Un metodo statico auto-diretto per generare organiidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane

Riepilogo

Questo protocollo è stato generato come mezzo per produrre organoidi cerebrali in modo semplificato e a basso costo senza fattori di crescita esogeni o matrice di membrana seminterrato, pur mantenendo la diversità dei tipi di cellule cerebrali e molte caratteristiche dell'organizzazione cellulare.

Abstract

Gli organoidi cerebrali umani differenziati dalle cellule staminali embrionali offrono l'opportunità unica di studiare interazioni complicate di più tipi di cellule in un sistema tridimensionale. Qui vi presentiamo un metodo relativamente semplice e poco costoso che produce organoidi cerebrali. In questo protocollo le cellule staminali pluripotenti umane sono suddivise in piccoli ammassi invece di singole cellule e coltivate in supporti di base senza una matrice di membrana del seminterrato etesologa o fattori di crescita esogeni, consentendo ai segnali di sviluppo intrinseci di modellare il crescita dell'organoide. Questo semplice sistema produce una varietà di tipi di cellule cerebrali tra cui cellule gliali e microgliali, cellule staminali e neuroni del prosencefalo, del cervello medio e del cervello posteriore. Gli organoidi generati da questo protocollo mostrano anche segni distintivi di un'appropriata organizzazione temporale e spaziale dimostrati da immagini luminose, istologia, immunofluorescenza e reazione della catena di trascrizione inversa quantitativa in tempo reale ( qRT-PCR). Poiché questi organoidi contengono tipi di cellule da varie parti del cervello, possono essere utilizzati per studiare una moltitudine di malattie. Per esempio, in un recente articolo abbiamo dimostrato l'uso di organoidi generati da questo protocollo per studiare gli effetti dell'ipossia sul cervello umano. Questo approccio può essere utilizzato per studiare una serie di condizioni altrimenti difficili da studiare come gli handicap del neurosviluppo, i disturbi genetici e le malattie neurologiche.

Introduzione

A causa di una miriade di limitazioni pratiche ed etiche, c'è stata una grande difficoltà nello studio del cervello umano. Mentre gli studi che utilizzano roditori sono stati fondamentali per la nostra comprensione del cervello umano, il cervello del topo ha molte differenze^1,2. È interessante notare che i topi hanno una densità neuronale che è almeno 7 volte inferiore al cervello dei primati^3,4. Anche se i primati sono più vicini agli esseri umani rispetto ai roditori da un punto di vista evolutivo, non è pratico per la maggior parte dei ricercatori lavorare con loro. Lo scopo di questo protocollo era quello di riassumere molte caratteristiche importanti del cervello umano utilizzando un metodo semplificato e meno costoso senza la necessità di una matrice di membrana seminterrato eterologa o fattori di crescita esogeni pur mantenendo la diversità delle cellule cerebrali e l'organizzazione cellulare.

Il lavoro formativo del laboratorio Sasai ha utilizzato la coltura senza siero dei corpi embrionali (SFEBq) per generare tipi di cellule neuronali bidimensionali e tridimensionali da cellule staminali embrionali (ESC) segnalate^5,6. Molti metodi organoidi del cervello umano hanno seguito un percorso relativamente simile rispetto alle ESC segnalate^7,8. Al contrario, questo protocollo inizia con cluster di ESC umani distaccati (hESC), simili ai primi passi del lavoro seminale dei laboratori Thomson e zhang prima delle fasi di placcatura^9,10, così come la fase iniziale del protocollo organoide cerebrale del laboratorio Pasca prima dell'aggiunta di fattori di crescita esogeni¹¹. Le matrici a membrana del seminterrato (ad esempio, matrigel) sono state utilizzate in molti protocolli organoidi cerebrali ed è stato dimostrato di essere un efficace scaffold⁸. Tuttavia, le matrici di membrana seminterrato più comunemente utilizzate non vengono senza complicazioni in quanto co-purificano con quantità sconosciute di fattori di crescita con variabilità batch a batch durante la produzione¹². Inoltre, queste matrici possono complicare l'imaging e aumentare il rischio di contaminazione e costi.

Mentre gli organoidi del cervello umano possono essere utilizzati per rispondere a molte domande, ci sono alcune limitazioni da tenere a mente. Per uno, a partire dalle cellule staminali embrionali, gli organoidi assomigliano più da vicino acerrimi cerebrali immaturi rispetto ai cervelli invecchiati e come tali potrebbero non essere modelli ideali per malattie che si verificano nella vecchiaia, come il morbo di Alzheimer. In secondo luogo, mentre il nostro protocollo ha trovato marcatori di prosencefalo, sviluppo del cervello e del cervello posteriore che sono utili per studiare l'effetto di un trattamento o di una malattia sulle cellule di più regioni cerebrali in concerto, altri protocolli possono essere seguiti per concentrarsi su specifiche regioni del cervello^13,14. Infine, un'altra limitazione dei modelli organoidi è quella delle dimensioni, mentre la lunghezza media di un cervello umano di circa 167 mm, gli organoidi cerebrali fatti con l'uso di agitazione crescono fino a 4 mm⁸ e gli organoidi formati da questo protocollo crescono a 1-2 mm di 10 settimane. Ciò nonostante, Questo protocollo fornisce uno strumento importante per studiare il tessuto cerebrale umano e l'interazione di più tipi di cellule.

Protocollo

1. Manutenzione delle cellule staminali

1. Mantenere H9 hESC su uno strato di fattore di crescita ridotto matrice della membrana seminterrato (vedere la Tabella dei materiali, d'ora in poi semplicemente indicato come matrice) secondo le istruzioni del produttore.
   1. Per rivestire una piastra di 6 pozzetti o un piatto da 10 cm, unire 100 l-L di matrice con 5,9 mL di supporto Eagle modificato a freddo ghiaccio (DMEM)/F12. Avvolgere le piastre in pellicola di paraffina e conservarle durante la notte a 4 gradi centigradi. Usali il giorno successivo per passare le cellule dopo che la matrice/supporto in eccesso è stato aspirato.
2. Coltura le celle da settimana a settimana a circa un rapporto di divisione 1:12 ogni 7 giorni. Mantenere le cellule utilizzando supporti mTESR-1 in un'incubatrice a 37 gradi centigradi (5% O₂, 5% CO₂). Aggiornare i file multimediali ogni giorno. Elimina le cellule dalla coltura tra i passaggi usando strumenti di vetro.
3. Le cellule H9 devono essere passaggiate da quattro a sei giorni prima di utilizzarle per produrre organoidi. Le cellule devono essere passaggiate approssimativamente a un rapporto 1:8 dei cluster cellulari. Per fare questo, iniziare risciacquando le cellule con il supporto DMEM F12 e dissociare le cellule con una proteasi neutra (ad esempio, dispase, d'ora in poi indicata semplicemente come proteasi), risciacquare con DMEM/F-12, e piastra come 30-60 gruppi di cellule su 4 piastre (6-well o 10 cm) a 20 %. Due giorni prima della raccolta, passarli a un'incubatrice regolare (21% O₂, 5% CO₂). Le piastre dovrebbero raggiungere l'80% di confluenza quando iniziano la formazione di organoidi.

2. Dissociazione degli hESC per la cultura organoide

1. Aliquota la soluzione di stock proteasi (5 U/mL).
   NOTA: In genere congeliamo 1 aliquota a -20 gradi centigradi per l'uso per diversi mesi.
2. Diluire la soluzione di riserva proteasi alla concentrazione di lavoro aggiungendo 1 mL della soluzione di stock più 5 mL di DMEM/F12 per ogni piastra di 6 o 10 cm di hESC.
3. Aspirati e rimuovi i supporti di coltura cellulare, quindi copri gli hESC con la soluzione protease. Posizionare le piastre nell'incubatrice per 10-15 min o fino a quando i bordi delle colonie arrotondano e iniziano a separarsi dalla matrice.
4. Inclinare la piastra, aspirare la soluzione di proteasi e lavare delicatamente le cellule con DMEM/F12 tre volte. Utilizzare 2 mL/po' per ogni lavaggio quando si utilizza una piastra a 6 pozze tramite e 6 mL quando si utilizza una piastra da 10 cm. Assicurarsi che le colonie rimangano attaccate alla matrice quando si esegue questo passaggio.
5. Aggiungere indietro circa 1,5 mL di supporti mTESR freschi ad ogni pozzo (o 5 mL per una piastra da 10 cm) e lavare le cellule dalla piastra utilizzando una leggera pipettatura.
6. Utilizzando una pipetta da 10 mL, aspirare delicatamente e erogare hESC all'interno della piastra fino a raggiungere circa 1/30^th della loro dimensione originale. I grappoli di colonia dovrebbero assomigliare a quadrati di dimensioni pari a 250-350 m al termine di questi passaggi.

3. Generazione di organoidi

1. Trasferire le cellule in un singolo accessorio ultra-basso T75 contenente 30 mL di supporti mTESR senza fattore di crescita fibroblasto di base (bFGF).
2. Il giorno successivo, inclinare il fiaschetta (s) in modo che la piscina di cellule vive in un angolo (questo può richiedere 5-10 min il primo giorno, ma otterrà più veloce come i cluster si ingrandiscono).
   NOTA: Se ci sono un gran numero di cellule che hanno aderito alla parte inferiore del pallone in questa fase o in eventuali passaggi successivi, trasferire le celle in una nuova flacone. È normale avere un'alta popolazione di cellule morte per i primi due giorni. Quando si eseguono modifiche multimediali, assicurarsi di rimuovere la maggior parte dei detriti cellulari possibile.
3. Una volta che le cellule si depositano, aspirare i media e le cellule morte lasciando circa 10 mL di supporti contenenti le cellule vive.
4. Aggiungere 20 mL di supporto bFGF basso (DMEM/F12 integrato con 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamine, 1x NEAA, 0.05% biondo albumina (BSA) e 0,1 mM monothioglycerol (MTG) integrato con 30 ng/mL bFGF).
5. Controllare le celle il giorno 2. Se la maggior parte delle cellule sembrano sane e luminose, non c'è bisogno di fare nulla. Tuttavia, se più di un terzo delle cellule appaiono scure, sostituire il supporto (utilizzando la stessa tecnica di inclinazione del passaggio 3.2) con 20 mL di supporto bFGF basso integrato con 20 ng/mL bFGF.
6. Il giorno 3, sostituire metà del supporto (utilizzando la tecnica di inclinazione al punto 3.2) con 20 mL di supporto bFGF basso integrato con 10 ng/mL bFGF.
7. Il giorno 5, sostituire metà del mezzo (utilizzando la tecnica di inclinazione al punto 3.2) con 20 mL di supporto di induzione neurale (NIM: DMEM/F12, 1x supplemento N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 g/mL di eparina).
   NOTA: Se ci sono grandi gruppi di cellule o organoidi che sono molto più grandi degli altri, dovrebbero essere rimossi dalla coltura. La dimensione è stimata per aspetto al microscopio; ad esempio, utilizzando un oculare con reticolo. La maggior parte degli organoidi sono di dimensioni simili (circa 100 x 20 m). Abbiamo rimosso organoidi che erano circa 2x più piccoli o più grandi degli altri.
8. Sostituire metà del mezzo (15 mL) (utilizzando la tecnica di inclinazione) con NIM a giorni alterni.
9. Dopo 3 settimane di coltura, aggiungere 100x penicillina/streptomicina ai media (NIM: DMEM/F12, 1x supplemento N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 g/mL di eparina) ad una concentrazione finale di 1x se lo si desidera. Aggiornare i file multimediali a giorni alterni.
   NOTA: In questo modo, abbiamo mantenuto gli organoidi per un massimo di 6 mesi di cultura.

4. Estrazione e preparazione dell'RNA

1. Estrarre delicatamente circa 15 organoidi (a seconda delle dimensioni) dal flacone utilizzando una pipetta da 10 mL e metterli in un tubo da 1,5 mL.
   1. Pellere delicatamente gli organoidi nella centrifuga (200 x g per 1 min) e risciacquare con 1x PBS di Dulbecco (DPBS) tre volte.
2. Estrarre l'RNA utilizzando un sistema o un protocollo convalidato (ad esempio, kit RNeasy).
3. Misurare il valore di densità ottica di ogni campione a 260 e 280 nm.
4. Preparare il cDNA utilizzando un sistema o un protocollo convalidato (ad esempio, iScript cDNA synthesis kit).
5. Eseguire qRT-PCR utilizzando primer pre-convalidati (Tabella 1) includendo almeno un gene di pulizia.

5. Immunoistochimica

1. Fissazione
   1. Preparare una soluzione di paraformaldeide (PFA) del 4% e posizionarla a 4 gradi centigradi.
   2. Utilizzando un rasoio sterile, tagliare la punta di una pipetta di trasferimento sterile.
   3. Estrarre delicatamente gli organoidi utilizzando la pipetta di trasferimento tagliato, in quanto possono essere facilmente separati, soprattutto quando crescono grandi, e metterli in una piastra a 6 pozze con supporti aggiuntivi o DPBS.
   4. Inclinare la piastra, aspirare il supporto e sostituirlo con 1x DPBS. Sciacquare le cellule con 1x DPBS altre due volte.
   5. Sostituire il DPBS con una soluzione PFA del 4% e posizionarlo su uno shaker a 4 gradi centigradi.
      NOTA: Mentre abbiamo fissato per 2 giorni (per piccoli organoidi) a 7 giorni (per organoidi >3 mesi), possono anche essere possibili tempi più brevi (ad esempio, 16-24 h).
   6. Prepara soluzioni per il 30%, il 20% e il 10% di saccarosio in DPBS.
   7. Dopo la fissazione in PFA, sostituire con la soluzione di saccarosio del 10% e mettere su uno shaker a 4 gradi centigradi per 24 ore.
   8. Sostituire il saccarosio del 10% con il 20% di saccarosio e mettere su uno shaker a 4 gradi centigradi per 24 h.
   9. Sostituire il saccarosio 20% con il 30% di saccarosio e mettere su uno shaker a 4 gradi centigradi per 24 h.
2. Sezioni congelate
   1. Preparare uno strato piatto di ghiaccio secco e posizionare uno stampo di plastica etichettato su di esso.
   2. Versare un sottile strato di mezzo di temperatura di taglio ottimale (OCT) nello stampo e lasciarlo iniziare a indurirsi (in pochi secondi).
   3. Posizionare alcuni organoidi sulla parte superiore dello stampo dello stampo nello stampo utilizzando una pipetta di trasferimento con la punta tagliata e prestare molta attenzione alla posizione degli organoidi.
   4. Aggiungere lentamente in OCT fino a quando lo stampo è pieno e gli organoidi sono coperti. Lasciare indurire completamente per altri 10 min.
      NOTA: Mentre il congelamento di oltre 10 min aiuta a garantire il posizionamento relativo ideale di più organoidi per la sezionamento, è possibile utilizzare un mix di ghiaccio etanolo-secco o azoto liquido per congelare più rapidamente.
   5. Contrassegnare la posizione relativa degli organoidi con un pennarello per facilitarne la ricerca durante il taglio.
   6. Mettete gli stampi in un sacchetto o in una scatola e conservate a -80 gradi fino a quando non saranno pronti a tagliare le sezioni.
   7. Utilizzando un criostato, affettare sezioni da 10 m e posizionare il tessuto su diapositive etichettate e caricate positivamente.
3. Colorazione
   1. Preparare la soluzione di blocco (0,3% Triton X-100, 4% siero d'asino normale in PBS).
   2. Utilizzare una pap pen idrofobica per disegnare intorno al perimetro del tessuto.
   3. Sciacquare le diapositive con PBS 3 volte per 5 min ciascuno.
   4. Sostituire PBS con soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente.
   5. Sostituire la soluzione di blocco con una soluzione anticorpale (anticorpo a concentrazione appropriata, 0,1% Triton X-100, 4% siero d'asino normale in PBS) a 4 gradi durante la notte.
   6. Il giorno successivo, lavare la diapositiva 3 volte con PBS per 10 min ciascuno.
   7. Sostituire PBS con l'anticorpo secondario appropriato (alla concentrazione appropriata) diluito nella soluzione anticorpale per 1 h a temperatura ambiente.
   8. Risciacquare 3 volte per 10 min ogni volta con 1x PBS.
   9. Applicare la colorazione 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) e risciacquare tre volte per 10 min ciascuno con 1x PBS.
   10. Affisso coprelips sulla parte anteriore dei vetrini con soluzione di montaggio, lasciare asciugare a temperatura ambiente al buio, e conservare al buio a 4 gradi centigradi.

Risultati

La figura 1 mostra immagini rappresentative di diversi punti temporali per dimostrare l'aspetto delle celle/organoidi in tutte le diverse fasi del protocollo. Gli HESC sono stati rimossi dalla piastra di coltura dei tessuti, spezzati in piccoli pezzi, e collocati in una fiaschetta di attacco ultra-bassa T75 dove formavano sfere. È importante notare che le cellule sembrano luminose e simili in termini di dimensioni, senza cellule scure e morenti nei centri di questi ammassi. Le cellule sono ...

Discussione

Simile ad altri modelli organoidi, questo è un sistema artificiale che viene fornito con diversi avvertimenti. Anche se c'era poco batch di variazione batch in termini di livelli di espressione complessiva, organidi singoli ha mostrato differenze. Ad esempio, la posizione delle aree positive Sox-2 non era identica in ogni organoide (Figura 3). Mentre qPCR è adatto a cercare cambiamenti complessivi in lotti di cellule, tecniche aggiuntive come gli RNA a cella singola saranno utilizzati in studi futuri p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814