני כתמים סמוכים באופן זמני באמצעות נקודות הציון שלהם ולשים את הערכים בעמודה המרחק (איור 4א).
3. תנועות משניות ברמת voxel אחת. בהתבסס על הגדרות דימות, 0.3 יקרומטר הם בדרך כלל פריטים מתוך הביאור נסחף או ביאור תמונה לא מושלם. סנן תנועות אלה על-ידי איפוס ערכי המרחק הקטנים מ-0.3 יקרומטר ל-0. עבד קבצי. csv מרובים באופן ידני או השתמש בסינון עמודת ה-script של האצווה שלנו. R (קובץ משלים).
4. צור באופן ידני עמודה חדשה בשם הזחה בגיליון האלקטרוני. העתק את הערכים מעמודת המרחק לעמודה הזחה . הקצה באופן ידני את אירועי ההרחבה והנסיגה עבור כל קצה ענף. אם זוהי הארכה, השאר את ערך ההזחה ללא שינוי, שהוא ערך חיובי. אם זוהי הכחשה, שנה את ערך ההזחה המתאים לערך שלילי (לדוגמה, 0.35 to-0.35) (איור 4ב).
5. צור עמודה חדשה בשם אירוע. בעמודה זו, סכם באופן ידני את ערכי ההזחה עבור אירועי הארכה והנסיגה הבודדים (איור 4ב).
6. לעבד את הגיליון האלקטרוני שהשתנה ולכמת את הסיומת ואת אירועי הנסיגה בהתבסס על ערכי התזוזה שלהם באמצעות סיכום העמודה של האצווה הסקריפט. R (קובץ משלים). פרמטרי הפלט כוללים את מספר אירועי ההרחבה, מספר אירועי הנסיגה, אורך מצטבר מורחב, אורך מצטברושוב, אורך נטו השתנה, ואורך כולל נסע .

תוצאות

באמצעות פרוטוקול הדמיה חיה המתואר לעיל, אנו ללכוד ערימות תמונה ברזולוציה גבוהה עבור ניתוחים וכימות הבאים. וידאו משלים 1 מראה את העוצמה המקסימלית מוקרן (mip) סדרת תמונה שנאסף נציג באופן אינדיבידואלי המסומן Lnv. איור 2B מציג את המיזוג המקביל ש...

Discussion

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפיתחנו כדי להקליט ולכמת את ההתנהגות הדינמית של ענפים דנדריטים באופן אינדיבידואלי התווית נוירונים במוח זחל דרוסופילה . בעיקר, פרוטוקול ההדמיה החי שלנו מכיל פרמטרים ספציפיים שמאפשרים לנו ללכוד את כל הארבור הדנדריטי של זחל החוצה ולספק תצוגה גלובלית של המצב הד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chameleon Vision II multiphoton laser	Coherent
High vacuum grease	Dow Corning	79751-30
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope	Carl Zeiss		upright configuration
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Software
Excel	Microsoft		for processing .csv files
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	for drift correction and deconvolution
Imaris	Oxford Instruments		for 3D visualization and image annotation
Reagents
Glucose
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Sucrose
TES