Временной live Imaging и количественной быстрой динамики дендритной ветви в разработке дрозофилнейронов

Резюме

Здесь мы описываем метод, который мы использовали для изображения высокоподвижной дендритной филоподии в живой подготовке личиночного мозга Дрозофилы, и протокол, который мы разработали для количественной оценки наборов данных 3D-изображений для количественных оценок дендрита динамики в развивающихся нейронах.

Аннотация

Высокоподвижной дендритной филоподии широко присутствуют в нейронах на ранних стадиях развития. Эти исследовательские динамические ветви пробуйте окружающую среду и инициируют контакты с потенциальными синаптическими партнерами. Хотя связь между дендритной динамикой ветви и синаптогенезом хорошо известна, то как процессы, зависящие от развития и активности, регулируют динамику дендритных ветвей, не очень хорошо поняты. Отчасти это объясняется техническими трудностями, связанными с живой визуализацией и количественным анализом этих тонких структур с использованием системы in vivo. Мы создали метод для изучения динамики дендрита с использованием drosophila личинки ventral боковые нейроны (LNvs), которые могут быть индивидуально помечены с использованием генетических подходов и доступны для живой визуализации. Воспользовавшись этой системой, мы разработали протоколы для захвата отраслевой динамики всей дендритной беседки одной помеченной LNv с помощью замедленной живой визуализации. Затем мы выполнили пост-обработку для улучшения качества изображения за счет коррекции дрейфа и деконволуциации, а затем анализировали динамику филиалов на уровне одной ветви, аннотируя пространственные позиции всех ветвей терминалов. Наконец, мы разработали R-скрипты(дополнительный файл)и конкретные параметры для количественной оценки динамики ветвей с использованием информации о координатах, генерируемой трассировкой терминала. В совокупности этот протокол позволяет нам достичь детального количественного описания отраслевой динамики нейрональной дендритной беседки с высоким временным и пространственным разрешением. Методы, которые мы разработали, как правило, применимы к редко помечены нейронов как в пробирке и в условиях vivo.

Введение

Дендриты являются специализированными нейронными отсеками, которые принимают и обрабатывают сенсорный и синаптический вход. Сложная и стереотипная структура дендритных беседок с момента их обнаружения подвергалась интенсивному исследованию. Ряд типовых систем, в том числе Xenopus оптических тектальных нейронов, цыпленка клетки ганглия, и дендритной беседки (да) нейронов в системе Drosophila, были созданы для изучения развития, реконструкции и пластичности нейронные дендриты^1,2,3,4. Drosophila ventral боковые нейроны (LNvs) представляют собой группу визуальных нейронов проекции первоначально определены для их важных функций в циркадной регуляции летать поведения⁵. Исследования также показали роль личинок LNvs в качестве прямой postsynaptic цель личинок фоторецепторов (PRs)^6,7. Важно отметить, что культивирование развивающихся личинок в различных световых режимах сильно влияет на размер дендритных беседок LNvs, демонстрируя пригодность LNvs как новой модели для изучения дендритной пластичности⁷. Последние работы нашей группы также указывает на то, что как размер lNv дендрита и динамическое поведение дендритных ветвей отображают опыт-зависимую пластичность^8,9. В рамках этой работы мы разработали новый живой протокол визуализации и количественной оценки для проведения анализа динамики дендрита LNvs от^2-го или^3-го инстаровых личинок.

Прозрачный характер личиночного мозга Дрозофилы делает его идеальным для живой визуализации. Тем не менее, дендритные беседки LNvs расположены в плотно иннервированных личиночной оптической нейропил (LON) в центре личинки доли мозга⁶. Для захвата изображений тонких ветвей дендритов и филоподии в нетронутой ткани мозга, мы используем двухфотонную микроскопию, которая увеличивает глубину проникновения света и снижает фототоксичность во время живых экспериментов изображений¹⁰. Используя эту установку, мы успешно провели живые эксперименты изображения на LNvs в течение более 30 минут, не наблюдая очевидного морфологического ухудшения нейрона. Кроме того, генетические манипуляции с использованием flip-out техники позволили нам маркировать отдельные LNvs с мембраной помечены GFP, который также имеет решающее значение для мониторинга движений отдельных ветвей^11,12,13 .

Чтобы зафиксировать динамичное поведение всех ветвей на дендритной беседке LNv с оптимальным оптическим разрешением, мы выполнили замедленное 3D-изображение на свежерассеченных личиночных вылазках мозга с высоким пространственным разрешением при 1 мин на рамку в течение 10-30 мин. Разработка LNv дендриты очень динамичны, при этом большой процент ветвей отображает наблюдаемые изменения в окне 10 мин. Это приводит к одной из основных технических задач в изучении динамики дендрита, количественной оценке поведения ветвей на основе наборов данных 4D-изображений. Ранее установленные методы имеют различные ограничения, включая отсутствие точности и чрезмерные временные требования. Поэтому мы разработали полуавтоматический метод, который сочетает в себе изображение после обработки, ручная маркировка ветвей терминалов и автоматическое отслеживание 4D-точек с помощью программного обеспечения для аннотации изображений. Мы вычисляем движения ветвей терминалов в разных точках времени на основе 3D-координат пятен. Затем данные экспортируются и анализируются для получения количественных измерений динамики отрасли. Этот метод точно оценивает продолжительность и масштабы расширения и опрокидки событий существующих ветвей, а также формирование новых ветвей, что позволяет отслеживать динамику дендрита в большом количестве нейронов.

протокол

ПРЕДЕКТО: Этот протокол включает в себя использование лазеров класса IV и потребует надлежащей подготовки и безопасности руководящих принципов, которые должны соблюдаться. Избегайте воздействия прямого или рассеянного лазерного света на глаза или кожу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол включает в себя шесть шагов. Рабочий процесс отображается на рисунке 1A.

1. Маркировка отдельных нейронов с использованием Flip-аут Техника

ПРИМЕЧАНИЕ: Единая маркировка LNvs достигается путем выражения mCD8::GFP в одном LNvs с использованием flippase-опосредошной стохастической маркировки. Генотип линии мухи: hs-flp; Pdf-Gal4; UAS-FRT-CD2-стоп-FRT-mCD8::GFP^11,12,13. Частота получения одной маркированной LNv составляет около 10%. Запасы мухи поддерживаются в стандартной среде в циркадных и влажных инкубаторах с контролем 25 градусов по Цельсию.

1. Соберите 100-200 яиц в течение 2 ч оконного после оплодотворения на тарелке виноградного сока с дрожжевой добавкой. Инкубировать эмбрионы при 25 градусах по Цельсию в течение 24 ч и собирать недавно вылупившихся первых личинок instar для следующего шага.
2. Теплошок вновь вылупились первые личинки instar на 37,5 градусов по Цельсию в течение 40 минут в два раза, с 40 мин периода восстановления между ними.
3. Культура личинок при 25 градусах Цельсия с циркадным и контролем влажности до желаемой стадии развития (ы).

2. Рассекать и монтаж Larval мозг explants

1. Рассекать личиночные мозги в физиологическом внешнем солей (120 мм NaCl, 4 мМ MgCl₂, 3 мМ KCl, 10 мм NaHCO₃, 10 мм Глюкоза, 10 мм сахароза, 5 мМ TES, 10 мм HEPES, 2 мМ Ca^{2 ",}PH 7.2) под дисесарико (4,5 х х magn мощность) с двумя парами #5 стандартных щипцированных наконечников (11 см). Используйте одну пару щипц для удержания личиночного тела на месте, а другой, чтобы тщательно вскрыть мозг. Сохранить глазные диски, доли мозга и брюшной нервный шнур. Удалите прикрепленные мышцы, чтобы свести к минимуму движения образцов во время визуализации.
2. Подготовьте стеклянную горку (25 x 75 x 1,0 мм³⁾и используйте шприц, чтобы нарисовать квадратную камеру с вакуумной смазкой.
3. Добавьте 20 зл внешнего сосудистого раствора в квадратную камеру с барьерами смазки.
4. Передача расчлененных личинок мозга в камеру на стеклянной горке с помощью щипцы. Отрегулируйте положение мозгов под областью вскрытия, чтобы обеспечить сторону дона.
5. Накройте камеру стеклом (22 x 22 x 0,15 мм^3). Личительный мозг теперь установлен на слайде в камере, наполненной внешним сольственный раствор(рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкое нажатие на крышку ограничивает мозг и уменьшает дрейфующий образец в последующем сеансе визуализации.

3. Покадровая живая визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы проводим эксперименты по визуализации покадровой работы с помощью конфокального микроскопа, оснащенного мультифотонным лазером. Параметры приобретения должны быть скорректированы для других насевий.

1. Определите экзатсы мозга, содержащие индивидуально помеченные нейроны, используя цель погружения воды 40X (NA 1.3) и эпифлуоресцентный источник света. Для сбора изображений используйте двухфотонный лазер, настроенный на 920 нм, и недесканированный (NDD) детектор.
2. Сбор изображений на 512 х 512 пикселей на кадр и 1 мин на 1-стек в течение 10 минут. Отрегулируйте оптический и цифровой зум для достижения достаточного разрешения x-y-z, обеспечивая при этом покрытие всей дендритной беседки в течение 1 мин (Рисунок 2, Дополнительное видео 1). Настройки генерируют изображения с типичным разрешением x-y-z 0.11 x 0.11 x 0.25 мкм³.
3. Соберите промежуток времени серии изображений в течение 30 минут от вскрытия мозга. Данные с чрезмерным дрейфом или очевидным морфологическим ухудшением должны быть исключены из постобработки и количественной оценки.

4. Коррекция дрейфа и деконволюция

ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от качества изображения, оба шага являются необязательными, но настоятельно рекомендуется.

1. Откройте приобретенный файл изображения с помощью программного обеспечения коррекции дрейфа. Отобразите микроскопические параметры в соответствии с теми, которые использовались для эксперимента. Для программного обеспечения (см. Таблица материалов),нажмите Edit Отобразить микроскопические параметры. Установите тип микроскопа как широкое поле для двухфотонных изображений, если нет двухфотонный вариант и следуйте рабочему процессу, определенному программным обеспечением. Например, откройте вкладку Deconvolution Объект Стабилизатор, и выбрать Стабилизировать временные рамки.
2. Откройте исправленное изображение в программном обеспечении деконволюции и следуйте его рабочему процессу. Для программного обеспечения (см. Таблицу Материалов),выберите стабилизированное изображение, а затем нажмите Deconvolution Деконволюция Экспресс. Чтобы получить лучший результат, отточить параметры с помощью Deconvolution Wizard.
3. Сохранить деконволведное изображение в типе файла, который поддерживается последующим программным обеспечением аннотации изображений, способным анализировать 4D данные и сообщать о пространственных координатах определенных пятен на изображении (см. Таблицу Материалов).

5. Аннотация изображения

1. Откройте деконволведное изображение в программном обеспечении аннотации изображений. Изучите и отметьте ветви советы во все моменты 3D. Программное обеспечение аннотации изображения сообщает и хранит пространственные и временные координаты отмеченных наконечников ветвей. Экспорт информации о координатах в виде файла .csv для последующих вычислений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие два шага специфичны для используемого программного обеспечения для аннотации (см. таблицу материалов). Рабочий процесс может отличаться для другого программного обеспечения.
2. В модуле Spots нажмитекнопку «Пропустить автоматическое творение, отобрадите вручную»и проверьте дно «Авто-подключайтесь к выбранному чекбоксу Spot»(рисунок 3A). Перейдите кадры в серии таймеров и выберите ветку для аннотации. Держите клавишу Shift и щелкните наконечником ветки терминала, чтобы добавить место. Нажмите через все точки времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для аннотации изображения соединяет пятна между кадрами и автоматически генерирует траекторию. Пространственная и временная информация о наконечниках ветви теперь ассоциируется с отмеченными пятнами. Повторите эти шаги до тех пор, пока все ветви советы аннотированы(Рисунок 3B).
3. В модуле Spots щелкните вкладку Статистика, выберите подробные и выберите конкретные значения Позиция. Записанная информация о пространственных и временных координатах будет отображаться. Нажмите Сохранить дно экспортировать эту информацию в виде файла .csv(Рисунок 3C).

6. Расчет динамики дендритной ветви

ПРИМЕЧАНИЕ: Используя информацию о координатах, можно легко рассчитать смещение наконечников ветки в 3D. В нашем исследовании все дендритные движения ветви классифицируются как расширение или опрокидываемый. Приведенные ниже шаги описывают, как обрабатывать файлы .csv с помощью пользовательских R-скриптов(Дополнительный файл)и путем добавления направленной информации с помощью ручного редактирования.

1. Откройте файл .csv в виде электронной таблицы. Выберите столбец Track ID, щелкните Sort Smallest to Largest и примите расширение выбора. После сортировки Track ID идентифицирует каждую уникальную дендритную ветвь, а пятна из одной и той же ветви имеют один и тот же идентификатор Track ID. Колонка Time хранит информацию о различных временных рамках.
2. В таблицу добавьте столбец Расстояния. Рассчитайте расстояние каждых двух временно прилегающих пятен, используя их координаты, и поместите значения в столбец Расстояния (рисунок 4A).
3. Незначительные движения на уровне одного вокселя. Основываясь на настройках изображения, 0,3 мкм, как правило, артефакты из неисправленных дрейфующих или несовершенных аннотации изображения. Отфильтруйте эти движения, сбросив все значения расстояния меньше 0,3 мкм до 0. Обработка нескольких файлов .csv вручную или использовать нашу r-скриптовый пакетный столбец фильтрации. R (Дополнительный файл).
4. Вручную создайте новый столбец под названием Перемещение в таблице. Копирование значений от столбца расстояния до столбца смещения. Вручную назначаем события расширения и опровержения для каждой кончики ветки. Если это расширение, оставьте значение Перемещения без изменений, что является положительным значением. Если это опровержение, измените соответствующее значение Перемещения на отрицательное значение (например, от 0,35 до -0,35)(рисунок 4B).
5. Создание нового столбца под названием Событие. В этой колонке вручную суммируют значения перемещения для отдельных событий расширения и опровержения(рисунок 4B).
6. Обработка измененной таблицы и количественное обоснование событий расширения и опровержения на основе значений их перемещения с использованием суммы пакетного столбца R-скрипта. R (Дополнительный файл). Параметры вывода включают Количество событий расширения, Количество событий опровержения, Суммарная длина расширена, Совокупная длина убраны, Чистая длина изменена,и общая длина путешествовала .

Результаты

Используя описанный выше протокол живого изображения, мы фиксирует стеки изображений с высоким разрешением для последующего анализа и количественной оценки. Дополнительное видео 1 показывает максимальную интенсивность проецируемой (MIP) серии изображений, с...

Обсуждение

Здесь мы описываем протокол, разработанный нами для записи и количественной оценки динамического поведения дендритных ветвей в индивидуально помеченных нейронах в личинках дрозофилов. Примечательно, что наш живой протокол визуализации содержит специфические параметры, которые...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chameleon Vision II multiphoton laser	Coherent
High vacuum grease	Dow Corning	79751-30
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope	Carl Zeiss		upright configuration
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Software
Excel	Microsoft		for processing .csv files
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	for drift correction and deconvolution
Imaris	Oxford Instruments		for 3D visualization and image annotation
Reagents
Glucose
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Sucrose
TES