İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Özet

Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.

Özet

Embriyonik kök hücrelerden farklı laşan insan beyin organoidleri, üç boyutlu bir sistemde birden fazla hücre türünün karmaşık etkileşimlerini incelemek için eşsiz bir fırsat sunar. Burada beyin organoidleri verimleri nispeten basit ve ucuz bir yöntem salıyoruz. Bu protokolde insan pluripotent kök hücreleri tek hücreler yerine küçük kümelere ayrılır ve heterolog bir bazal membran matrisi veya eksojen büyüme faktörleri olmaksızın temel ortamda büyütülür ve içsel gelişimsel ipuçlarının organoid in büyümesi. Bu basit sistem glial ve mikroglial hücreler de dahil olmak üzere beyin hücresi türlerinin bir çeşitlilik üretir, kök hücreler, ve ön beyin nöronlar, orta beyin, ve arka beyin. Bu protokolden üretilen organoidler ayrıca brightfield görüntüleri, histolojisi, immünororesans ve gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile gösterilen uygun zamansal ve mekansal organizasyonun işaretlerini de göstermektedirler ( qRT-PCR). Bu organoidler beynin çeşitli bölgelerinden hücre tipleri içerdiğinden, çok sayıda hastalığın incelenmesinde kullanılabilirler. Örneğin, yakın zamanda yayınlanan bir makalede, hipoksinin insan beyni üzerindeki etkilerini incelemek için bu protokolden üretilen organoidlerin kullanımını gösterdik. Bu yaklaşım, nörogelişimsel handikaplar, genetik bozukluklar ve nörolojik hastalıklar gibi başka türlü zor koşulları araştırmak için kullanılabilir.

Giriş

Sayısız pratik ve etik sınırlamalar nedeniyle, insan beynini incelemekte büyük bir zorluk olmuştur. Kemirgenler kullanan çalışmalar insan beyninin anlayışı için kritik olmuştur iken, fare beyin birçok farklılıklar vardır^1,2. İlginçtir, fareler primat^beyin3,⁴en az 7 kat daha az bir nöronal yoğunluğu var. Primatlar insanlara evrimsel açıdan kemirgenlerden daha yakın olsalar da, çoğu araştırmacının onlarla çalışması pratik değildir. Bu protokolün amacı, beyin hücresi çeşitliliği ve hücresel örgütlenmeyi korurken heterolog bir bazal membran matrisine veya eksojen büyüme faktörlerine gerek kalmadan basitleştirilmiş ve daha ucuz bir yöntem kullanarak insan beyninin birçok önemli özelliğini özetlemekti.

Sasai laboratuarından biçimlendirici çalışma sinyalize embriyonik kök hücrelerden iki ve üç boyutlu nöronal hücre tipleri oluşturmak için embriyoid organların serum ücretsiz kültür (SFEBq) yöntemi kullanılır (ESCs)^5,6. Birçok insan beyin organoid yöntemleri sinyalize ESCs nispeten benzer bir yol izlemiştir^7,8. Buna karşılık, bu protokol müstakil insan ESCs kümeleri ile başlar (hESCs), kaplama adımları önce Thomson ve Zhang laboratuvarlarının seminal çalışmanın ilk adımları benzer^9,10 yanı sıra eksojen büyüme faktörlerinin eklenmesinden önce Pasca laboratuvarının beyin organoid protokolünün ilk adım¹¹. Bazal membran matrisler (örneğin, matrigel) birçok beyin organoid protokolleri kullanılmıştır ve etkili bir iskele olduğu gösterilmiştir⁸. Ancak, en sık kullanılan bazal membran matrisler onlar üretim sırasında toplu değişkenlik için toplu büyüme faktörlerinin bilinmeyen miktarlarda co-arındırmak gibi komplikasyonlar olmadan gelmez¹². Buna ek olarak, bu matrisler görüntülemekarmaşık ve kontaminasyon ve maliyet riskini artırabilir.

İnsan beyin organoidler birçok soruya cevap için kullanılabilir iken, akılda tutulması gereken bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, embriyonik kök hücrelerden başlayarak, organoidler daha yakından yaşlı beyinlere göre olgunlaşmamış beyinler benzer ve bu nedenle yaşlılıkta meydana gelen hastalıklar için ideal modeller olmayabilir, Alzheimer hastalığı gibi. İkinci olarak, protokolümüz de konserde birden fazla beyin bölgesinden hücreler üzerinde bir tedavi veya hastalığın etkisini incelemek için yararlı olan ön beyin, orta beyin ve arka beyin gelişimi belirteçleri bulundu, diğer protokoller belirli beyin bölgeleri üzerinde konsantre takip edilebilir^13,14. Son olarak, organoid modellerin bir diğer sınırlama boyutu, bir insan beyninin ortalama uzunluğu ise yaklaşık 167 mm, ajitasyon kullanımı ile yapılan beyin organoidler kadar büyümek 4 mm⁸ ve bu protokol tarafından oluşturulan organoidler 10 hafta 1-2 mm büyür. Yine de, bu protokol insan beyin dokusu ve birden fazla hücre tiplerinin etkileşimi incelemek için önemli bir araç sağlar.

Protokol

1. Kök Hücre Bakımı

1. Büyüme faktörü azaltılmış bodrum membran matris bir tabaka üzerinde H9 hESCs korumak (Malzemeler Tablosubakınız , bundan böyle sadece matris olarak anılacaktır) üreticinin talimatlarına göre.
   1. Bir 6-iyi plaka veya bir 10 cm çanak kaplamak için, buz gibi Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM)/F12 medya 5,9 mL ile matris 100 μL birleştirir. Plakaları parafin filmine sarın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Aşırı matris/ortam aspire edildikten sonra hücreleri geçirmek için ertesi gün kullanın.
2. Kültür hücreleri hafta hafta yaklaşık 1:12 bölünmüş oranı her 7 günde. Hücreleri 37 °C'lik bir mTESR-1 media, düşük oksijen inkübatör (%5 O_2,%5 CO₂₎kullanarak koruyun. Medyayı her gün yenileyin. Cam aletler kullanarak pasajlar arasındaki kültürlerden ayırıcı hücreleri ayırArak ayırın.
3. H9 hücreleri organoidler üretmek için onları kullanmadan önce dört ila altı gün önce geçit edilmelidir. Hücreler hücre kümelerinin yaklaşık 1:8 oranında geçmelidir. Bunu yapmak için, hücreleri DMEM F12 media ile durulayarak başlayın ve hücreleri nötr bir proteaz (örneğin, dispase, bundan böyle sadece proteaz olarak adlandırılır), DMEM/F-12 ile durulayın ve 4 plaka (6-iyi veya 10 cm) arasında ~%20'lik bir arada 30-60 hücre kümesi şeklinde durulayın. Hasattan iki gün önce, onları normal bir kuluçka makinesine geçirin (%21 O_2,%5 CO_2). Organoid formasyona başlarken plakalar ~%80 birleşmeye ulaşmalıdır.

2. Organoid Kültür için HESC'lerin Dissosiyatasyonu

1. Aliquot proteease stok çözeltisi (5 U/mL).
   NOT: Genellikle -20 °C'de 1 mL aliquots aşağı birkaç ay boyunca kullanılmak üzere dondurun.
2. Proteaz stok çözeltisini, her 6 kuyu veya 10 cm'lik hESC'ler için 1 mL stok çözeltisi artı 5 mL DMEM/F12 ekleyerek çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
3. Aspire ve hücre kültürü medya kaldırmak, sonra proteaz çözeltisi ile hESCs kapağı. Plakaları 10-15 dakika boyunca kuvöze yerleştirin veya kolonilerin kenarları yuvarlanıp matristen ayırmaya başlayana kadar.
4. Plakayı yatırın, proteaz çözeltisini aspire edin ve hücreleri DMEM/F12 ile üç kez hafifçe yıkayın. 10 cm'lik bir tabak kullanırken 6 kuyulu bir tabak ve 6 mL kullanırken her yıkama için 2 mL/iyi kullanın. Bu adımı gerçekleştirirken kolonilerin matrise bağlı kaldığından emin olun.
5. Her kuyuya yaklaşık 1,5 mL taze mTESR ortam (veya 10 cm plaka için 5 mL) ekleyin ve hücreleri nazik pipetleme kullanarak plakadan temizler.
6. 10 mL'lik pipet kullanarak, hESC'yi orijinal^{boyutlarının} yaklaşık 1/30'una ulaşana kadar plaka içinde hafifçe aspire edin ve dağıtın. Koloni kümeleri bu adımların tamamlanmasında ~250-350 μm ölçekli karelere benzemelidir.

3. Organoidlerin Üretimi

1. Hücreleri, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) olmadan 30 mL mTESR ortam içeren tek bir ultra düşük eki T75 şişesine aktarın.
2. Ertesi gün, köşede canlı hücre havuzu (bu ilk gün 5-10 dakika sürebilir, ancak kümeleri büyüdükçe daha hızlı alacak) gibi şişe (ler) tilt.
   NOT: Bu adımda veya sonraki adımlarda şişenin altına yapışmış çok sayıda hücre varsa, hücreleri yeni bir şişeye aktarın. İlk iki gün yüksek sayıda ölü hücreye sahip olması normaldir. Ortam değişiklikleri gerçekleştirirken, hücre enkazının mümkün olduğunca çoğunu kaldırdığınızdan emin olun.
3. Hücreler yerleştikten sonra, canlı hücreleri içeren yaklaşık 10 mL'lik ortam bırakarak ortam ve ölü hücreleri aspire edin.
4. 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamin, 1x NEAA, %0.05 sığır serum albumini (BSA) ve 0.1 mM monotiyogliserol (MTG) ile birlikte 30 ng/mL bFGF ile desteklenen ~ 20 mL düşük bFGF medya (DMEM/F12) ekleyin.
5. 2. günde hücreleri kontrol edin. Hücrelerin çoğu sağlıklı ve parlak görünüyorsa, bir şey yapmanıza gerek yoktur. Ancak, hücrelerin üçte birinden fazlası koyu renk görünürse, ortamı (adım 3.2'deki yle aynı yatırma tekniğini kullanarak) ~20 mL düşük bFGF medya ile 20 ng/mL bFGF ile tamamlanır.
6. 3. günde, 10 ng/mL bFGF ile desteklenen 20 mL düşük bFGF ortamile ortamın yarısını (adım 3.2'deki yatırma tekniğini kullanarak) değiştirin.
7. 5. günde, ortamın yarısını (adım 3.2'deki yatırma tekniğini kullanarak) 20 mL nöral indüksiyon media (NIM: DMEM/F12, 1x N2 takviyesi, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) ile değiştirin.
   NOT: Diğerlerinden çok daha büyük büyük hücre veya organoid kümeleri varsa, kültürden uzaklaştırılmalıdır. Boyut mikroskop altında görünüm tarafından tahmin edilmektedir; örneğin, reticle ile bir gözlük kullanarak. Organoidlerin çoğu benzer büyüklüktedir (kabaca 100 ± 20 μm). Diğerlerinden yaklaşık 2 kat daha küçük veya daha büyük olan organoidleri çıkardık.
8. Ortamın yarısını (~15 mL) (yatırma tekniğini kullanarak) nim ile her gün değiştirin.
9. Kültürde 3 hafta sonra, ortama 100x penisilin/streptomisin ekleyin (NIM: DMEM/F12, 1x N2 takviyesi, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) istenirse 1x son konsantrasyonunda. Medyayı her gün yenileyin.
   NOT: Bu şekilde, kültürde 6 aya kadar organoidleri koruduk.

4. RNA Çıkarma ve Hazırlama

1. 10 mL'lik bir pipet kullanarak şişeden yaklaşık 15 organoidi (boyuta bağlı olarak) hafifçe ayıklayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
   1. Santrifüjdeki (1 dk için 200 x g) organoidleri hafifçe peletleyin ve 1x Dulbecco'nun PBS 'si (DPBS) ile üç kez durulayın.
2. Doğrulanmış sistem veya protokol (örn. RNeasy kiti) kullanarak RNA ayıklayın.
3. Her numunenin optik yoğunluk değerini 260 ve 280 nm olarak ölçün.
4. Doğrulanmış bir sistem veya protokol (örneğin, iScript cDNA sentez kiti) kullanarak cDNA hazırlayın.
5. En az bir temizlik geni de dahil olmak üzere önceden onaylanmış astarlar(Tablo 1)kullanarak qRT-PCR gerçekleştirin.

5. İmmünohistokimya

1. Fiksasyon
   1. %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'ye yerleştirin.
   2. Steril bir jilet kullanarak, steril bir transfer pipetinin ucunu kesin.
   3. Kesme transfer pipetini kullanarak organoidleri yavaşça ayıklayın, çünkü özellikle büyüdüklerinde kolayca parçalanabilirler ve ek ortam veya DPBS ile 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin.
   4. Plakayı yatırın, ortama aspire edin ve 1x DPBS ile değiştirin. Hücreleri 1x DPBS ile iki kez daha durulayın.
   5. DPBS'yi %4 PFA çözeltisi ile değiştirin ve 4 °C'de bir çalkalayıcının üzerine yerleştirin.
      NOT: 2 gün (küçük organoidler için) 7 güne (organoidler için >3 ay) sabitlenirken, daha kısa süreler (örn. 16-24 saat) de mümkündür.
   6. DPBS'de %30, %20 ve %10 sakkaroz çözeltisi hazırlayın.
   7. PFA'da fiksasyondan sonra % 10 sakaroz çözeltisi ile değiştirin ve 4 °C'de 24 saat çalkalayın.
   8. %10 sakarozun yerine %20 sakaroz ve 4 °C'de 24 saat boyunca bir shaker üzerine yerleştirin.
   9. %20 sakarozun yerine %30 sakaroz yerleştirin ve 4 °C'de 24 saat boyunca bir shaker üzerine yerleştirin.
2. Dondurulmuş bölümler
   1. Kuru buz düz bir tabaka hazırlayın ve üstüne etiketli bir plastik kalıp yerleştirin.
   2. Kalıbın içine en uygun kesme sıcaklığıorta (OCT) ince bir tabaka dökün ve sertleşmeye başlayalım (birkaç saniye içinde).
   3. İpucu kesilmiş bir transfer pipetkullanarak kalıp OCT üstüne birkaç organoidler yerleştirin ve organoidlerin konumuna yakın dikkat.
   4. Yavaş yavaş kalıp dolu ve organoidler kaplı olana kadar OCT ekleyin. Ek bir 10 dakika boyunca tamamen sertleşsin.
      NOT: 10 dakikanın üzerinde donma, kesit için birden fazla organoidin ideal göreceli yerleşimini sağlamaya yardımcı olurken, daha hızlı donmak için etanol-kuru buz karışımı veya sıvı nitrojen kullanmak mümkündür.
   5. Keserken bulmayı kolaylaştırmak için organoidlerin göreceli konumunu bir işaretle işaretleyin.
   6. Kalıpları bir torbaya veya kutuya yerleştirin ve bölümleri kesmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
   7. Bir kriyostat kullanarak, 10 μm kesitleri dilimleyin ve dokuyu etiketli, pozitif yüklü slaytlara yerleştirin.
3. Boy -ama
   1. Bloke çözeltisi hazırlayın (%0.3 Triton X-100, PBS'de %4 normal eşek serumu).
   2. Doku çevresi etrafında çizmek için bir hidrofobik pap kalem kullanın.
   3. Slaytları PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca durulayın.
   4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'yi bloklama çözeltisi ile değiştirin.
   5. Bloke çözeltisini bir gecede 4 °C'de antikor solüsyonu (uygun konsantrasyonda antikor, %0.1 Triton X-100, PBS'de %4 normal eşek serumu) değiştirin.
   6. Ertesi gün, her biri 10 dakika pbs ile 3 kez slayt yıkayın.
   7. PBS'yi oda sıcaklığında 1 saat boyunca antikor çözeltisinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorla (uygun konsantrasyonda) değiştirin.
   8. 1x PBS ile her seferinde 10 dakika boyunca 3 kez durulayın.
   9. 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) lekesini uygulayın ve 1x PBS ile her biri 10 dakika boyunca üç kez durulayın.
   10. Yapıştırmak kapakları kapakları, montaj çözeltisi ile kaydırakların ön kısmı, karanlıkta oda sıcaklığında kurumasını bekleyin ve 4 °C'de karanlıkta saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1, protokolün farklı aşamalarında hücrelerin/organoidlerin nasıl göründüğünü göstermek için birkaç zaman noktasının temsili parlak alan görüntülerini gösterir. HESC'ler doku kültür plakasından çıkarıldı, küçük parçalara ayrıldı ve küreler oluşturdukları T75 ultra-düşük ek şişesine yerleştirildi. Bu hücrelerin parlak ve benzer boyutlarda, karanlık olmadan, bu kümelerin merkezlerinde ölmekte olan hücreler bakmak dikkat etmek önemlidir. H?...

Tartışmalar

Diğer organoid modellere benzer şekilde, bu çeşitli uyarılar ile birlikte gelen yapay bir sistemdir. Genel ifade düzeyleri açısından toplu olarak çok az parti olmasına rağmen, bireysel organoidler farklılıklar sergiledi. Örneğin, Sox-2 pozitif alanların yeri her organoidde aynı değildi (Şekil 3). QPCR hücre toplu genel değişiklikleri aramak için uygun olsa da, tek hücreli RNAseq gibi ek teknikler hücre bazında daha fazla bilgi toplamak için gelecekteki çalışmalarda kullanı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814