Eine statische selbstgesteuerte Methode zur Generierung von Hirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll wurde als Mittel zur Herstellung von Gehirnorganoiden in einer vereinfachten, kostengünstigen Weise ohne exogene Wachstumsfaktoren oder Kellermembranmatrix unter Beibehaltung der Vielfalt der Gehirnzelltypen und vieler Merkmale der zellulären Organisation erzeugt.

Zusammenfassung

Organoide des menschlichen Gehirns, die sich von embryonalen Stammzellen unterscheiden, bieten die einzigartige Möglichkeit, komplizierte Wechselwirkungen mehrerer Zelltypen in einem dreidimensionalen System zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine relativ einfache und kostengünstige Methode, die Hirnorganoide ergibt. In diesem Protokoll werden menschliche pluripotente Stammzellen in kleine Cluster anstelle von Einzelzellen aufgebrochen und in Basismedien ohne heterologe Kellermembranmatrix oder exogene Wachstumsfaktoren angebaut, so dass die intrinsischen Entwicklungshinweise die Organoidwachstum. Dieses einfache System produziert eine Vielzahl von Gehirnzelltypen, einschließlich Glia- und Mikrogliazellen, Stammzellen und Neuronen des Vorderhirns, des Mittelhirns und des Hinterhirns. Organoide, die aus diesem Protokoll generiert werden, zeigen auch Merkmale einer angemessenen zeitlichen und räumlichen Organisation, die durch Hellfeldbilder, Histologie, Immunfluoreszenz und quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit demonstriert wird ( qRT-PCR). Da diese Organoide Zelltypen aus verschiedenen Teilen des Gehirns enthalten, können sie für das Studium einer Vielzahl von Krankheiten verwendet werden. Zum Beispiel haben wir in einem kürzlich erschienenen Papier die Verwendung von Organoiden demonstriert, die aus diesem Protokoll für die Untersuchung der Auswirkungen von Hypoxie auf das menschliche Gehirn generiert wurden. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um eine Reihe von ansonsten schwer zu untersuchenden Bedingungen wie neuroentwicklungsbedingten Handicaps, genetischestörungen und neurologischen Erkrankungen zu untersuchen.

Einleitung

Aufgrund unzähliger praktischer und ethischer Einschränkungen gab es große Schwierigkeiten, das menschliche Gehirn zu studieren. Während Studien mit Nagetieren waren entscheidend für unser Verständnis des menschlichen Gehirns, die Maus Gehirn hat viele Unterschiede^1,2. Interessanterweise haben Mäuse eine neuronale Dichte, die mindestens 7 mal kleiner ist als das Primatenhirn^3,4. Obwohl Primaten dem Menschen aus evolutionärer Sicht näher sind als Nagetiere, ist es für die meisten Forscher nicht praktikabel, mit ihnen zu arbeiten. Der Zweck dieses Protokolls war es, viele wichtige Merkmale des menschlichen Gehirns mit einer vereinfachten und kostengünstigeren Methode zu rekapitulieren, ohne dass eine heterologe Kellermembranmatrix oder exogene Wachstumsfaktoren erforderlich sind, während die Vielfalt der Gehirnzellen und die zelluläre Organisation erhalten bleiben.

Die formative Arbeit des Sasai-Labors verwendete die serumfreie Kultur der embryoiden Körper (SFEBq) Methode, um zwei- und dreidimensionale neuronale Zelltypen aus signalisierten embryonalen Stammzellen (ESCs) zu erzeugen^5,6. Viele organoide Methoden des menschlichen Gehirns haben einen relativ ähnlichen Weg von signalisierten ESCs^7,8verfolgt. Im Gegensatz dazu beginnt dieses Protokoll mit Clustern von abgetrennten menschlichen ESCs (hESCs), ähnlich den ersten Schritten der bahnbrechenden Arbeit der Laboratorien Thomson und Zhang vor den Beschichtungsschritten^9,10 sowie dem ersten Schritt des Hirnorganoidprotokolls des Pasca-Labors vor der Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren¹¹. Kellermembranmatrizen (z.B. Matrigel) wurden in vielen Organoidprotokollen des Gehirns verwendet und es hat sich als ein effektives Gerüst⁸gezeigt. Jedoch, am häufigsten verwendete Keller Membranmatrizen kommen nicht ohne Komplikationen, da sie mit unbekannten Mengen von Wachstumsfaktoren mit Charge zu Charge Variabilität während der Produktion¹²mitreinigen. Darüber hinaus können diese Matrizen die Bildgebung erschweren und das Risiko von Kontamination und Kosten erhöhen.

Während menschliche Gehirn-Organoide verwendet werden können, um viele Fragen zu beantworten, Gibt es gewisse Einschränkungen zu beachten. Zum einen ähneln Organoide, ausgehend von embryonalen Stammzellen, unreifen Gehirnen eher als gealterte Gehirne und sind daher möglicherweise keine idealen Modelle für Krankheiten, die im Alter auftreten, wie die Alzheimer-Krankheit. Zweitens, während unser Protokoll Marker der Vor-, Hirn- und Hinterhirnentwicklung gefunden hat, die nützlich sind, um die Wirkung einer Behandlung oder Krankheit auf Zellen aus mehreren Hirnregionen gemeinsam zu untersuchen, können andere Protokolle befolgt werden, um sich auf bestimmte Hirnregionen zu konzentrieren^13,14. Schließlich ist eine weitere Einschränkung der Organoid-Modelle die der Größe, während die durchschnittliche Länge eines menschlichen Gehirns etwa 167 mm, Gehirn-Organoide mit der Verwendung von Agitation wachsen bis zu 4 mm⁸ und die Organoide durch dieses Protokoll gebildet wachsen bis 1-2 mm von 10 Wochen. Dennoch bietet dieses Protokoll ein wichtiges Werkzeug, um menschliches Gehirngewebe und die Interaktion mehrerer Zelltypen zu untersuchen.

Protokoll

1. Stammzellpflege

1. Halten Sie H9-HESCs auf einer Schicht von Wachstumsfaktor reduziert Kellermembranmatrix (siehe die Tabelle der Materialien, von nun an einfach als Matrix bezeichnet) nach den Anweisungen des Herstellers.
   1. Um eine 6-Well-Platte oder eine 10-cm-Schale zu beschichten, kombinieren Sie 100 l Matrix mit 5,9 ml eiskaltem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F12-Medium. Platten in Paraffinfolie wickeln und über Nacht bei 4 °C lagern. Verwenden Sie sie am nächsten Tag für Passaging-Zellen, nachdem die überschüssige Matrix/Medien angesaugt wurden.
2. Kultur die Zellen Woche für Woche bei etwa einem 1:12 Split-Verhältnis alle 7 Tage. Pflegen Sie die Zellen mit mTESR-1-Medien in einem 37 °C, sauerstoffarmen Inkubator (5%_O2, 5%_CO2). Aktualisieren Sie Medien täglich. Das Ausweichen von Zellen aus der Kultur zwischen den Passagen mit Glaswerkzeugen.
3. H9-Zellen sollten vier bis sechs Tage vor ihrer Verwendung zur Herstellung von Organoiden durchgepassaget werden. Die Zellen sollten bei einem Verhältnis von etwa 1:8 von Zellclustern durchgangen. Beginnen Sie dazu mit dem Spülen der Zellen mit DMEM F12-Medien und dissoziieren Sie die Zellen mit einer neutralen Protease (z.B. Dispase, fortan einfach als Protease bezeichnet), spülen Sie mit DMEM/F-12 und platten als 30-60 Zellcluster auf 4 Platten (6-well oder 10 cm) bei 20 % Koninfluenza. Zwei Tage vor der Ernte in einen regulären Inkubator (21%_O2, 5% CO₂) überführen. Die Platten sollten bei Beginn der Organoidbildung eine Konfluenz von 80 % erreichen.

2. Dissoziation der hESCs für Organoidkultur

1. Aliquot die Protease-Lagerlösung (5 U/ml).
   HINWEIS: Normalerweise frieren wir 1 ml Aliquots bei -20 °C für den Einsatz über mehrere Monate ein.
2. Verdünnen Sie die Protease-Stammlösung auf die Arbeitskonzentration, indem Sie 1 ml der Stammlösung plus 5 ml DMEM/F12 für jede 6-Well- oder 10-cm-Platte hESCs hinzufügen.
3. Aspirieren und entfernen Sie Zellkulturmedien, und decken Sie dann die hESCs mit der Protease-Lösung ab. Legen Sie Platten in den Inkubator für 10-15 min oder bis die Ränder der Kolonien runden sich auf und beginnen, von der Matrix zu trennen.
4. Neigen Sie die Platte, aspirieren Sie die Proteaselösung und waschen Sie die Zellen mit DMEM/F12 dreimal. Verwenden Sie 2 ml/gut für jede Wäsche, wenn Sie eine 6-Well-Platte und 6 ml bei Verwendung einer 10 cm Platte verwenden. Stellen Sie sicher, dass Kolonien bei der Ausführung dieses Schritts an der Matrix hängen bleiben.
5. Fügen Sie ca. 1,5 ml frische mTESR-Medien zu jedem Brunnen (oder 5 ml für eine 10 cm Platte) zurück und spülen Sie die Zellen mit sanfter Pipettierung von der Platte.
6. Mit einer 10 ml Pipette vorsichtig aspirieren und geben hESC innerhalb der Platte, bis sie etwa 1/30^tel ihrer ursprünglichen Größe erreichen. Kolonie-Cluster sollten am Ende dieser Schritte Quadrate in einer Größe von 250-350 m ähneln.

3. Erzeugung von Organoiden

1. Übertragen Sie Zellen in einen einzigen ultra-niedrigen Aufsatz T75-Kolben mit 30 ml mTESR-Medien ohne grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF).
2. Am nächsten Tag, kippen Sie den Kolben(n) so, dass die lebenden Zellen pool in der Ecke (dies kann 5-10 min am ersten Tag dauern, aber wird schneller, wenn die Cluster größer werden).
   HINWEIS: Wenn es eine große Anzahl von Zellen gibt, die in diesem Schritt oder nachfolgenden Schritten am Boden des Kolbens kleben haben, übertragen Sie die Zellen in einen neuen Kolben. Es ist normal, eine hohe Population von abgestorbenen Zellen für die ersten zwei Tage zu haben. Achten Sie bei der Durchführung von Medienänderungen darauf, so viel wie möglich von zellgebundenen Ablagerungen zu entfernen.
3. Sobald sich die Zellen absetzen, aspirieren Sie die Medien und abgestorbene Zellen und hinterlassen etwa 10 ml Medien, die die lebenden Zellen enthalten.
4. Fügen Sie 20 ml niedrige bFGF-Medien hinzu (DMEM/F12 ergänzt durch 1x S2, 1x B27, 1x L-Glutamin, 1x NEAA, 0,05% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mM Monothioglycerol (MTG) ergänzt mit 30 ng/mL bFGF).
5. Überprüfen Sie die Zellen am 2. Tag. Wenn die meisten Zellen gesund und hell aussehen, gibt es keine Notwendigkeit, etwas zu tun. Wenn jedoch mehr als ein Drittel der Zellen dunkel erscheinen, ersetzen Sie die Medien (mit der gleichen Kipptechnik wie in Schritt 3.2) durch 20 ml niedrige bFGF-Medien, die mit 20 ng/ml bFGF ergänzt werden.
6. Ersetzen Sie am 3. Tag die Hälfte der Medien (mit der Kipptechnik in Schritt 3.2) durch 20 ml niedrige bFGF-Medien, ergänzt durch 10 ng/mL bFGF.
7. Ersetzen Sie an Tag 5 die Hälfte des Mediums (mit der Kipptechnik in Schritt 3.2) durch 20 ml neuronale Induktionsmedien (NIM: DMEM/F12, 1x N2-Ergänzung, 0,1 mM MEM NEAA, 2 g/ml Heparin).
   HINWEIS: Wenn es große Cluster von Zellen oder Organoiden gibt, die viel größer als die anderen sind, sollten sie aus der Kultur entfernt werden. Die Größe wird durch das Aussehen unter dem Mikroskop geschätzt; z. B. mit einem Okular mit Absehen. Die meisten Organoide sind ähnlich groß (ca. 100 x 20 m). Wir entfernten Organoide, die etwa 2x kleiner oder größer als die anderen waren.
8. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums (ca. 15 ml) (mit der Kipptechnik) jeden zweiten Tag durch NIM.
9. Nach 3 Wochen Kultur 100x Penicillin/Streptomycin in die Medien geben (NIM: DMEM/F12, 1x N2-Ergänzung, 0,1 mM MEM NEAA, 2 g/ml Heparin) bei einer Endkonzentration von 1x, falls gewünscht. Aktualisieren Sie die Medien jeden zweiten Tag.
   HINWEIS: Auf diese Weise haben wir die Organoide für bis zu 6 Monate in der Kultur gepflegt.

4. RNA-Extraktion und -Extraktion

1. Mit einer 10 ml Pipette ca. 15 Organoide (je nach Größe) vorsichtig aus dem Kolben extrahieren und in ein 1,5 ml-Rohr geben.
   1. Die Organoide in der Zentrifuge (200 x g für 1 min) sanft pellet und dreimal mit 1x Dulbeccos PBS (DPBS) abspülen.
2. Extrahieren Sie RNA mit validiertem System oder Protokoll (z. B. RNeasy Kit).
3. Messen Sie den optischen Dichtewert jeder Probe bei 260 und 280 nm.
4. Bereiten Sie cDNA mit einem validierten System oder Protokoll (z. B. iScript cDNA Synthesis Kit) vor.
5. Führen Sie qRT-PCR mit vorvalidierten Primern (Tabelle 1) einschließlich mindestens einem Housekeeping-Gen durch.

5. Immunhistochemie

1. Fixierung
   1. Bereiten Sie eine 4%ige Paraformaldehydlösung (PFA) vor und legen Sie sie auf 4 °C.
   2. Schneiden Sie mit einem sterilen Rasiermesser die Spitze einer sterilen Transferpipette ab.
   3. Extrahieren Sie mit der geschnittenen Transferpipette schonsanft Organoide, da sie leicht auseinandergebrochen werden können, besonders wenn sie groß werden, und legen Sie sie in eine 6-Well-Platte mit zusätzlichen Medien oder DPBS.
   4. Neigen Sie die Platte, aspirieren Sie die Medien und ersetzen Sie sie durch 1x DPBS. Spülen Sie die Zellen mit 1x DPBS zwei zusätzliche Male.
   5. Ersetzen Sie den DPBS durch 4% PFA-Lösung und legen Sie auf einen Shaker bei 4 °C.
      HINWEIS: Während wir für 2 Tage (für kleine Organoide) bis 7 Tage (für Organoide >3 Monate) festgelegt haben, können kürzere Zeiten (z. B. 16-24 h) auch möglich sein.
   6. Bereiten Sie 30%, 20% und 10% Saccharoselösungen in DPBS vor.
   7. Nach der Fixierung in PFA durch die 10%ige Saccharoselösung ersetzen und 24 h bei 4 °C auf einen Shaker legen.
   8. Ersetzen Sie die 10% Saccharose durch 20% Saccharose und legen Sie auf einen Shaker bei 4 °C für 24 h.
   9. Ersetzen Sie die 20% Saccharose durch 30% Saccharose und legen Sie auf einen Shaker bei 4 °C für 24 h.
2. Gefrorene Abschnitte
   1. Bereiten Sie eine flache Schicht trockeneis vor und legen Sie eine beschriftete Kunststoffform darauf.
   2. Gießen Sie eine dünne Schicht optimalen Schnitttemperaturmedium (OCT) in die Form und lassen Sie es beginnen zu härten (innerhalb weniger Sekunden).
   3. Legen Sie ein paar Organoide auf der Oberseite des OCT in der Form mit einer Transferpipette mit der Spitze abgeschnitten und achten Sie genau auf die Lage der Organoide.
   4. Fügen Sie langsam in OCT, bis die Form voll ist und die Organoide bedeckt sind. Lassen Sie es für weitere 10 min vollständig aushärten.
      HINWEIS: Während das Einfrieren über 10 min hilft, eine ideale relative Platzierung mehrerer Organoide für die Schnitte zu gewährleisten, ist es möglich, einen Ethanol-Trockeneis-Mix oder flüssigen Stickstoff zu verwenden, um schneller einzufrieren.
   5. Markieren Sie die relative Position der Organoide mit einem Marker, um sie beim Schneiden leichter zu finden.
   6. Legen Sie die Formen in eine Tasche oder Box und lagern Sie bei -80 °C, bis sie bereit sind, die Abschnitte zu schneiden.
   7. Mit einem Kryostat 10 m Abschnitte schneiden und das Gewebe auf beschriftete, positiv geladene Dias legen.
3. Färbung
   1. Bereiten Sie die Blockierlösung vor (0,3% Triton X-100, 4% normales Eselserum in PBS).
   2. Verwenden Sie einen hydrophoben Pap-Stift, um den Umfang des Gewebes zu zeichnen.
   3. Spülen Sie die Dias mit PBS 3 mal für jeweils 5 min.
   4. PBS durch Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur ersetzen.
   5. Ersetzen Sie die Blockierlösung bei 4 °C über Nacht durch Eine Antikörperlösung (Antikörper in entsprechender Konzentration, 0,1% Triton X-100, 4% normales Eselsserum in PBS).
   6. Am nächsten Tag die Rutsche 3 mal mit PBS für jeweils 10 min waschen.
   7. PBS durch den entsprechenden Sekundärantikörper (in der entsprechenden Konzentration) ersetzen, der in Einer Antikörperlösung für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt wird.
   8. Spülen Sie 3 mal für 10 min jedes Mal mit 1x PBS.
   9. Den 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Fleck auftragen und dreimal für jeweils 10 min mit 1x PBS abspülen.
   10. Befestigen Sie die Abdeckungen an der Vorderseite der Dias mit Montagelösung, lassen Sie bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen und lagern Sie im Dunkeln bei 4 °C.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt repräsentative Hellfeldbilder mehrerer Zeitpunkte, um zu zeigen, wie die Zellen/Organoide in den verschiedenen Stadien des Protokolls aussehen. Die hESCs wurden von der Gewebekulturplatte entfernt, in kleine Stücke zerlegt und in einen T75 Ultra-Low-Befestigungskolben gelegt, wo sie Kugeln bildeten. Es ist wichtig zu beachten, dass die Zellen hell und ähnlich aussehen, ohne dunkle, sterbende Zellen in den Zentren dieser Cluster. Die Zellen wurden nach und nach von bFGF e...

Diskussion

Ähnlich wie bei anderen Organoidmodellen ist dies ein künstliches System, das mit mehreren Einschränkungen einhergeht. Obwohl es in Bezug auf die Gesamtexpressionsniveaus nur geringe Batch-zu-Batch-Variationen gab, zeigten einzelne Organoide Unterschiede. Beispielsweise war die Position der Sox-2-positiven Bereiche nicht in jedem Organoid identisch (Abbildung 3). Während qPCR geeignet ist, nach allgemeinen Veränderungen in Zellchargen zu suchen, werden zusätzliche Techniken wie single cell RNAseq i...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814