שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים

Summary

פרוטוקול זה נוצר כאמצעי לייצר אורגנואידים המוח באופן פשוט, עלות נמוכה ללא גורמי צמיחה אקסוגני או מטריקס קרום המרתף תוך שמירה על מגוון של סוגי תאי המוח ותכונות רבות של ארגון הסלולר.

Abstract

אורגנואידים המוח האנושי הבדיל מתאי גזע עובריים להציע את ההזדמנות הייחודית לחקור אינטראקציות מסובכות של סוגי תאים מרובים במערכת תלת ממדית. כאן אנו מציגים שיטה ברורה יחסית וזולה אשר מפיקה אורגנואידים במוח. בפרוטוקול זה האדם בתאי גזע רב עוצמה מנותקים לאשכולות קטנים במקום תאים בודדים גדל במדיה בסיסית ללא מטריצה הטרוולוגי מטריקס מטריצות או גורמי גדילה אקסוגניים, המאפשר רמזים התפתחותיים מהותי כדי לעצב את ה גידול של אורגאיד. מערכת פשוטה זו מייצרת מגוון של סוגי תאי המוח כולל התאים גליה ו microglial, בתאי גזע, ונוירונים של המוח הקדמי, אמצע המוח, ו הראש. אורגנואידים שנוצר מפרוטוקול זה גם להציג את הסימנים של הזמן המתאים וארגון מרחבית הפגינו על ידי תמונות ברייטפילד, היסטולוגיה, immunofluorescence ובזמן אמת הפוכה כמותית התגובה שרשרת פולימראז ( רביעיית-PCR). מכיוון שאורגנואידים אלה מכילים סוגי תאים מחלקים שונים של המוח, הם יכולים להיות מנוצלים ללימוד מספר רב של מחלות. לדוגמה, במאמר האחרון הדגמנו את השימוש באורגנואידים שנוצר מפרוטוקול זה לחקר ההשפעות של היפוקסיה על המוח האנושי. גישה זו יכולה לשמש כדי לחקור מערך של קשה אחרת ללמוד תנאים כגון מגבלות נוירולוגיים, הפרעות גנטיות, ומחלות נוירולוגיות.

Introduction

בשל מגבלות מעשיות ואתיות רבות, יש קושי רב בלימוד המוח האנושי. בעוד מחקרים ניצול מכרסמים היו קריטיים להבנה שלנו של המוח האנושי, המוח העכבר יש הרבה וני^1,2. מעניין, עכברים יש צפיפות עצבית כי הוא לפחות 7 פעמים פחות מאשר המוח הפרימטים^3,4. למרות הפרימטים קרובים יותר לבני אדם מאשר מכרסמים מבחינה אבולוציונית, זה לא מעשי עבור רוב החוקרים לעבוד איתם. המטרה של פרוטוקול זה היתה לסכם תכונות חשובות רבות של המוח האנושי באמצעות שיטה פשוטה וזולה יותר ללא צורך במרתף הטרוולוגי מטריקס קרום או גורמי צמיחה אקסוגני תוך שמירה על מגוון תאי המוח וארגון הסלולר.

עבודת המעצבים מן המעבדה sasai בשימוש סרום חופשי התרבות של embryoid גופים (sfebq) שיטה לייצר שני ותלת מימדי התאים העצביים מתאי גזע עובריים (escs)^5,6. הרבה שיטות של אורגנואיד של המוח האנושי הלכו בדרך דומה יחסית של escs^7,8. לעומת זאת, פרוטוקול זה מתחיל עם אשכולות של escs האדם הפרטי (hESCs), בדומה לשלבים הראשוניים של עבודה הזרע של מעבדות תומסון ו ג'אנג לפני שלבי הציפוי^9,10 , כמו גם את השלב ההתחלתי של פרוטוקול המוח אורגנואיד של המעבדה pasca לפני התוספת של גורמי צמיחה אקסוגני¹¹. מטריצות קרום מרתף (למשל, מטריצות) כבר נוצלו בפרוטוקולים מאורגאיד של המוח הרבים וזה הוכח להיות הגרדום האפקטיבי⁸. עם זאת, הנפוץ ביותר מטריצות קרום המרתף לא בא ללא סיבוכים כפי שהם שיתוף לטהר עם כמויות לא ידועות של גורמי גדילה עם אצווה לשונות אצווה במהלך הייצור¹². בנוסף, מטריצות אלה יכולים לסבך את ההדמיה, ולהגדיל את הסיכון של זיהום ועלות.

בעוד מאורגנואידים המוח האנושי יכול לשמש כדי לענות על שאלות רבות, יש מגבלות מסוימות לזכור. עבור אחד, החל בתאי גזע עובריים, אורגנואידים דומה יותר למוח בוגר מאשר המוחות הישנים וככזה לא יכול להיות מודלים אידיאליים עבור מחלות המתרחשות בגיל הזקנה, כמו מחלת אלצהיימר. שנית, בעוד הפרוטוקול שלנו מצאו סמנים של המוח הקדמי, אמצע המוח התפתחות המוח אשר שימושיים כדי ללמוד את ההשפעה של טיפול או מחלה על תאים מאזורי מוח מרובים בהופעה, ניתן לעקוב אחר פרוטוקולים אחרים כדי להתרכז באזורי מוח ספציפיים^13,14. לבסוף, הגבלה נוספת של מודלים אורגנואיד הוא זה של גודל, בעוד האורך הממוצע של המוח האנושי כ 167 מ"מ, אורגנואידים המוח עשה עם שימוש של עצבנות לגדול עד 4 מ"מ⁸ ואת האורגנואידים שנוצר על ידי פרוטוקול זה לגדול ל 1-2 מ"מ ידי 10 שבועות. למרות זאת, פרוטוקול זה מספק כלי חשוב לחקר רקמת המוח האנושי והאינטראקציה של סוגי תאים מרובים.

Protocol

1. תחזוקת תאי גזע

1. לשמור על H9 hESCs על שכבה של גורם צמיחה מופחתת מטריקס קרום המרתף (לראות את הטבלה של חומרים, מעתה ואילך פשוט המכונה מטריצה) על פי הוראות היצרן.
   1. כדי לחלוק את אחד 6-באר צלחת או 1 10 ס"מ צלחת, לשלב 100 μL של מטריקס עם 5.9 mL של מדיום שונה של הקרח הקרה של Dulbecco (DMEM)/F12 מדיה. לוחות לעטוף בסרט פרפין ולאחסן לילה ב 4 ° c. השתמש בהם ביום שלמחרת לפני שאתם משתמשים בתאי הזדקנות לאחר שעודפי המולטימדיה/המדיה משופחת.
2. תרבות התאים שבוע לשבוע בקירוב 1:12 מפוצל כל 7 ימים. שמור על התאים באמצעות מדיה mTESR-1 ב 37 ° c, אינקובטור נמוך חמצן (5% O₂, 5% CO₂). רענן מדיה מדי יום. מריחואנה מבדילים בין תאים מהתרבות בין מעברים בעזרת כלי זכוכית.
3. H9 תאים צריך להיות מעבר ארבעה עד שישה ימים לפני ניצול אותם כדי לייצר אורגנואידים. התאים צריכים להיות מיושנים בערך 1:8 יחס של אשכולות תאים. כדי לעשות זאת, להתחיל על ידי שטיפה את התאים עם מדיה F12 dmem ו הנתק את התאים עם פרוטאז נייטרלי (למשל, dispase, מעתה המכונה פשוט פרוטאז), לשטוף עם dמאמ/F-12, ואת הצלחת כמו אשכולות תא 30-60 על פני 4 צלחות (6-טוב או 10 ס מ) ב ~ 20% ה יומיים לפני הקציר, מעבר אותם לאינקובטור רגיל (21% O₂, 5% CO₂). לוחיות הרישוי אמורות להגיע ל-~ 80% שליטה בזמן התחלת היווצרות מבנה ארגונית.

2. דיסוציאציה של hESCs לתרבות ארגונית

1. מחלקים את פתרון מלאי הפרוטאז (5 U/mL).
   הערה: אנחנו בדרך כלל להקפיא למטה 1 mL מתחת ל-20 ° c לשימוש במשך מספר חודשים.
2. לדלל את הפתרון מלאי פרוטאז לריכוז העבודה על ידי הוספת 1 מ ל של פתרון המניה פלוס 5 מ ל/F12 עבור כל 6-היטב או 10 ס"מ צלחת של hESCs.
3. מנושף ומסיר את מדיית תרבות התא, ולאחר מכן מכסים את hESCs עם פתרון הפרוטאז. מניחים צלחות בחממה עבור 10-15 דקות או עד שקצות המושבות מסתובבים ומתחילים להיפרד מהמטריקס.
4. הטה את הצלחת, ומכה את פתרון הפרוטאז, ושטוף בעדינות את התאים באמצעות DMEM/F12 שלוש פעמים. השתמש 2 mL/גם עבור כל כביסה בעת שימוש צלחת 6-הבאר ו 6 מ ל כאשר משתמש בצלחת 10 ס מ. ודא שמושבות נשארות מצורפות למטריצה בעת ביצוע שלב זה.
5. הוסף בחזרה על 1.5 mL של מדיית mTESR טרי לכל טוב (או 5 מ ל על צלחת 10 ס מ) ולשטוף את התאים החוצה את הצלחת באמצעות ליטוף עדין.
6. באמצעות שימוש בפיפטה בגודל 10 מ ל, בעדינות לחלק את hESC ולוותר בתוך הצלחת עד שהם מגיעים כ 1/30^th מהגודל המקורי שלהם. אשכולות המושבה צריכים להידמות לריבועים בגודל של ~ 250-350 יקרומטר בסיום שלבים אלה.

3. הדור של אורגנואידים

1. העברת תאים לתוך מצורף יחיד אולטרה נמוך T75 תרמוס המכיל 30 מ ל של mTESR מדיה ללא מקדם בסיסי הצמיחה פיברוהפיצוץ (bFGF).
2. למחרת, להטות את הבקבוקון (עם) כך את הבריכה תאים חיים בפינה (זה יכול לקחת 5-10 דקות ביום הראשון, אבל יהיה מהיר ככל האשכולות לגדול).
   הערה: אם יש מספר גדול של תאים שדבקו בתחתית הבקבוקון בשלב זה או בצעדים הבאים, העבר את התאים לבקבוקון חדש. זה נורמלי להיות אוכלוסיה גבוהה של תאים מתים ביומיים הראשונים. בעת ביצוע שינויי מדיה, הקפד להסיר את הפסולת הסלולרית ככל האפשר.
3. לאחר התאים להתיישב, לאכול את התקשורת ואת התאים מת עוזב כ 10 מ ל של מדיה המכילה את התאים החיים.
4. הוסף ~ 20 מ ל של מדיה bFGF נמוכה (Dמאמ/F12 שיושלם עם 1x N2, 1x B27, 1x L-גלוטמין, 1x NEAA, 0.05% בסרום שור (BSA), ו 0.1 מ"מ מונטגליצרול (MTG) שיושלם עם 30 ng/mL bFGF).
5. . תבדקו את התאים ביום השני אם רוב התאים נראים בריאים ובהירים, אין צורך לעשות דבר. עם זאת, אם יותר משליש תאים מופיעים כהה, להחליף את המדיה (באמצעות אותה טכניקה הטיה כמו בשלב 3.2) עם ~ 20 mL של מדיה נמוכה bFGF שיושלם עם 20 ng/mL bFGF.
6. ביום 3, להחליף חצי של התקשורת (באמצעות טכניקת הטיית בשלב 3.2) עם 20 מ ל של מדיה נמוכה bFGF בתוספת 10 ng/mL bFGF.
7. ביום 5, להחליף חצי בינונית (באמצעות טכניקת הטיית בשלב 3.2) עם 20 מ ל של מדיה השראה עצבית (נים: DMEM/F12, 1x תוספת, 0.1 mM הגברת NEAA, 2 μg/mL הפארין).
   הערה: אם ישנם אשכולות גדולים של תאים או אורגנואידים הגדולים בהרבה מהאחרים, יש להסירם מהתרבות. גודל מוערך על ידי המראה תחת המיקרוסקופ; לדוגמה, באמצעות עינית עם reticle. רוב האורגנואידים הם בגודל דומה (בערך 100 ± 20 μm). הסרנו את האורגנואידים שהיו בערך. שני קטנים או גדולים מהאחרים
8. להחליף חצי בינוני (~ 15 מ"ל) (באמצעות טכניקת הטיית) עם נים בכל יום אחר.
9. לאחר 3 שבועות בתרבות, להוסיף 100x פניצילין/סטרפטומיצין למדיה (נים: DMEM/F12, 1x N2 תוספת, 0.1 mM הגברת NEAA, 2 μg/mL הפארין) בריכוז הסופי של 1x אם תרצה. . תרענן את המדיה כל יומיים
   הערה: בצורה זו שמרו על האורגנואידים של עד 6 חודשים בתרבות.

4. הוצאת רנ א והכנה

1. בעדינות לחלץ כ 15 אורגנואידים (בהתאם לגודל) מן הבקבוקון באמצעות צינור 10 מ"ל ומקום לתוך שפופרת 1.5 mL.
   1. בעדינות הגלולה האורגנואידים בצנטריפוגה (200 x g עבור 1 דקות), ולשטוף עם ה-PBS של שיתוף 1X של דולפי (dpbs) שלוש פעמים.
2. לחלץ RNA באמצעות מערכת או פרוטוקול מאומתים (לדוגמה, RNeasy kit).
3. למדוד את ערך צפיפות אופטית של כל מדגם ב 260 ו 280 nm.
4. הכן cDNA באמצעות מערכת או פרוטוקול מאומת (למשל, iScript cDNA ערכת סינתזה).
5. בצעו רביעיית-PCR באמצעות התחל מראש (שולחן 1) כולל גן אחד לפחות של משק בית.

5. אימונוהיסטוכימיה

1. קיבעון
   1. הכינו פתרון של 4% פאראמפורמלדהיד והניחו אותו ב -4 ° c.
   2. תחתוך את הקצה של. פיפטה העברה סטרילית
   3. בעדינות לחלץ אורגנואידים באמצעות העברה לחתוך את הצנרת, כפי שהם יכולים להישבר בקלות בנפרד, במיוחד כאשר הם גדלים גדולים, ולמקם אותם לצלחת 6-היטב עם מדיה נוספת או DPBS.
   4. להטות את הצלחת, לנפח את התקשורת, ולהחליף עם 1x DPBS. שטפו את התאים באמצעות 1x DPBS פעמיים נוספות.
   5. החליפו את ה-DPBS עם 4% הפתרון החצי-בחצי הכולל והניחו על שייקר ב -4 ° c.
      הערה: בזמן שתיקנו במשך יומיים (עבור אורגנואידים קטנים) ל -7 ימים (עבור אורגנואידים > 3 חודשים), פעמים קצרות יותר (לדוגמה, 16-24 h) יכולים להיות גם אפשריים.
   6. הכינו 30%, 20% ו -10% סוכרוז פתרונות ב-DPBS.
   7. לאחר קיבוע בשנת הג, להחליף עם 10% סוכרוז פתרון ומקום על שייקר ב -4 ° c עבור 24 שעות.
   8. החליפו את ה-10% סוכרוז עם 20% סוכרוז והניחו על שייקר ב -4 ° c במשך 24 שעות.
   9. החליפו 20% סוכרוז ב-30% מעלות ומניחים על שייקר ב -4 ° c במשך 24 שעות.
2. מקטעים קפואים
   1. הכינו שכבה שטוחה של קרח יבש והניחו עובש פלסטי מתויג על גבי זה.
   2. יוצקים שכבה דקה של בינוני בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לתוך התבנית ומאפשרים לה להתחיל להארדן (תוך כמה שניות).
   3. מניחים כמה אורגנואידים על החלק העליון של OCT בתבנית באמצעות פיפטה העברה עם הקצה לחתוך ולשים לב קרוב למיקום של האורגנואידים.
   4. הוסיפו לאט את אוקטובר עד שעובש מלא והאורגנואידים מכוסים. תן לו להיות מרדן לחלוטין עבור 10 דקות נוספות.
      הערה: בזמן הקפאת מעל 10 דקות מסייע להבטיח מיקום יחסי אידיאלי של אורגנואידים מרובים עבור הצבת, אפשר להשתמש בתערובת הקרח אתנול יבש או חנקן נוזלי כדי להקפיא מהר יותר.
   5. סמן את המיקום היחסי של האורגנואידים עם סמן כדי להקל על מיקומם בעת חיתוך.
   6. מקם את התבניות בשקית או בקופסה ואחסן ב-80 ° c עד שמוכן לחתוך את המקטעים.
   7. באמצעות קריוסטט, פרוסה 10 יקרומטר סעיפים ומניחים את הרקמה על תווית, טעונה באופן חיובי שקופיות.
3. צביעת
   1. הכנת פתרון חסימה (0.3% טריטון X-100, 4% סרום חמור רגיל ב-PBS).
   2. השתמש בעט הידרופובי לצייר סביב המערכת של הרקמה.
   3. שטוף את השקופיות עם PBS 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד.
   4. החלף את ה-PBS בפתרון חסימה של 1 h בטמפרטורת החדר.
   5. החלף את פתרון חסימת עם פתרון נוגדן (נוגדן בריכוז המתאים, 0.1% טריטון X-100, 4% סרום חמור רגיל ב-PBS) ב 4 ° c ללילה.
   6. ביום שלמחרת, שטוף את השקופית 3 פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד.
   7. החלף את ה-PBS עם הנוגדן המשני המתאים (בריכוז המתאים) מדולל בתמיסה הנוגדן עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
   8. לשטוף 3 פעמים עבור 10 דקות בכל פעם עם 1x PBS.
   9. החל את 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) כתם לשטוף שלוש פעמים עבור 10 דקות כל אחד עם 1x PBS.
   10. כיסוי מוספית מחליק לקדמת השקופיות עם הפתרון הגובר, לייבש את טמפרטורת החדר בחושך, ולאחסן בחשיכה ב -4 ° c.

תוצאות

איור 1 מציג נציג ברייטפילד תמונות של מספר נקודות זמן כדי להדגים מה התאים/האורגנואידים נראים כמו בכל השלבים השונים של הפרוטוקול. HESCs הוסרו מלוח התרבות רקמה, שבור לחתיכות קטנות, והניח בתוך T75 מצורף אולטרה נמוך בקבוקון שבו הם יצרו כדורים. חשוב לציין כי התאים נראים בהירים ודומים...

Discussion

בדומה למודלים אורגנואיד אחרים, זוהי מערכת מלאכותית המגיעה עם מספר אזהרות. למרות שהיה אצווה קטנה וריאציה אצווה במונחים של רמות הביטוי הכולל, אורגנואידים בודדים הראו הבדלים. לדוגמה, המיקום של האזורים החיוביים של סוקס-2 לא היה זהה בכל אורגנואיד (איור 3). בעוד qPCR מתאים לחפש שינויים כול?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814