Une méthode statique auto-dirigée pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Résumé

Ce protocole a été généré comme un moyen de produire des organoïdes cérébraux d’une manière simplifiée et peu coûteuse sans facteurs de croissance exogènes ou matrice de membrane de sous-sol tout en maintenant la diversité des types de cellules cérébrales et de nombreuses caractéristiques de l’organisation cellulaire.

Résumé

Les organoïdes du cerveau humain différenciés des cellules souches embryonnaires offrent l’occasion unique d’étudier des interactions compliquées de plusieurs types de cellules dans un système tridimensionnel. Ici nous présentons une méthode relativement simple et peu coûteuse qui donne des organoïdes de cerveau. Dans ce protocole, les cellules souches pluripotentes humaines sont divisées en petits groupes au lieu de cellules simples et cultivées dans des médias de base sans matrice hétérologue de membrane de sous-sol ou facteurs de croissance exogènes, permettant aux indices développementaux intrinsèques de façonner le croissance de l’organoïde. Ce système simple produit une diversité de types de cellules cérébrales, y compris les cellules gliales et microgliales, les cellules souches et les neurones du cerveau avant, du cerveau moyen et du cerveau postérieur. Les organoïdes générés à partir de ce protocole présentent également des caractéristiques d’organisation temporelle et spatiale appropriée démontrées par des images de champ lumineux, l’histologie, l’immunofluorescence et la réaction en chaîne quantitative de transcription inverse en temps réel de polymérase de polymérase ( qRT-PCR). Parce que ces organoïdes contiennent des types de cellules de diverses parties du cerveau, ils peuvent être utilisés pour étudier une multitude de maladies. Par exemple, dans un article récent, nous avons démontré l’utilisation d’organoïdes générés par ce protocole pour étudier les effets de l’hypoxie sur le cerveau humain. Cette approche peut être utilisée pour étudier un éventail de conditions autrement difficiles à étudier telles que les handicaps neurodéveloppementaux, les troubles génétiques et les maladies neurologiques.

Introduction

En raison d’une myriade de limitations pratiques et éthiques, il y a eu beaucoup de difficulté à étudier le cerveau humain. Alors que les études utilisant des rongeurs ont été essentiels à notre compréhension du cerveau humain, le cerveau de la souris a de nombreuses différences^1,2. Fait intéressant, les souris ont une densité neuronale qui est au moins 7 fois moins que le cerveau des primates^3,4. Bien que les primates soient plus proches des humains que des rongeurs d’un point de vue évolutif, il n’est pas pratique pour la plupart des chercheurs de travailler avec eux. Le but de ce protocole était de récapituler beaucoup de dispositifs importants du cerveau humain utilisant une méthode simplifiée et moins chère sans avoir besoin d’une matrice hétérologue de membrane de sous-sol ou de facteurs de croissance exogènes tout en maintenant la diversité de cellules de cerveau et l’organisation cellulaire.

Les travaux de formation du laboratoire Sasai ont utilisé la culture sans sérum des corps embryonnaires (SFEBq) méthode pour générer des types de cellules neuronales à deux et trois dimensions à partir de cellules souches embryonnaires signalisées (ESC)^5,6. Beaucoup de méthodes organoïdes du cerveau humain ont suivi un chemin relativement similaire à partir de CES signalés^7,8. En revanche, ce protocole commence par des grappes d’ESC humains détachés (HESC), semblables aux premières étapes des travaux séminals des laboratoires Thomson et Zhang avant les étapes de placage^9,10 ainsi que l’étape initiale du protocole organoïde du cerveau du laboratoire Pasca avant l’ajout de facteurs de croissance exogènes¹¹. Des matrices de membrane de sous-sol (p. ex., matrigel) ont été utilisées dans de nombreux protocoles organoïdes du cerveau et il a été démontré qu’il s’agit d’un échafaudage efficace⁸. Cependant, les matrices de membrane de sous-sol les plus couramment utilisées ne viennent pas sans complications car elles co-purifie avec des quantités inconnues de facteurs de croissance avec la variabilité de lot à lot pendant la production^12. De plus, ces matrices peuvent compliquer l’imagerie et augmenter le risque de contamination et de coût.

Alors que les organoïdes du cerveau humain peuvent être utilisés pour répondre à de nombreuses questions, il ya certaines limites à garder à l’esprit. D’une part, à partir de cellules souches embryonnaires, les organoïdes ressemblent plus étroitement aux cerveaux immatures qu’aux cerveaux âgés et, en tant que tels, ne sont peut-être pas des modèles idéaux pour les maladies qui surviennent chez la vieillesse, comme la maladie d’Alzheimer. Deuxièmement, alors que notre protocole a trouvé des marqueurs de développement du cerveau antérieur, du cerveau moyen et du cerveau postérieur qui sont utiles pour étudier l’effet d’un traitement ou d’une maladie sur les cellules de plusieurs régions du cerveau de concert, d’autres protocoles peuvent être suivis pour se concentrer sur des régions spécifiques du cerveau^13,14. Enfin, une autre limitation des modèles organoïdes est celle de la taille, alors que la longueur moyenne d’un cerveau humain d’environ 167 mm, les organoïdes cérébraux fabriqués avec l’utilisation de l’agitation poussent jusqu’à 4 mm⁸ et les organoïdes formés par ce protocole se développent à 1-2 mm par 10 semaines. Néanmoins, ce protocole fournit un outil important pour étudier le tissu cérébral humain et l’interaction de plusieurs types de cellules.

Protocole

1. Entretien des cellules souches

1. Maintenir h9 hESCs sur une couche de facteur de croissance a réduit la matrice de membrane de sous-sol (voir le tableau des matériaux, désormais simplement appelé matrice) selon les instructions du fabricant.
   1. Pour enrober une assiette de 6 puits ou un plat de 10 cm, combiner 100 oL de matrice avec 5,9 ml de milieu Eagle modifié (DMEM)/F12 modifié par du dulbecco. Envelopper les assiettes dans un film de paraffine et les conserver toute la nuit à 4 oC. Utilisez-les le lendemain pour passer les cellules après l’excès de matrice / média est aspiré.
2. Culture les cellules semaine après semaine à environ un rapport de 1:12 tous les 7 jours. Maintenir les cellules à l’aide d’un support mTESR-1 dans un incubateur à faible teneur en oxygène de 37 oC (5 % O₂, 5 % CO₂). Rafraîchissez les médias tous les jours. Désherchez les cellules différenciant de la culture entre les passages à l’aide d’outils en verre.
3. Les cellules H9 doivent être passages quatre à six jours avant de les utiliser pour produire des organoïdes. Les cellules doivent être passages à environ un rapport de 1:8 des amas cellulaires. Pour ce faire, commencez par rincer les cellules avec des médias DMEM F12 et dissocier les cellules avec une protéase neutre (par exemple, la dispase, désormais appelée simplement protéase), rincer avec DMEM/F-12, et la plaque comme 30-60 clusters cellulaires sur 4 plaques (6-bien ou 10 cm) à 20% de confluency. Deux jours avant la récolte, les faire passer à un incubateur régulier (21% O₂, 5% CO₂). Les plaques devraient atteindre 80 % de confluence lors du démarrage de la formation d’organoïdes.

2. Dissociation des HESC pour la culture organoïde

1. Aliquot la solution de stock de protéase (5 U/mL).
   REMARQUE : Nous gelons généralement 1 ml d’aliquots à -20 oC pour une utilisation sur plusieurs mois.
2. Diluer la solution de stock de protéase à la concentration de travail en ajoutant 1 ml de la solution de stock plus 5 ml de DMEM/F12 pour chaque plaque de 6 puits ou 10 cm de hESC.
3. Aspirez et supprimez les supports de culture cellulaire, puis couvrez les HESC avec la solution de protéase. Placer les plaques dans l’incubateur pendant 10-15 min ou jusqu’à ce que les bords des colonies se rassemblent et commencent à se séparer de la matrice.
4. Inclinez la plaque, aspirez la solution de protéase et lavez délicatement les cellules avec du DMEM/F12 trois fois. Utilisez 2 ml/puits pour chaque lavage lorsque vous utilisez une plaque de 6 puits et 6 ml lorsque vous utilisez une plaque de 10 cm. Assurez-vous que les colonies restent attachées à la matrice lors de l’exécution de cette étape.
5. Rajoutez environ 1,5 ml de mTESR frais à chaque puits (ou 5 ml pour une plaque de 10 cm) et rincer les cellules de la plaque à l’aide d’un tuyauterie doux.
6. À l’aide d’une pipette de 10 ml, aspirez doucement et distribuez le hESC dans la plaque jusqu’à ce qu’ils atteignent environ 1/30^e de leur taille d’origine. Les grappes de colonies doivent ressembler à des carrés de taille de 250 à 350 m à l’achèvement de ces étapes.

3. Génération d’organoïdes

1. Transférer les cellules dans un seul flacon T75 à attachement ultra-faible contenant 30 ml de mTESR sans facteur de croissance de base du fibroblaste (bFGF).
2. Le lendemain, inclinez le flacon (s) de telle sorte que la piscine de cellules vivantes dans le coin (cela peut prendre 5-10 min le premier jour, mais deviendra plus rapide que les grappes deviennent plus grandes).
   REMARQUE : S’il y a un grand nombre de cellules qui ont adhéré au fond du flacon à cette étape ou à toute étape suivante, transférez les cellules à un nouveau flacon. Il est normal d’avoir une population élevée de cellules mortes pendant les deux premiers jours. Lorsque vous effectuez des changements de médias, assurez-vous d’enlever autant de débris cellulaires que possible.
3. Une fois que les cellules se déposent, aspirez les milieux et les cellules mortes laissant environ 10 ml de milieux contenant les cellules vivantes.
4. Ajouter 20 ml de faible bFGF (DMEM/F12 complété par 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamine, 1x NEAA, 0,05% d’albumine de sérum bovin (BSA), et 0,1 mM monothioglycérol (MTG) complété par 30 ng/mL bGF).
5. Vérifiez les cellules le jour 2. Si la plupart des cellules semblent saines et lumineuses, il n’est pas nécessaire de faire quoi que ce soit. Cependant, si plus d’un tiers des cellules semblent sombres, remplacez le support (en utilisant la même technique d’inclinaison que dans l’étape 3.2) par 20 mL de faible bFGF médias complétés par 20 ng/mL bFGF.
6. Le jour 3, remplacer la moitié du support (en utilisant la technique d’inclinaison à l’étape 3.2) par 20 mL de faible bFGF médias complétés par 10 ng/mL bFGF.
7. Le jour 5, remplacer la moitié du milieu (en utilisant la technique d’inclinaison à l’étape 3.2) par 20 ml de milieu xtronisme à induction neuronale (NIM: DMEM/F12, 1x N2 supplément, 0,1 mM MEM NEAA, 2 'g/mL héparine).
   REMARQUE : S’il y a de grands groupes de cellules ou d’organoïdes qui sont beaucoup plus grands que les autres, ils devraient être retirés de la culture. La taille est estimée par l’apparence sous le microscope; par exemple, à l’aide d’un oculaire avec réticle. La majorité des organoïdes sont de taille similaire (environ 100 à 20 m). Nous avons enlevé les organoïdes qui étaient approximativement 2x plus petits ou plus grands que les autres.
8. Remplacer la moitié du milieu (15 ml) (en utilisant la technique d’inclinaison) par NIM tous les deux jours.
9. Après 3 semaines de culture, ajouter 100x pénicilline/streptomycine aux médias (NIM: DMEM/F12, 1x Supplément N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 'g/mL d’héparine) à une concentration finale de 1x si désiré. Rafraîchissez les médias tous les deux jours.
   REMARQUE: De cette façon, nous avons maintenu les organoïdes pour un jusqu’à 6 mois dans la culture.

4. Extraction et préparation de l’ARN

1. Extraire délicatement environ 15 organoïdes (selon la taille) du flacon à l’aide d’une pipette de 10 ml et placer dans un tube de 1,5 ml.
   1. Pelleter doucement les organoïdes dans la centrifugeuse (200 x g pour 1 min), et rincer avec 1x DUlbecco PBS (DPBS) trois fois.
2. Extraire l’ARN à l’aide d’un système ou d’un protocole validé (p. ex., kit RNeasy).
3. Mesurer la valeur de densité optique de chaque échantillon à 260 et 280 nm.
4. Préparer l’ADNc à l’aide d’un système ou d’un protocole validé (p. ex., kit de synthèse iScript cDNA).
5. Effectuer qRT-PCR à l’aide d’amorces prévalidées (tableau 1) comprenant au moins un gène d’entretien ménager.

5. Immunohistochimie

1. Fixation (Fixation)
   1. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et la placer à 4 oC.
   2. À l’aide d’un rasoir stérile, couper la pointe d’une pipette de transfert stérile.
   3. Extraire délicatement les organoïdes à l’aide de la pipette de transfert de coupe, car ils peuvent être facilement décomposés, surtout quand ils grandissent, et les placer dans une plaque de 6 puits avec des supports supplémentaires ou DPBS.
   4. Inclinez la plaque, aspirez le support et remplacez-le par 1x DPBS. Rincer les cellules avec 1x DPBS deux fois de plus.
   5. Remplacer le DPBS par une solution PFA de 4 % et placer sur un shaker à 4 oC.
      REMARQUE: Alors que nous avons fixé pendant 2 jours (pour les petits organoïdes) à 7 jours (pour les organoïdes '3 mois), des temps plus courts (par exemple, 16-24 h) peuvent également être possibles.
   6. Préparez des solutions de saccharose de 30 %, 20 % et 10 % dans DPBS.
   7. Après fixation en PFA, remplacer par la solution de saccharose à 10% et placer sur un shaker à 4 oC pendant 24 h.
   8. Remplacer le saccharose de 10 % par un saccharose de 20 % et placer sur un shaker à 4 oC pendant 24 h.
   9. Remplacer le saccharose de 20 % par un saccharose de 30 % et placer sur un shaker à 4 oC pendant 24 h.
2. Sections congelées
   1. Préparer une couche plate de glace sèche et placer un moule en plastique étiqueté sur elle.
   2. Verser une fine couche de milieu de coupe optimal (OCT) dans le moule et laisser commencer à durcir (en quelques secondes).
   3. Placez quelques organoïdes sur le dessus de l’OCT dans le moule à l’aide d’une pipette de transfert avec la pointe coupée et portez une attention particulière à l’emplacement des organoïdes.
   4. Ajouter lentement dans OCT jusqu’à ce que le moule est plein et les organoïdes sont couverts. Laisser durcir complètement pendant 10 min supplémentaires.
      REMARQUE : Bien que la congélation de plus de 10 min contribue à assurer un placement relatif idéal de plusieurs organoïdes pour la section, il est possible d’utiliser un mélange de glace sec à l’éthanol ou de l’azote liquide pour geler plus rapidement.
   5. Marquez l’emplacement relatif des organoïdes avec un marqueur pour les rendre plus faciles à trouver lors de la coupe.
   6. Placer les moules dans un sac ou une boîte et les conserver à -80 oC jusqu’à ce qu’ils soient prêts à couper les sections.
   7. À l’aide d’un cryostat, trancher les sections de 10 m et placer le tissu sur des lames étiquetées et chargées positivement.
3. Coloration
   1. Préparer la solution de blocage (0,3% Triton X-100, 4% sérum d’âne normal en PBS).
   2. Utilisez un stylo pap hydrophobe pour dessiner autour du périmètre du tissu.
   3. Rincer les diapositives avec PBS 3 fois pendant 5 min chacune.
   4. Remplacer le PBS par une solution de blocage pendant 1 h à température ambiante.
   5. Remplacez la solution de blocage par une solution d’anticorps (anticorps à concentration appropriée, 0,1 % Triton X-100, 4 % sérum d’âne normal en PBS) à 4 oC pendant la nuit.
   6. Le lendemain, lavez la diapositive 3 fois avec du PBS pendant 10 min chacune.
   7. Remplacer le PBS par l’anticorps secondaire approprié (à la concentration appropriée) dilué dans la solution d’anticorps pendant 1 h à température ambiante.
   8. Rincer 3 fois pendant 10 min à chaque fois avec 1x PBS.
   9. Appliquer la tache de 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et rincer trois fois pendant 10 min chacun avec 1x PBS.
   10. Affix couvre l’avant des glissières avec une solution de montage, laisser sécher à température ambiante dans l’obscurité, et stocker dans l’obscurité à 4 oC.

Résultats

La figure 1 montre des images représentatives de plusieurs points de temps pour démontrer à quoi ressemblent les cellules/organoïdes tout au long des différentes étapes du protocole. Les HESC ont été retirés de la plaque de culture tissulaire, brisés en petits morceaux, et placés dans un flacon d’attachement ultra-bas T75 où ils formaient des sphères. Il est important de noter que les cellules semblent brillantes et similaires dans la taille, sans sombre, cellules mourantes da...

Discussion

Semblable à d’autres modèles organoïdes, il s’agit d’un système artificiel qui vient avec plusieurs mises en garde. Bien qu’il y ait eu peu de variation de lot à lot en termes de niveaux d’expression globaux, les organoïdes individuels ont montré des différences. Par exemple, l’emplacement des zones positives Sox-2 n’était pas identique dans tous les organoïdes (figure 3). Bien que qPCR soit approprié pour rechercher des changements globaux dans des lots de cellules, des techniqu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814