Un método autodirigido estático para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas

Resumen

Este protocolo se generó como un medio para producir organoides cerebrales de una manera simplificada y de bajo costo sin factores de crecimiento exógenos o matriz de membrana de sótano sin dejar de mantener la diversidad de tipos de células cerebrales y muchas características de la organización celular.

Resumen

Los organoides cerebrales humanos diferenciados de las células madre embrionarias ofrecen la oportunidad única de estudiar interacciones complicadas de múltiples tipos de células en un sistema tridimensional. Aquí presentamos un método relativamente sencillo y barato que produce organoides cerebrales. En este protocolo las células madre pluripotentes humanas se dividen en pequeños racimos en lugar de células individuales y se cultivan en medios básicos sin una matriz de membrana de sótano hetróloga o factores de crecimiento exógenos, lo que permite que las señales intrínsecas de desarrollo crecimiento del organoide. Este sistema simple produce una diversidad de tipos de células cerebrales incluyendo células gliales y microgliales, células madre y neuronas del cerebro forebrain, cerebro medio y cerebro trasero. Los organoides generados a partir de este protocolo también muestran señas de identidad de una organización temporal y espacial adecuada demostrada por imágenes de campo brillante, histología, inmunofluorescencia y reacción en cadena cuantitativa de transcripción inversa en tiempo real ( qRT-PCR). Debido a que estos organoides contienen tipos celulares de varias partes del cerebro, se pueden utilizar para estudiar una multitud de enfermedades. Por ejemplo, en un artículo reciente demostramos el uso de organoides generados a partir de este protocolo para estudiar los efectos de la hipoxia en el cerebro humano. Este enfoque se puede utilizar para investigar una serie de condiciones difíciles de estudiar, como discapacidades del neurodesarrollo, trastornos genéticos y enfermedades neurológicas.

Introducción

Debido a innumerables limitaciones prácticas y éticas, ha habido una gran dificultad en el estudio del cerebro humano. Mientras que los estudios que utilizan roedores han sido críticos para nuestra comprensión del cerebro humano, el cerebro del ratón tiene muchas diferencias^1,2. Curiosamente, los ratones tienen una densidad neuronal que es al menos 7 veces menor que el cerebro de primate^3,4. Aunque los primates están más cerca de los seres humanos que los roedores desde un punto de vista evolutivo, no es práctico para la mayoría de los investigadores trabajar con ellos. El propósito de este protocolo era recapitular muchas características importantes del cerebro humano usando un método simplificado y menos costoso sin la necesidad de una matriz de membrana de sótano hetróloga o factores de crecimiento exógenos mientras se mantiene la diversidad de células cerebrales y la organización celular.

El trabajo formativo del laboratorio Sasai utilizó el método de cultivo libre de suero de cuerpos embrionarios (SFEBq) para generar tipos de células neuronales bidimensionales y tridimensionales a partir de células madre embrionarias señaladas (ESC)^5,6. Muchos métodos organoides del cerebro humano han seguido un camino relativamente similar de esCs 8^señalizado. Por el contrario, este protocolo comienza con grupos de ESC sinfunciones humanas (HESC), similares a los pasos iniciales del trabajo seminal de los laboratorios Thomson y Zhang antes de los pasos^9,10, así como el paso inicial del protocolo organoide cerebral del laboratorio Pasca antes de la adición de factores de crecimiento exógenos^11. Las matrices de membranas de sótano (por ejemplo, matrigel) se han utilizado en muchos protocolos de organoides cerebrales y se ha demostrado que es un andamio eficaz⁸. Sin embargo, las matrices de membrana de sótano más utilizadas no vienen sin complicaciones, ya que co-purifican con cantidades desconocidas de factores de crecimiento con la variabilidad lote a lote durante la producción¹². Además, estas matrices pueden complicar la toma de imágenes y aumentar el riesgo de contaminación y costo.

Mientras que los organoides del cerebro humano se pueden utilizar para responder a muchas preguntas, hay ciertas limitaciones a tener en cuenta. Por un lado, a partir de las células madre embrionarias, los organoides se asemejan más a los cerebros inmaduros que los cerebros envejecidos y, como tal, pueden no ser modelos ideales para enfermedades que ocurren en la vejez, como la enfermedad de Alzheimer. En segundo lugar, mientras que nuestro protocolo encontró marcadores de desarrollo de cerebro súbdito, cerebro medio y cerebro trasero que son útiles para estudiar el efecto de un tratamiento o enfermedad en las células de múltiples regiones cerebrales en concierto, otros protocolos se pueden seguir para concentrarse en regiones cerebrales específicas^13,14. Finalmente, otra limitación de los modelos organoides es la del tamaño, mientras que la longitud media de un cerebro humano de aproximadamente 167 mm, organoides cerebrales hechos con el uso de agitación crecen hasta 4 mm⁸ y los organoides formados por este protocolo crecen a 1-2 mm por 10 semanas. Sin embargo, este protocolo proporciona una herramienta importante para estudiar el tejido cerebral humano y la interacción de múltiples tipos de células.

Protocolo

1. Mantenimiento de células madre

1. Mantener H9 hESCs en una capa de factor de crecimiento reducido matriz de membrana sótano (ver la Tabla de Materiales, a partir de ahora simplemente se conoce como matriz) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Para recubrir un plato de 6 pocillos o un plato de 10 cm, combine 100 ml de matriz con 5,9 ml de medio Eagle modificado (DMEM) /F12 modificado de Dulbecco en frío. Envuelva las placas en una película de parafina y guárdelas durante la noche a 4oC. Utilícelos al día siguiente para pasar las células después de que se aspira el exceso de matriz/medios.
2. Cultivo de las células semana a semana en aproximadamente una proporción de división de 1:12 cada 7 días. Mantener las células usando medios mTESR-1 en una incubadora de oxígeno baja de 37oC (5% O₂, 5% CO₂). Actualizar los medios todos los días. Deshierba las células diferenciadoras del cultivo entre pasajes utilizando herramientas de vidrio.
3. Las células H9 deben ser pasajes de cuatro a seis días antes de utilizarlas para producir organoides. Las celdas deben ser pasajes en aproximadamente una proporción de 1:8 de los racimos de células. Para ello, comience por enjuagar las células con medios DMEM F12 y disociar las células con una proteasa neutra (por ejemplo, dispensar, en adelante, simplemente como proteasa), enjuagar con DMEM/F-12 y placa como 30-60 racimos de células a través de 4 placas (6-bien o 10 cm) a 20% de confluencia. Dos días antes de la cosecha, transición a una incubadora regular (21% O₂, 5% CO₂). Las placas deben alcanzar una confluencia del 80 % al iniciar la formación de organoides.

2. Disociación de los hESC para la cultura organoidea

1. Aliquot la solución de stock de proteasa (5 U/mL).
   NOTA: Normalmente congelamos 1 mL alícuotas a -20 oC para su uso durante varios meses.
2. Diluir la solución de material de proteasa a la concentración de trabajo añadiendo 1 ml de la solución de stock más 5 ml de DMEM/F12 para cada placa de 6 pocillos o 10 cm de HESC.
3. Aspirar y eliminar los medios de cultivo celular, luego cubrir los hESC con la solución de proteasa. Coloque las placas en la incubadora durante 10-15 min o hasta que los bordes de las colonias se redondeen y comiencen a separarse de la matriz.
4. Incline la placa, aspire la solución de proteasa y lave suavemente las células con DMEM/F12 tres veces. Utilice 2 ml/bien para cada lavado cuando utilice una placa de 6 pocillos y 6 ml cuando utilice una placa de 10 cm. Asegúrese de que las colonias permanezcan unidas a la matriz al realizar este paso.
5. Agregue de nuevo alrededor de 1,5 ml de medios mTESR frescos a cada pocata (o 5 ml para una placa de 10 cm) y enjuague las células de la placa con un pipeteo suave.
6. Con una pipeta de 10 ml, aspirar suavemente y dispensar hESC dentro de la placa hasta que alcancen aproximadamente 1/30^th de su tamaño original. Los racimos de colonias deben asemejarse a cuadrados de tamaño de 250-350 m al completar estos pasos.

3. Generación de organoides

1. Transfiera las células en un solo matraz T75 de unión ultrabajo que contenga 30 ml de medios mTESR sin factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF).
2. Al día siguiente, incline los matraz(s) de tal manera que las celdas vivas se ahogen en la esquina (esto puede tomar 5-10 minutos en el primer día, pero se volverá más rápido a medida que los racimos se hacen más grandes).
   NOTA: Si hay un gran número de células que se han adherido a la parte inferior del matraz en este paso o en cualquier paso posterior, transfiera las celdas a un matraz nuevo. Es normal tener una población alta de células muertas durante los primeros dos días. Al realizar cambios en los medios, asegúrese de eliminar la mayor cantidad posible de residuos celulares.
3. Una vez que las células se asientan, aspirar fuera de los medios y las células muertas dejando alrededor de 10 mL de medios que contienen las células vivas.
4. Añadir 20 ml de medios bajos de bFGF (DMEM/F12 complementados con 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamina, 1x NEAA, 0.05% albúmina sérica bovina (BSA), y 0,1 mM de monotioglicerol (MTG) complementado con 30 ng/mL bFGF).
5. Revise las celdas en el día 2. Si la mayoría de las células se ven sanas y brillantes, no hay necesidad de hacer nada. Sin embargo, si más de un tercio de las células aparecen oscuras, sustituya el medio (utilizando la misma técnica de inclinación que en el paso 3.2) por 20 ml de medio de bFGF bajo complementado con 20 ng/mL bFGF.
6. En el día 3, reemplace la mitad de los medios (utilizando la técnica de inclinación en el paso 3.2) por 20 ml de medios bajos de bFGF complementados con 10 ng/mL bFGF.
7. En el día 5, reemplace la mitad del medio (utilizando la técnica de inclinación en el paso 3.2) por 20 ml de medios de inducción neuronal (NIM: DMEM/F12, 1x N2 suplemento, 0,1 mM MEM NEAA, 2 g/ml de heparina).
   NOTA: Si hay grupos grandes de células u organoides que son mucho más grandes que los demás, deben eliminarse de la referencia cultural. El tamaño se estima por apariencia bajo el microscopio; por ejemplo, utilizando un ocular con retícula. La mayoría de los organoides tienen un tamaño similar (aproximadamente 100 x 20 m). Eliminamos organoides que eran aproximadamente 2 veces más pequeños o más grandes que los demás.
8. Sustituya la mitad del medio (15 ml) (utilizando la técnica de inclinación) por NIM cada dos días.
9. Después de 3 semanas en cultivo, añadir 100x penicilina/estreptomicina a los medios (NIM: DMEM/F12, 1x N2 suplemento, 0,1 mM MEM NEAA, 2 g/ml de heparina) a una concentración final de 1x si se desea. Actualice los medios cada dos días.
   NOTA: De esta manera, mantuvimos los organoides hasta por 6 meses en cultivo.

4. Extracción y preparación de ARN

1. Extraiga suavemente aproximadamente 15 organoides (dependiendo del tamaño) del matraz utilizando una pipeta de 10 ml y colóquelos en un tubo de 1,5 ml.
   1. Peletizar suavemente los organoides en la centrífuga (200 x g durante 1 min), y enjuagar con 1x PBS de Dulbecco (DPBS) tres veces.
2. Extraiga el ARN utilizando el sistema o protocolo validado (por ejemplo, el kit RNeasy).
3. Mida el valor de densidad óptica de cada muestra a 260 y 280 nm.
4. Prepare el ADNc utilizando un sistema o protocolo validado (por ejemplo, un kit de síntesis de ADNc iScript).
5. Realice qRT-PCR utilizando imprimaciones prevalidadas (Tabla 1), incluyendo al menos un gen de limpieza.

5. Inmunohistoquímica

1. Fijación
   1. Preparar una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% y colocarla a 4 oC.
   2. Con una maquinilla de afeitar estéril, corte la punta de una pipeta de transferencia estéril.
   3. Extraiga suavemente los organoides con la pipeta de transferencia de corte, ya que se pueden separar fácilmente, especialmente cuando crecen grandes, y colóquelos en una placa de 6 pocillos con medios adicionales o DPBS.
   4. Incline la placa, aspire el soporte y sustitúyala por 1x DPBS. Enjuague las células con 1 dPBS dos veces más.
   5. Sustituya el DPBS por una solución de PFA al 4% y colóquela en una coctelera a 4 oC.
      NOTA: Si bien fijamos durante 2 días (para organoides pequeños) a 7 días (para organoides >3 meses), tiempos más cortos (por ejemplo, 16-24 h) también pueden ser posibles.
   6. Prepare soluciones de sacarosa del 30%, 20% y 10% en DPBS.
   7. Después de la fijación en PFA, reemplazar con la solución de sacarosa 10% y colocar en una coctelera a 4 oC durante 24 h.
   8. Sustituya la sacarosa del 10% con un 20% de sacarosa y colóquela en una coctelera a 4oC durante 24 h.
   9. Sustituya la sacarosa del 20% con un 30% de sacarosa y colóquela en una coctelera a 4oC durante 24 h.
2. Secciones congeladas
   1. Prepare una capa plana de hielo seco y coloque un molde de plástico etiquetado encima de él.
   2. Vierta una capa delgada de medio de temperatura de corte óptimo (OCT) en el molde y deje que comience a endurecerse (en pocos segundos).
   3. Coloque algunos organoides en la parte superior del Oct en el molde usando una pipeta de transferencia con la punta cortada y preste mucha atención a la ubicación de los organoides.
   4. Añadir lentamente en OCT hasta que el molde esté lleno y los organoides estén cubiertos. Dejar que se endurezque por completo durante 10 minutos adicionales.
      NOTA: Mientras que la congelación de más de 10 minutos ayuda a garantizar la colocación relativa ideal de múltiples organoides para la sección, es posible utilizar una mezcla de hielo seca de etanol o nitrógeno líquido para congelar más rápidamente.
   5. Marque la ubicación relativa de los organoides con un marcador para que sea más fácil encontrarlos al cortarlos.
   6. Colocar los moldes en una bolsa o caja y almacenar a -80 oC hasta que estén listos para cortar las secciones.
   7. Usando un criostato, corte secciones de 10 m y coloque el tejido en diapositivas etiquetadas y cargadas positivamente.
3. Tinción
   1. Preparar la solución de bloqueo (0,3% Triton X-100, 4% de suero de burro normal en PBS).
   2. Utilice una pluma de papanicolaou hidrófoba para dibujar alrededor del perímetro del tejido.
   3. Enjuague las diapositivas con PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.
   4. Sustituya PBS por una solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente.
   5. Sustituya la solución de bloqueo por una solución de anticuerpos (anticuerpo a la concentración adecuada, 0,1% Triton X-100, 4% de suero de burro normal en PBS) a 4 oC durante la noche.
   6. Al día siguiente, lave el portaobjetos 3 veces con PBS durante 10 minutos cada uno.
   7. Sustituya pbS por el anticuerpo secundario adecuado (a la concentración adecuada) diluido en solución de anticuerpos durante 1 h a temperatura ambiente.
   8. Enjuague 3 veces durante 10 minutos cada vez con 1 x PBS.
   9. Aplique la mancha de 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y enjuague tres veces durante 10 min cada una con 1x PBS.
   10. Fije los cubreobjetos en la parte delantera de los portaobjetos con solución de montaje, deje secar a temperatura ambiente en la oscuridad y guárdelos en la oscuridad a 4 oC.

Resultados

La Figura 1 muestra imágenes representativas de campo brillante de varios puntos de tiempo para demostrar cómo se ven las células/organoides a lo largo de las diferentes etapas del protocolo. Los hESC se extraían de la placa de cultivo de tejido, se dividieron en trozos pequeños y se colocaron en un matraz de fijación ultrabajo T75 donde formaron esferas. Es importante tener en cuenta que las células se ven brillantes y similares en tamaño, sin células oscuras y moribundas en los ce...

Discusión

Al igual que otros modelos de organoides, este es un sistema artificial que viene con varias advertencias. Aunque había poca variación de lote a lote en términos de niveles generales de expresión, los organoides individuales mostraban diferencias. Por ejemplo, la ubicación de las áreas positivas de Sox-2 no era idéntica en todos los organoides(Figura 3). Mientras que qPCR es adecuado para buscar cambios generales en lotes de células, técnicas adicionales como RNAseq de una sola célula se utiliz...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814