Pruebas de hemocompatibilidad de implantes que contactan con la sangre en un modelo de bucle de flujo que imita el flujo sanguíneo humano

Resumen

Este protocolo describe una evaluación completa de la hemocompatibilidad de los dispositivos de contacto con la sangre mediante implantes neurovasculares cortados por láser. Se aplica un modelo de bucle de flujo con sangre humana fresca y heparinizada para imitar el flujo sanguíneo. Después de la perfusión, se analizan varios marcadores hematológicos y se comparan con los valores obtenidos directamente después de la recolección de sangre para la evaluación de la hemocompatibilidad de los dispositivos probados.

Resumen

El uso creciente de dispositivos médicos (por ejemplo, injertos vasculares, stents y catéteres cardíacos) con fines temporales o permanentes que permanecen en el sistema circulatorio del cuerpo exige un enfoque fiable y multiparamétrico que evalúe las posibles complicaciones hematológicas causadas por estos dispositivos (es decir, la activación y destrucción de los componentes sanguíneos). La prueba integral de hemocompatibilidad in vitro de los implantes que contactan con la sangre es el primer paso hacia una implementación in vivo exitosa. Por lo tanto, un análisis exhaustivo según la Organización Internacional de Normalización 10993-4 (ISO 10993-4) es obligatorio antes de la aplicación clínica. El bucle de flujo presentado describe un modelo sensible para analizar el rendimiento hemostático de los stents (en este caso, neurovascular) y revelar efectos adversos. El uso de sangre entera humana fresca y un muestreo suave de sangre son esenciales para evitar la preactivación de la sangre. La sangre se perfunde a través de un tubo heparinizado que contiene la muestra de ensayo mediante el uso de una bomba peristáltica a una velocidad de 150 ml/min a 37 oC durante 60 min. Antes y después de la perfusión, los marcadores hematológicos (es decir, recuento de células sanguíneas, hemoglobina, hematocrito y marcadores plasmáticos) que indican la activación de leucocitos (polimorfonucleares [PMN]-elastasa), plaquetas (-tromboglobulina [-TG]), el sistema de coagulación (thombin-antitrombina III [TAT]), y la cascada de sc- En conclusión, presentamos un modelo esencial y fiable para extensas pruebas de hemocompatibilidad de stents y otros dispositivos de contacto con la sangre antes de la aplicación clínica.

Introducción

La aplicación in vivo de implantes y biomateriales, que interactúan con la sangre humana, requiere pruebas preclínicas intensas centradas en la investigación de varios marcadores del sistema hemostático. La Organización Internacional de Normalización 10993-4 (ISO 10993-4) especifica los principios centrales para la evaluación de los dispositivos de contacto con la sangre (es decir, stents e injertos vasculares) y considera el diseño del dispositivo, la utilidad clínica y los materiales necesarios¹.

La sangre humana es un líquido que contiene varias proteínas plasmáticas y células, incluyendo leucocitos (glóbulos blancos [WBCs]), eritrocitos (glóbulos rojos [RBR]), y plaquetas, que llevan a cabo funciones complejas en el cuerpo humano². El contacto directo de materiales extraños con la sangre puede causar efectos adversos, como la activación del sistema inmunológico o de coagulación, que puede conducir a inflamación o complicaciones trombóticas y problemas graves después de la implantación^3,4,5. Por lotanto, la validación de la hemocompatibilidad in vitro ofrece una oportunidad antes de la implantación para detectar y excluir cualquier complicación hematológica que pueda inducirse al contacto de la sangre con una superficie extraña^6.

El modelo de bucle de flujo presentado se estableció para evaluar la hemocompatibilidad de stents neurovasculares y dispositivos similares mediante la aplicación de un caudal de 150 ml/min en tubos (diámetro de 3,2 mm) para imitar las condiciones de flujo cerebral y los diámetros de las arterias^2,7. Además de la necesidad de un modelo in vitro óptimo, la fuente de sangre es un factor importante para obtener resultados fiables e inalterados al analizar la hemocompatibilidad de un biomaterial^8. La sangre recogida debe utilizarse inmediatamente después del muestreo para evitar cambios causados por un almacenamiento prolongado. En general, se debe realizar una suave acumulación de sangre sin éxtasis utilizando una aguja de 21 G para minimizar la preactivación de las plaquetas y la cascada de coagulación durante la elaboración de sangre. Además, los criterios de exclusión de los donantes incluyen a aquellos que fuman, están embarazadas, están en mal estado de salud o han tomado anticonceptivos orales o analgésicos durante los 14 días anteriores.

Este estudio describe un modelo in vitro para las extensas pruebas de hemocompatibilidad de implantes de stent en condiciones de flujo. Al comparar stents recubiertos sin recubrimiento con fibrina heparina, los resultados de las pruebas de hemocompatibilidad integrales reflejan una hemocompatibilidad mejorada de los stents recubiertos con fibrina-heparina⁹. Por el contrario, los stents sin recubrimiento inducen la activación de la cascada de coagulación, como lo demuestra un aumento de las concentraciones de thombin-antitrombina III (TAT) y la pérdida de números de plaquetas en sangre debido a la adhesión de plaquetas a la superficie del stent. En general, se recomienda integrar este modelo de hemocompatibilidad como prueba preclínica para detectar cualquier efecto adverso en el sistema hemostático causado por el dispositivo.

Protocolo

El procedimiento de muestreo de sangre fue aprobado por el Comité de ética de la facultad de medicina de la Universidad de Tuebingen (código de identificación del proyecto: 270/2010BO1). Todos los sujetos proporcionados por consentimiento informado y por escrito para su inclusión antes de la participación.

1. Preparación de Monovettes cargados de heparina

1. Mezclar la heparina sin diluir (5.000 UI/ml) con cloruro de sodio (NaCl, 0,9%) solución y preparar una solución con una concentración resultante de 15 UI/ml de heparina.
2. Añadir 900 ml de la solución de heparina diluida a cada monovette neutro (9 ml) para obtener una concentración final de heparina de 1,5 UI/ml después del muestreo de sangre. Preparar tres monovettes por donante más tres monovettes de reserva y almacenar los monovettes cargados de heparina a 4oC hasta el muestreo de sangre.

2. Muestreo de sangre

1. Saque los monovettes cargados de heparina del refrigerador 30 minutos antes del muestreo de sangre.
2. Recoger una muestra de sangre de 27 ml de cada donante sano (n.o 5) por venopunción para el bucle de flujo. Sólo aplicar un torniquete liso para evitar la activación prematura de las plaquetas y la cascada de coagulación de la sangre.
3. Recoger muestras de sangre en tres monovettes que contienen 900 ml de la solución de heparina (1,5 UI/ml) y agrupar los tres monovettes en un recipiente de plástico para garantizar que todos los componentes se distribuyen uniformemente.
4. Transfiera directamente la sangre heparinizada agrupada en tres monovettes diferentes que contienen EDTA (1,2 ml), citrato (1,4 ml) o una mezcla de citrato, teofilina, adenosina y dipyridamole (CTAD, 2,7 ml) para recoger valores basales. Continúe con las muestras como se describe en las secciones 5 a 8.
   NOTA: Para garantizar un comportamiento de coagulación sin influencias, los donantes deben evitar la ingesta de medicamentos que afectan a la hemostasis (por ejemplo, ácido acetilsalicílico, naproxeno y carbenicilina) en los últimos 14 días, así como anticonceptivos orales y tabaquicillos.

3. Preparación del bucle de flujo

1. Cortar tres tubos de cloruro de polivinilo recubiertos de heparina con una longitud de 75 cm y un diámetro interior de 3,2 mm. Cargue los tubos con los implantes neurovasculares cortados con láser con o sin el recubrimiento de fibrina-heparina. Recuerde dejar una bañera descargada como control.
2. Coloque un extremo del tubo en un depósito lleno de NaCl al 0,9%, conecte el tubo al cabezal de la bomba e inserte el otro extremo en un cilindro de medición.
3. Ajuste los ajustes de la bomba peristáltica para lograr un caudal de 150 ml/min utilizando un temporizador mientras comprueba el nivel de llenado en el cilindro de medición.

4. Rendimiento de las pruebas de hemocompatibilidad

1. Utilice una jeringa de 12 ml para llenar los tubos de sangre. Deje que 6 ml de sangre fluyan suavemente en cada tubo que contenga una muestra o un control descargado.
2. Forme un circuito y cierre los tubos firmemente usando una longitud de 0,5 cm de tubo de conexión de silicona. Colocar los tubos en un baño de agua de 37oC e iniciar la perfusión durante 60 min.

5. Análisis de recuento de sangre completa

1. Poner 1,2 ml de sangre después del muestreo (línea de base) o después de la perfusión en un monovette que contenga EDTA e invierta cuidadosamente el tubo 5x.
2. Inserte el monovette en el analizador de sangre y realice un análisis de hemograma para cada muestra. A continuación, incubar las monovettes en hielo durante 15 a 60 minutos después de la medición del hemograma para su posterior análisis, como se describe en la sección 7.

6. Colección de plasma de citrato

1. Llenar los monobetes que contienen citrato con 1,4 ml de sangre (recién dibujado o después de la circulación) e invertir cuidadosamente 5x.
2. Centrifugar los tubos durante 18 min a 1.800 x g a temperatura ambiente (RT). Aliquot tres muestras de 250 ml de la fracción plasmática en tubos de reacción de 1,5 ml y congelar las muestras plasmáticas en nitrógeno líquido. Guárdelos a -20 oC hasta su análisis.

7. Colección de EDTA Plasma

1. Incubar los monovettes en hielo durante 15 a 60 minutos después de la medición del hemograma. A continuación, centrifugar los tubos durante 20 min a 2.500 x g y 4 oC.
2. Alícuota tres muestras de 250 ml de la fracción plasmática en tubos de reacción de 1,5 ml después de la centrifugación y congelar los tubos en nitrógeno líquido. Guárdelos a -80 oC hasta su análisis.

8. Colección de plasma CTAD

1. Llenar los monobetes que contienen la mezcla CTAD con 2,7 ml de sangre (recién dibujado o después de la incubación) e invertir cuidadosamente 5x. Después, incubar los monovettes sobre hielo durante 15 a 60 minutos. A continuación, centrifugar los tubos durante 20 min a 2.500 x g y 4 oC.
2. Transfiera 700 l de la fracción plasmática media a un tubo de reacción de 1,5 ml y centrifugar los tubos de reacción llenos durante 20 min a 2.500 x g y 4 oC.
3. Alícuota dos muestras de 100 ml de la fracción media en tubos de reacción de 1,5 ml después de la centrifugación y congelar los tubos en nitrógeno líquido. Guárdelos a -20 oC hasta su análisis.
   NOTA: La recolección de plasma EDTA y plasma CTAD se puede realizar juntas porque las condiciones de funcionamiento son las mismas.

9. Medición del TAT humano a partir de plasma de citrato

1. Descongelar el plasma citrato en un baño de agua de 37oC.
2. Utilice el kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas TAT (ELISA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Reconstruya las normas de plasma y controle y diluya la solución de lavado, el anticuerpo conjugado con peroxidasa antihumana-TAT (POD) y la solución cromómica. Deje todos los reactivos y la placa de microtíter a RT (15-25 oC) durante 30 minutos antes de iniciar la prueba.
3. Pipet 50 l del tampón de muestra en cada pocal de la placa de microtíter y añadir 50 l del tampón de muestra (en blanco), estándar de plasma, control de plasma y muestra de plasma sin diluir en duplicados a la placa del pozo. Sellar la placa e incubar a 37oC durante 15 min con un suave temblor. A continuación, lave la placa 3x con 300 sal de solución de lavado.
4. Añadir 100 l del anticuerpo anti-humano-TAT conjugado POD a cada poca. Sellar la placa e incubar a 37oC durante 15 min con un suave temblor. A continuación, lave la placa 3x con 300 sal de solución de lavado.
5. Añadir 100 l de la solución de cromógeno recién preparada a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 30 min.
6. Retire la película de sello y agregue 100 sl de solución de tope a cada poca. Lea la densidad óptica (OD) con un fotómetro a 490 a 500 nm. Ajuste los datos de curva estándar como una línea de tendencia y calcule la concentración de las muestras.

10. Medición de PMN-elastasa de Plasma citrato

1. Descongelar el plasma de citrato en un baño de agua a 37 oC.
2. Utilice el kit ELISA polimorfonuclear (PMN)-elastasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante: reconstruya el control de PMN-elastasa y el estándar PMN-elastasa para preparar una curva estándar utilizando el tampón de dilución del kit.
3. Diluir la solución de lavado de acuerdo con la descripción del fabricante. Deje todos los reactivos y la placa de microtíter en RT durante 30 minutos antes de iniciar la prueba. Diluir las muestras de plasma de citrato a 1:100 con el tampón de dilución.
4. Añadir 100 l del tampón de muestra (en blanco), curva estándar PMN-elastasa (15,6 x 1.000 ng/mL), controles de PMN-elastasa (concentraciones altas y bajas) y muestras de plasma diluidas en duplicados a la placa del pozo. Sellar la placa e incubar a RT durante 60 minutos con suave temblor. Después, lave la placa 4x con 300 sal de solución de lavado.
5. Añadir 150 l del anticuerpo conjugado enzimático a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 60 minutos con suave temblor. Después, lave la placa 4x con 300 sal de solución de lavado.
6. Añadir 200 l de la solución de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) a cada pocal. Selle la placa e incubar a RT durante 20 minutos en la oscuridad. A continuación, retire la película de sellado y agregue 50 sl de la solución de tope a cada poca.
7. Lea el OD con un fotómetro a 450 nm con una lectura de referencia a 630 nm. Ajuste los datos de curva estándar como una línea de tendencia y calcule la concentración de las muestras.

11. Medición del Complejo de Complementos terminales (TCC) de EDTA Plasma

1. Descongelar el plasma EDTA en un baño de agua a 37 oC y almacenar en hielo después de la descongelación.
2. Utilice el kit ELISA en cascada de complemento SC5b-9 de acuerdo con las instrucciones del fabricante: diluir la solución de lavado tal como se describe en el protocolo del fabricante. Deje todos los reactivos y la placa de microtíter en RT durante 30 minutos antes de iniciar la prueba. Diluir las muestras de plasma EDTA a 1:10 con el tampón de dilución del kit.
3. Añadir 300 l de solución de lavado a cada pocal para rehidratar la superficie y aspirar después de 2 min. Añadir 100 l del tampón de muestra (en blanco), estándares SC5b-9, controles SC5b-9 (altas y bajas concentraciones), y las muestras de plasma diluidas en duplicados a la placa del pozo.
4. Sellar la placa e incubar a RT durante 60 min. A continuación, lave la placa 5x con 300 sal de solución de lavado.
5. Añadir 50 éL del anticuerpo conjugado enzimático a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 30 min. A continuación, lave la placa 5x con 300 sal de solución de lavado.
6. Añadir 100 l de la solución de sustrato TMB a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 15 minutos en la oscuridad.
7. Retire la película de sello y agregue 100 s de la solución de tope a cada poca. Lea el OD con un fotómetro a 450 nm. Ajuste los datos de curva estándar como una línea de tendencia y calcule la concentración de las muestras.

12. Medición de la tromboglobulina de CTAD Plasma

1. Descongelar el plasma CTAD en un baño de agua a 37 oC.
2. Utilice el kit ELISA de la tromboglobulina de conformidad con las instrucciones del fabricante: reconstruya el control de la TG y el estándar de la TG y diluya la solución de lavado utilizando H₂O. Reconstruir el anticuerpo conjugado POD utilizando el tampón de fosfato proporcionado. Deje todos los reactivos y la placa de microtíter en RT durante 30 minutos antes de iniciar la prueba.
3. Prepare la curva estándar y el control de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el tampón de fosfato proporcionado. Diluir las muestras de plasma CTAD a 1:21.
4. Añadir 200 l del tampón de fosfato (en blanco), los estándares de TG, los controles de TG (altas y bajas concentraciones) y las muestras de plasma diluidas en duplicados a la placa del pozo. Sellar la placa e incubar a RT durante 60 min. Después, lavar la placa 5x con 300 sl de solución de lavado.
5. Añadir 200 l del anticuerpo conjugado enzimático a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 60 min. Después, lavar la placa 5x con 300 sl de solución de lavado.
6. Añadir 200 l de la solución de sustrato TMB a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 5 minutos en la oscuridad. Retire la película de sello y detenga la reacción añadiendo 50 ml de ácido sulfúrico de 1 M (H₂SO₄) a cada poca.
7. Deje la placa durante 15 a 60 minutos y, a continuación, lea el OD con un fotómetro a 450 nm. Ajuste los datos de curva estándar como una línea de tendencia y calcule la concentración de las muestras.

13. Preparación de muestras para escanear microscopía electrónica

1. Retire el implante del tubo con fórceps y enjuague brevemente el implante sumergiéndolo en una solución de NaCl al 0,9% 3 veces.
2. Conservar en solución de glutaraldehyde (2% glutaraldehyde en solución salina con fosfato [PBS-buffer sin Ca²⁺/Mg²⁺]) durante la noche a 4oC.
3. A continuación, incubar los implantes en PBS-buffer durante 10 min. Deshidratar las muestras incubando en etanol con concentración creciente durante 10 min cada una: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, y 100%. Almacene las muestras deshidratadas en etanol 100% hasta que se pueda seguir analizando.
4. Realizar el secado de punto crítico de acuerdo con las instrucciones del dispositivo de secado o la literatura¹⁰ justo antes de escanear la microscopía electrónica (SEM).

14. Microscopía electrónica de barrido

1. Fije los implantes secos a un portador de muestra para el microscopio de exploración y saltee las muestras con paladio dorado.
2. Introducir los implantes sputtered en la cámara de muestra. Tome fotografías en aumento de 100, 500, 1.000 y 2.500 veces de las áreas con la adhesión representativa de la superficie y la célula.

Resultados

Brevemente resumido, la sangre entera humana se recogió en monovettes cargados de heparina y luego se agruparon y se utilizaron para evaluar los niveles basales de recuento celular, así como los marcadores de hemocompatibilidad plasmática.

Posteriormente, se llenó el tubo que contiene las muestras de implante sneurovascular, y la sangre se perfundió durante 60 minutos a 150 ml/min y 37 oC utilizando una bomba peristáltica. Una vez más, se analizó el número de células en todos los gru...

Discusión

El protocolo presentado describe un método completo y confiable para la prueba de hemocompatibilidad de implantes que contactan la sangre de acuerdo con la ISO 10993-4 en un modelo de flujo de cizallamiento que imita el flujo sanguíneo humano. Este estudio se basa en la prueba de implantes neurovasculares cortados por láser, pero se puede realizar con una variedad de muestras. Los resultados demuestran que este método permite el análisis amplio de diversos parámetros como el recuento de células sanguíneas, la pre...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
aqua ad iniectabilia	Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany	1088813
beta-TG ELISA	Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany	00950
Centrifuge Rotana 460 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany	-
Citrat monovettes (1.4 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	6,16,68,001
CTAD monovettes (2.7 mL)	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	367562
EDTA monovettes (1.2 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	6,16,62,001
Ethanol p.A. (1000 mL)	AppliChem, Darmstadt, Germany	1,31,08,61,611
Glutaraldehyde (25 % in water)	SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany	23114.01
Heparin coating for tubes	Ension, Pittsburgh, USA	-
Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)	LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany	PZN 15261203
Multiplate Reader Mithras LB 940	Berthold, Bad Wildbad, Germany	-
NaCl 0,9%	Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany	1312813
Neutral monovettes (9 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	2,10,63,001
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	70011044
Peristaltic pump ISM444B	Cole Parmer, Wertheim, Germany	3475
Pipette (100 µL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	3124000075
Pipette (1000 µL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	3123000063
Plastic container (100 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	7,55,62,300
PMN-Elastase ELISA	Demeditec Diagnostics, Kiel Germany	DEH3311
Polyvinyl chloride tube	Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France	-
Reaction Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	30123328
neurovascular laser-cut implants	Acandis GmbH, Pforzheim	01-0011x
SC5b-9 ELISA	TECOmedical, Buende, Germany	A029
Scanning electron microscope	Cambridge Instruments, Cambridge, UK	-
Sealing tape (96 well plate)	Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15036
Syringe 10/12 mL Norm-Ject	Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany	10080010
TAT micro kit	Siemens Healthcare, Marburg, Germany	OWMG15
Waterbath Type 1083	Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany	-