Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Resumo

Esse protocolo foi gerado como um meio de produzir organoides cerebrais de forma simplificada e de baixo custo sem fatores de crescimento exógenos ou matriz de membrana do porão, mantendo a diversidade de tipos de células cerebrais e muitas características da organização celular.

Resumo

Organoides cerebrais humanos diferenciados de células-tronco embrionárias oferecem a oportunidade única de estudar interações complicadas de múltiplos tipos de células em um sistema tridimensional. Aqui apresentamos um método relativamente simples e barato que produz organoides cerebrais. Neste protocolo, as células-tronco pluripotentes humanas são divididas em pequenos aglomerados em vez de células únicas e cultivadas na mídia básica sem uma matriz de membrana de porão heterologous ou fatores de crescimento exógenos, permitindo que as pistas de desenvolvimento intrínsecas modelem o crescimento organoide. Este sistema simples produz uma diversidade de tipos de células cerebrais, incluindo células gliais e microgliais, células-tronco e neurônios do cérebro, cérebro médio e cérebro traseiro. Organoides gerados a partir deste protocolo também exibem marcas de organização temporal e espacial apropriada demonstrada por imagens de campo brilhante, histologia, imunofluorescência e reação quantitativa quantitativa da cadeia de polimerase em tempo real ( qRT-PCR). Como esses organoides contêm tipos de células de várias partes do cérebro, eles podem ser utilizados para estudar uma infinidade de doenças. Por exemplo, em um artigo recente demonstramos o uso de organoides gerados a partir deste protocolo para estudar os efeitos da hipóxia no cérebro humano. Essa abordagem pode ser usada para investigar uma série de condições de estudo difíceis de estudar, como deficiências neurodesenvolvimentista, distúrbios genéticos e doenças neurológicas.

Introdução

Devido a uma miríade de limitações práticas e éticas, houve muita dificuldade em estudar o cérebro humano. Embora estudos que utilizam roedores tenham sido críticos para nossa compreensão do cérebro humano, o cérebro do rato tem muitas diferenças^1,2. Curiosamente, os camundongos têm uma densidade neuronal que é pelo menos 7 vezes menor que o cérebro primata^3,4. Embora os primatas estejam mais próximos dos humanos do que os roedores do ponto de vista evolutivo, não é prático para a maioria dos pesquisadores trabalhar com eles. O objetivo deste protocolo era recapitular muitas características importantes do cérebro humano usando um método simplificado e menos caro sem a necessidade de uma matriz de membrana de porão heterologous ou fatores de crescimento exógenos, mantendo a diversidade celular cerebral e a organização celular.

O trabalho formativo do laboratório Sasai utilizou a cultura livre de soro do método de corpos embrionários (SFEBq) para gerar tipos de células neuronais bidimensionais bidimensionais de células-tronco sinalizadas (ESCs)^5,6. Muitos métodos organoides cerebrais humanos seguiram um caminho relativamente semelhante das ESCs sinalizadas^7,8. Em contraste, este protocolo começa com clusters de ESCs humanos destacados (HESCs), semelhantes aos passos iniciais do trabalho seminal dos laboratórios Thomson e Zhang antes das etapas de revestimento^9,10, bem como o passo inicial do protocolo organoide cerebral do laboratório Pasca antes da adição de fatores de crescimento exógenos¹¹. Matrizes de membrana do porão (por exemplo, matrigel) têm sido utilizadas em muitos protocolos organoides cerebrais e tem se mostrado um andaime eficaz⁸. No entanto, as matrizes de membrana do porão mais comumente utilizadas não vêm sem complicações, pois copurificam com quantidades desconhecidas de fatores de crescimento com variabilidade em lote a lote durante a produção¹². Além disso, essas matrizes podem complicar a imagem e aumentar o risco de contaminação e custo.

Embora os organoides cerebrais humanos possam ser usados para responder a muitas perguntas, há certas limitações a ter em mente. Por um ano, a partir de células-tronco embrionárias, os organoides se assemelham mais a cérebros imaturos do que cérebros idosos e, como tal, podem não ser modelos ideais para doenças que ocorrem na velhice, como a doença de Alzheimer. Segundo, enquanto nosso protocolo encontrou marcadores de desenvolvimento cerebral, cérebro médio e hindbrain que são úteis para estudar o efeito de um tratamento ou doença em células de múltiplas regiões cerebrais em concerto, outros protocolos podem ser seguidos para se concentrar em regiões cerebrais específicas^13,14. Finalmente, outra limitação dos modelos organoides é a de tamanho, enquanto o comprimento médio de um cérebro humano aproximadamente 167 mm, organoides cerebrais feitos com o uso de agitação crescem até 4 mm⁸ e os organoides formados por este protocolo crescem para 1-2 mm por 10 semanas. No entanto, este protocolo fornece uma ferramenta importante para estudar o tecido cerebral humano e a interação de múltiplos tipos de células.

Protocolo

1. Manutenção de células-tronco

1. Mantenha hESCs em uma camada de fator de crescimento reduzido matriz de membrana do porão (ver a Tabela de Materiais, a partir de agora simplesmente referida como matriz) de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Para revestir uma placa de 6 poços ou um prato de 10 cm, misture 100 μL de matriz com 5,9 mL de meio Águia modificado de Dulbecco (DMEM)/F12. Enrole as placas em filme de parafina e armazene durante a noite a 4°C. Use-as no dia seguinte para passar células depois que o excesso de matriz/mídia é aspirado.
2. Cultura as células semana a semana a aproximadamente uma proporção dividida de 1:12 a cada 7 dias. Mantenha as células usando mídia mTESR-1 em 37 °C, incubadora de baixo oxigênio (5% O_2,5% CO₂). Atualize a mídia diariamente. Eliminaram células diferenciadas da cultura entre passagens usando ferramentas de vidro.
3. As células H9 devem ser passagens de quatro a seis dias antes de utilizá-las para produzir organoides. As células devem ser passagens a aproximadamente uma proporção de 1:8 de aglomerados celulares. Para isso, comece enxaguando as células com mídia DMEM F12 e dissociar as células com protease neutra (por exemplo, dispase, a partir de agora referida simplesmente como protease), enxágue com DMEM/F-12, e placa como 30-60 aglomerados de células em 4 placas (6-well ou 10 cm) em ~20% confluência. Dois dias antes da colheita, a transição para uma incubadora regular (21% O₂, 5% CO₂). As placas devem atingir ~80% de confluência ao iniciar a formação organoide.

2. Dissociação dos ESCs para a Cultura Organoide

1. Aliquot a solução de estoque protease (5 U/mL).
   NOTA: Normalmente congelamos 1 mL aliquots a -20 °C para uso ao longo de vários meses.
2. Diluir a solução de estoque protease para a concentração de trabalho adicionando 1 mL da solução de estoque mais 5 mL de DMEM/F12 para cada placa de 6-well ou 10 cm de hESCs.
3. Aspirar e remover a mídia da cultura celular, em seguida, cubra os hESCs com a solução protease. Coloque placas na incubadora por 10-15 min ou até que as bordas das colônias se recomam e comecem a se separar da matriz.
4. Incline a placa, aspirar a solução protease e lave delicadamente as células com DMEM/F12 três vezes. Use 2 mL/bem para cada lavagem ao usar uma placa de 6 poços e 6 mL ao usar uma placa de 10 cm. Certifique-se de que as colônias permaneçam presas à matriz ao realizar este passo.
5. Adicione cerca de 1,5 mL de mídia mTESR fresca a cada poço (ou 5 mL para uma placa de 10 cm) e lave as células da placa usando tubulação suave.
6. Usando uma pipeta de 10 mL, gentilmente aspirado e dispense hESC dentro da placa até atingir aproximadamente 1/30^th de seu tamanho original. Os aglomerados de colônias devem se assemelhar a praças de tamanho de ~250-350 μm na conclusão dessas etapas.

3. Geração de Organoides

1. Transferir células para um único frasco T75 de fixação ultra-baixa contendo 30 mL de mídia mTESR sem fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF).
2. No dia seguinte, incline o frasco de tal forma que as células ao vivo se agrupam no canto (isso pode levar de 5 a 10 min no primeiro dia, mas vai ficar mais rápido à medida que os aglomerados ficam maiores).
   NOTA: Se houver um grande número de células que aderiram ao fundo do frasco nesta etapa ou quaisquer etapas subsequentes, transfira as células para um novo frasco. É normal ter uma alta população de células mortas nos dois primeiros dias. Ao realizar mudanças na mídia, certifique-se de remover o máximo possível de detritos celulares.
3. Uma vez que as células se instalem, aspiram a mídia e células mortas deixando cerca de 10 mL de mídia contendo as células vivas.
4. Adicione ~20 mL de mídia bFGF baixa (DMEM/F12 complementado com 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamina, 1x NEAA, 0,05% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1 mM monothioglicerol (MTG) complementado com 30 ng/mL bFGF).
5. Verifique as celas no dia 2. Se a maioria das células parecer saudável e brilhante, não há necessidade de fazer nada. No entanto, se mais de um terço das células parecerem escuras, substitua a mídia (usando a mesma técnica de inclinação da etapa 3.2) por ~20 mL de mídia bFGF baixa complementada com 20 ng/mL bFGF.
6. No dia 3, substitua metade da mídia (usando a técnica de inclinação na etapa 3.2) por 20 mL de mídia bFGF baixa complementada com 10 ng/mL bFGF.
7. No dia 5, substitua metade do meio (usando a técnica de inclinação na etapa 3.2) por 20 mL de mídia de indução neural (NIM: DMEM/F12, suplemento 1x N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin).
   NOTA: Se houver grandes aglomerados de células ou organoides muito maiores que os outros, eles devem ser removidos da cultura. O tamanho é estimado pela aparência o microscópio; por exemplo, usando um oftalmologista com retícula. A maioria dos organoides são de tamanho similar (cerca de 100 ± 20 μm). Removemos organoides que eram aproximadamente 2x menores ou maiores que os outros.
8. Substitua metade do meio (~15 mL) (usando a técnica de inclinação) por NIM a cada dois dias.
9. Após 3 semanas na cultura, adicione 100x penicilina/estreptomia à mídia (NIM: DMEM/F12, suplemento 1x N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) em uma concentração final de 1x se desejar. Atualize a mídia a cada dois dias.
   NOTA: Dessa forma, mantivemos os organoides por até 6 meses na cultura.

4. Extração e Preparação do RNA

1. Extrair suavemente aproximadamente 15 organoides (dependendo do tamanho) do frasco usando uma pipeta de 10 mL e coloque em um tubo de 1,5 mL.
   1. Desmonte delicadamente os organoides na centrífuga (200 x g por 1 min), e enxágue com 1x PBS (DPBS) de Dulbecco três vezes.
2. Extrair RNA utilizando sistema ou protocolo validado (por exemplo, kit RNeasy).
3. Meça o valor de densidade óptica de cada amostra em 260 e 280 nm.
4. Prepare o cDNA usando um sistema ou protocolo validado (por exemplo, kit de síntese de cDNA iScript).
5. Executar qRT-PCR usando primers pré-validados (Tabela 1) incluindo pelo menos um gene de limpeza.

5. Imunohistoquímica

1. Fixação
   1. Prepare uma solução de 4% paraformaldeído (PFA) e coloque-a em 4°C.
   2. Usando uma navalha estéril, corte a ponta de uma pipeta de transferência estéril.
   3. Extrair organoides suavemente usando a pipeta de transferência de corte, pois eles podem ser facilmente separados, especialmente quando crescem grandes, e colocá-los em uma placa de 6 poços com mídia adicional ou DPBS.
   4. Incline a placa, aspirar a mídia e substituir por 1x DPBS. Enxágüe as células com 1x DPBS duas vezes adicionais.
   5. Substitua o DPBS por 4% de solução PFA e coloque em um shaker a 4 °C.
      NOTA: Enquanto fixamos por 2 dias (para pequenos organoides) a 7 dias (para organoides >3 meses), os tempos mais curtos (por exemplo, 16-24 h) também podem ser possíveis.
   6. Prepare 30%, 20% e 10% soluções de sacarose na DPBS.
   7. Após fixação na PFA, substitua com a solução de sacarose de 10% e coloque em um shaker a 4 °C por 24 h.
   8. Substitua a sacarose de 10% por 20% de sacarose e coloque em um shaker a 4 °C por 24 h.
   9. Substitua a sacarose de 20% por 30% de sacarose e coloque em um shaker a 4 °C por 24 h.
2. Seções congeladas
   1. Prepare uma camada plana de gelo seco e coloque um molde de plástico rotulado em cima dele.
   2. Despeje uma fina camada de média de temperatura de corte ideal (OCT) no molde e deixe-a começar a endurecer (dentro de alguns segundos).
   3. Coloque alguns organoides na parte superior do OCT no molde usando uma pipeta de transferência com a ponta cortada e preste muita atenção à localização dos organoides.
   4. Adicione lentamente em OUT até que o molde esteja cheio e os organoides estejam cobertos. Deixe endurecer completamente por mais 10 min.
      NOTA: Embora o congelamento de mais de 10 min ajude a garantir a colocação relativa ideal de múltiplos organoides para secagem, é possível usar uma mistura de gelo seca de etanol ou nitrogênio líquido para congelar mais rapidamente.
   5. Marque a localização relativa dos organoides com um marcador para facilitar a localização deles ao cortar.
   6. Coloque os moldes em uma bolsa ou caixa e armazene a -80 °C até ficar pronto para cortar as seções.
   7. Usando um criostat, corte seções de 10 μm e coloque o tecido em lâminas rotuladas e carregadas positivamente.
3. Mancha
   1. Prepare a solução de bloqueio (0,3% Triton X-100, 4% do soro de burro normal na PBS).
   2. Use uma caneta hidrofóbica para desenhar ao redor do perímetro do tecido.
   3. Enxágüe os slides com PBS 3 vezes por 5 min cada.
   4. Substitua o PBS por solução de bloqueio por 1h à temperatura ambiente.
   5. Substitua a solução de bloqueio por solução de anticorpos (anticorpo em concentração adequada, 0,1% Triton X-100, 4% de soro de burro normal na PBS) a 4 °C durante a noite.
   6. No dia seguinte, lave o slide 3 vezes com PBS por 10 min cada.
   7. Substitua o PBS pelo anticorpo secundário apropriado (na concentração apropriada) diluído na solução de anticorpos por 1h à temperatura ambiente.
   8. Enxágüe 3 vezes por 10 min cada vez com 1x PBS.
   9. Aplique a mancha de 4',6-diamidino-2-phenillindole (DAPI) e enxágue três vezes por 10 min cada com 1x PBS.
   10. Os covers afixos para a frente dos slides com solução de montagem, deixem secar à temperatura ambiente no escuro, e armazenem no escuro a 4 °C.

Resultados

A Figura 1 mostra imagens representativas de campo brilhante de vários pontos de tempo para demonstrar como são as células/organoides ao longo dos diferentes estágios do protocolo. Os hESCs foram removidos da placa de cultura do tecido, quebrados em pequenos pedaços, e colocados em um frasco de fixação ultra-baixo T75 onde formavam esferas. É importante notar que as células parecem brilhantes e semelhantes em tamanho, sem células escuras e moribundas nos centros desses aglomerados....

Discussão

Semelhante a outros modelos organoides, este é um sistema artificial que vem com várias ressalvas. Embora houvesse pouca variação de lote a lote em termos de níveis gerais de expressão, organoides individuais apresentaram diferenças. Por exemplo, a localização das áreas positivas Sox-2 não era idêntica em cada organoide(Figura 3). Embora o qPCR seja adequado para procurar mudanças globais em lotes de células, técnicas adicionais como a RNAseq de célula única serão utilizadas em estudos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814