인간의 혈류를 모방하는 흐름 루프 모델에서 혈액 접촉 임플란트의 혈적합성 테스트

요약

이 프로토콜은 레이저 컷 신경 혈관 임플란트를 사용하여 혈액 접촉 장치의 포괄적 인 혈전 성 평가를 설명합니다. 신선한, 헤파린화 인간의 혈액과 흐름 루프 모델은 혈류를 모방하기 위해 적용됩니다. 관류 후, 다양한 혈액학적 마커를 분석하고 시험된 장치의 혈적합성 평가를 위해 혈액 수집 직후 얻은 값과 비교한다.

초록

신체의 순환 계통에 남아 있는 일시적 또는 영구적 목적을 위해 의료 기기(예: 혈관 이식편, 스텐트 및 심장 카테터)의 사용이 증가함에 따라 이러한 장치(즉, 혈액 구성 요소의 활성화 및 파괴)로 인한 가능한 혈액학적 합병증을 평가하는 신뢰할 수 있고 다중파라메트릭 접근법이 필요합니다. 혈액 접촉 임플란트의 포괄적인 체외 혈우적합성 검사는 생체 내 성공적인 구현을 향한 첫 번째 단계입니다. 따라서 국제표준화기구(ISO 10993-4)에 따른 광범위한 분석은 임상 적용 전에 필수적이다. 제시된 흐름 루프는 스텐트의 지혈 성능을 분석하고(이 경우 신경혈관) 부작용을 드러내는 민감한 모델을 설명합니다. 신선한 인간의 전혈과 부드러운 혈액 샘플링의 사용은 혈액의 사전 활성화를 피하기 위해 필수적이다. 혈액은 60 분 동안 37 °C에서 150 mL / min의 속도로 연동 펌프를 사용하여 시험편을 포함하는 헤파린화 튜브를 통해 관류된다. 관류 전후, 혈액학적 마커(즉, 혈액 세포 수, 헤모글로빈, 헤마토크리트 및 혈장 마커)의 활성화를 나타내는 백혈구(다형성핵[PMN]-엘라스타제), 혈소판(β-트롬보글로불린[β-TG]), 응고 시스템(톰빈-항트롬빈 III [TAT]), 및 상보(SCb)의 상호작용(SCb)이 분석된다. 결론적으로, 우리는 임상 적용 전에 스텐트 및 기타 혈액 접촉 장치의 광범위한 혈우적합성 테스트를 위한 필수적이고 신뢰할 수 있는 모델을 제시합니다.

서문

인간의 혈액과 상호 작용하는 임플란트 및 생체 재료의 생체 내 응용 프로그램은 지혈 시스템의 다양한 마커의 조사에 초점을 맞춘 강렬한 전임상 테스트가 필요합니다. 국제표준화기구(ISO 10993-4)는 혈액 접촉 장치(즉, 스텐트 및 혈관 이식편)의 평가를 위한 핵심 원칙을 명시하고 장치 설계, 임상 적 유용성 및 필요한 물질을 고려합니다^1.

인간의 혈액은 백혈구(백혈구[WBC]), 적혈구(적혈구[RBC]) 및 혈소판을 포함하는 다양한 혈장 단백질 및 세포를 포함하는 유체이며, 이는 인체에서 복잡한 기능을 수행한다^2. 혈액과 이물질의 직접적인 접촉은 면역 또는 응고 시스템의 활성화와 같은 부작용을 일으킬 수 있으며, 이는 이식 후 염증 또는 혈전 합병증 및 심각한 문제로 이어질 수 있습니다^3,4,5. 따라서, 시험관내 혈적합성 검증은 이식 전에 외래 표면과의 혈액 접촉시 유도될 수 있는 임의의 혈액학적 합병증을 검출하고 배제할 수 있는 기회를 제공한다^6.

제시된 플로우 루프 모델은 뇌유동 조건 및 동맥^직경을모방하기 위해 튜브(직경 3.2 mm)에 150 mL/min의 유량을 적용하여 신경혈관 스텐트 및 유사한 장치의 혈적합성을 평가하기 위해 설립되었다^2,7. 생체외 에서 최적 모형을 위한 필요 이외에, 혈액의 근원은 생체 재료의 혈적합성을 분석할 때 믿을 수 있고 변경되지 않은 결과를 얻기에 있는 중요한 요인^8입니다. 수집 된 혈액은 장기간 저장으로 인한 변화를 방지하기 위해 샘플링 후 즉시 사용해야합니다. 일반적으로, 21 G 바늘을 사용하여 정지없이 혈액의 부드러운 수집은 혈액 드로잉 동안 혈소판 과 응고 캐스케이드의 사전 활성화를 최소화하기 위해 수행되어야한다. 또한, 기증자 배제 기준은 담배를 피우거나, 임신 중이거나, 건강상태가 좋지 않거나, 지난 14일 동안 경구 피임약이나 진통제를 복용한 사람들을 포함합니다.

본 연구는 유동 조건하에서 스텐트 임플란트의 광범위한 혈우병 성 테스트를 위한 시험관내 모델을 설명합니다. 피브린 헤파린 코팅 스텐트와 코팅되지 않은 스텐트를 비교할 때, 포괄적인 혈우적합성 테스트 결과는 피브린 헤파린 코팅 스텐트의 향상된 혈호환성을 반영합니다^9. 대조적으로, 코팅되지 않은 스텐트는 혈소판이 스텐트 표면에 부착되기 때문에 톰빈-항트롬빈 III(TAT) 농도의 증가 및 혈소판 수의 손실에 의해 입증된 바와 같이 응고 캐스케이드의 활성화를 유도한다. 전반적으로, 전임상 시험으로 이 혈적합성 모형을 통합하는 것은 장치에 기인하는 지혈시스템에 어떤 불리한 효력든지 검출하기 위하여 추천됩니다.

프로토콜

혈액 샘플링 절차는 Tuebingen 대학의 의학 교수의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (프로젝트 식별 코드 : 270/2010BO1). 모든 과목은 참여 하기 전에 포함에 대 한 서면, 통보 된 동의를 제공.

1. 헤파린로드 모노베트의 준비

1. 희석되지 않은 헤파린(5,000 IU/mL)과 염화나트륨(NaCl, 0.9%)을 섞는다. 헤파린의 15 IU / mL의 결과 농도와 용액을 준비합니다.
2. 희석된 헤파린 용액900 μL을 각 중성 모노베트(9 mL)에 첨가하여 혈액 샘플링 후 1.5 IU/mL의 최종 헤파린 농도를 얻습니다. 기증자 당 3 개의 모노벳과 3 개의 예비 모노벳을 준비하고 혈액 샘플링 될 때까지 4 °C에서 헤파린로드 모노벳을 보관하십시오.

2. 혈액 샘플링

1. 혈액 샘플링 30분 전에 헤파린이 장착된 모노벳을 냉장고에서 꺼내십시오.
2. 유동 루프에 대한 정맥천체에 의해 각 건강한 공여자(n=5)로부터 27 mL 혈액 샘플을 수집한다. 혈소판과 혈액 응고 캐스케이드의 조기 활성화를 피하기 위해 부드러운 지혈대를 적용하십시오.
3. 헤파린 용액(1.5 IU/mL)의 900μL을 함유한 3개의 모노벳에 혈액 샘플을 수집하고 모든 구성 요소가 고르게 분포되도록 하나의 플라스틱 용기에 세 개의 모노벳을 모두 풀링합니다.
4. EDTA (1.2 mL), 구연산염 (1.4 mL) 또는 구연산염, 테오필린, 아데노신 및 디피리다몰 (CTAD, 2.7 mL)을 포함하는 세 가지 다른 모노벳으로 풀링 된 헤파린 혈액을 직접 전달하여 기준값을 수집합니다. 섹션 5-8에 설명된 대로 샘플을 진행합니다.
   참고: 영향을 받지 않는 응고 행동을 보장하기 위해, 기증자는 지난 14일 이내에 지혈에 영향을 미치는 약물(예: 아세틸살리실산, 나프록센 및 카르베니실린)의 섭취와 경구 피임약 및 흡연을 피해야 합니다.

3. 흐름 루프의 준비

1. 75cm의 길이와 3.2 mm의 내경3.2mm의 헤파린 코팅 폴리 염화 비닐 튜브 를 잘라. 피브린 헤파린 코팅유무에 관계없이 신경 혈관 레이저 컷 임플란트로 튜브를적재하십시오. 하나의 욕조를 컨트롤로 언로드한 상태로 두는 것을 기억하십시오.
2. 튜브의 한쪽 끝을 0.9% NaCl으로 채워진 저장소에 놓고 튜브를 펌프 헤드에 연결하고 다른 쪽 끝을 측정 실린더에 삽입합니다.
3. 측정 실린더의 충진 레벨을 확인하면서 타이머를 사용하여 연동 펌프의 설정을 조정하여 150mL/min의 유량을 달성합니다.

4. 혈정비 테스트의 성능

1. 12 mL 주사기를 사용하여 튜브를 혈액으로 채웁니다. 6 mL의 혈액이 샘플 또는 언로드 된 대조군을 포함하는 각 튜브로 원활하게 흐르게하십시오.
2. 0.5 cm 길이의 실리콘 연결 튜브를 사용하여 회로를 형성하고 튜브를 단단히 닫습니다. 튜브를 37 °C의 수조에 놓고 60 분 동안 관류를 시작합니다.

5. 전혈수 분석

1. 샘플링 후 (기준선) 또는 PERFUSION 후 EDTA를 포함하는 모노벳에 1.2 mL의 혈액을 넣고 조심스럽게 튜브를 5x 반전시다.
2. 모노벳을 혈액 분석기에 삽입하고 모든 샘플에 대한 혈액 수 분석을 수행합니다. 이어서, 섹션 7에 기재된 바와 같이, 추가 분석을 위해 혈액 수 측정 후 15-60분 동안 얼음 상에 모노벳을 배양한다.

6. 시산염 플라즈마의 컬렉션

1. 구연산염이 들어있는 모노벳을 1.4 mL의 혈액 (갓 뽑은 또는 순환 후)으로 채우고 조심스럽게 5 x를 반전시다.
2. 실온(RT)에서 1,800 x g에서 18분 동안 튜브를 원심분리합니다. 1.5 mL 반응 튜브로 플라즈마 분획의 세 250 μL 샘플을 Aliquot 액체 질소에서 플라즈마 샘플을 동결. 분석전까지 -20°C에서 보관하십시오.

7. EDTA 플라즈마의 컬렉션

1. 혈액 수 측정 후 15-60 분 동안 얼음에 모노벳을 배양하십시오. 이어서, 튜브를 2,500 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리한다.
2. Aliquot 3 250 μL 시료의 플라즈마 분획을 원심분리 후 1.5 mL 반응 튜브로 넣고 액체 질소에서 튜브를 동결시다. 분석전까지 -80°C에서 보관하십시오.

8. CTAD 플라즈마의 컬렉션

1. CTAD 혼합물을 함유한 모노벳을 2.7 mL의 혈액(갓 뽑은 또는 배양 후)으로 채우고 조심스럽게 5x를 반전시다. 그 후, 모노벳을 얼음 위에 15-60분 동안 배양합니다. 이어서, 튜브를 2,500 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리한다.
2. 중간 플라즈마 분획의 700 μL을 1.5 mL 반응 튜브로 옮기고 2,500 x g 및 4°C에서 20분 동안 충전된 반응 튜브를 원심분리합니다.
3. 알리쿼트 원심분리 후 중간 분획의 2개의 100 μL 샘플을 1.5 mL 반응 튜브로 넣고 액체 질소에서 튜브를 동결하였다. 분석전까지 -20°C에서 보관하십시오.
   참고: 작동 조건이 동일하기 때문에 EDTA 플라즈마 및 CTAD 플라즈마의 수집은 함께 수행될 수 있습니다.

9. 시산염 플라즈마에서 인간 TAT의 측정

1. 37 °C의 수조에서 구연산염 플라즈마를 해동합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 TAT 효소 연결 면역 흡착 분석(ELISA) 키트를 사용하십시오. 플라즈마 표준을 재구성하고 세척 용액, 항 인간-TAT 퍼옥시다아제(POD)-컨쥬게이트 항체 및 크로모겐 용액을 제어 및 희석한다. 테스트를 시작하기 전에 모든 시약과 마이크로티터 플레이트를 RT(15−25°C)에 30분 동안 둡니다.
3. 시료 완충액의 50 μL을 마이크로티터 플레이트의 각 웰내로 넣고 샘플 버퍼(blank), 플라즈마 표준, 플라즈마 제어 및 원액 플라즈마 시료를 50 μL을 웰 플레이트에 복제하여 첨가한다. 접시를 밀봉하고 37 °C에서 15 분 동안 부드럽게 흔들어 서 배양하십시오. 그런 다음 300 μL의 세척 용액으로 플레이트를 3x 세척하십시오.
4. POD-공액된 항-인간-TAT 항체의 100 μL을 각각의 웰에 첨가한다. 접시를 밀봉하고 37 °C에서 15 분 동안 부드럽게 흔들어 서 배양하십시오. 그런 다음 300 μL의 세척 용액으로 플레이트를 3x 세척하십시오.
5. 갓 제조된 염색체 용액의 100 μL을 각 우물에 첨가한다. 접시를 밀봉하고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
6. 씰 필름을 제거하고 각 웰에 100 μL의 스톱 용액을 추가합니다. 490-500 nm에서 광도계로 광학 밀도 (OD)를 읽으십시오. 표준 곡선 데이터를 추세선으로 맞추고 샘플의 농도를 계산합니다.

10. 시산염 플라즈마에서 PMN-엘라타아제 의 측정

1. 37 °C에서 수조에서 구연산염 플라즈마를 해동.
2. 제조업체의 지침에 따라 다형성 핵(PMN)-엘라스타제 ELISA 키트를 사용하십시오: 키트의 희석 버퍼를 사용하여 표준 곡선을 준비하기 위해 PMN-엘라스타제 제어 및 PMN-엘라스타아제 표준을 재구성합니다.
3. 제조업체의 설명에 따라 세척 용액을 희석하십시오. 테스트를 시작하기 전에 모든 시약과 마이크로티터 플레이트를 RT에 30분 동안 둡니다. 희석 완충액으로 구연산염 혈장 샘플을 1:100으로 희석합니다.
4. 시료 버퍼(블랭크), PMN-엘라타아제 표준 곡선(15.6-1,000 ng/mL), PMN-엘라스타아제 제어(고농도 및 저농도) 및 희석된 플라즈마 샘플을 웰 플레이트에 100 μL을 추가합니다. 접시를 밀봉하고 부드러운 흔들림으로 60 분 동안 RT에서 배양하십시오. 그 후, 300 μL의 세척 용액으로 플레이트를 4x 로 씻으십시오.
5. 각 우물에 효소 공액 항체의 150 μL을 추가합니다. 접시를 밀봉하고 부드러운 흔들림으로 60 분 동안 RT에서 배양하십시오. 그 후, 300 μL의 세척 용액으로 플레이트를 4x 로 씻으십시오.
6. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)-기판 용액의 200 μL을 각 우물에 추가합니다. 접시를 밀봉하고 어둠 속에서 20 분 동안 RT에서 배양하십시오. 이어서, 씰 필름을 제거하고 각 웰에 50 μL의 스톱 용액을 첨가한다.
7. 630 nm에서 참조 판독과 450 nm에서 포토미터와 OD를 읽어보십시오. 표준 곡선 데이터를 추세선으로 맞추고 샘플의 농도를 계산합니다.

11. EDTA 플라즈마에서 터미널 보완 복합체 (TCC) 측정

1. EDTA 플라즈마를 37°C의 수조에서 해동하고 해동 후 얼음에 보관합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 보체 캐스케이드 SC5b-9 ELISA 키트를 사용하십시오: 제조업체의 프로토콜에 설명된 대로 세척 용액을 희석하십시오. 테스트를 시작하기 전에 모든 시약과 마이크로티터 플레이트를 RT에 30분 동안 둡니다. EDTA 플라즈마 샘플을 키트의 희석 버퍼로 1:10으로 희석합니다.
3. 300 μL의 세척 액을 각 웰에 추가하여 표면을 재수화하고 2 분 후에 흡인하십시오. 샘플 버퍼 (공백), SC5b-9 표준, SC5b-9 제어 (높고 낮은 농도) 및 희석 된 플라즈마 샘플을 웰 플레이트에 복제하여 100 μL을 추가하십시오.
4. 접시를 밀봉하고 RT에서 60 분 동안 배양하십시오. 다음으로, 300 μL의 세척 용액으로 플레이트를 5x 로 씻으소서.
5. 각 우물에 효소 공액 항체의 50 μL을 추가합니다. 접시를 밀봉하고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 300 μL의 세척 용액으로 플레이트를 5x 세척하십시오.
6. 각 우물에 TMB 기판 용액의 100 μL을 추가합니다. 접시를 밀봉하고 어둠 속에서 15 분 동안 RT에서 배양하십시오.
7. 씰 필름을 제거하고 각 웰에 스톱 용액의 100 μL을 추가합니다. 450 nm에서 포토미터로 OD를 읽으십시오. 표준 곡선 데이터를 추세선으로 맞추고 샘플의 농도를 계산합니다.

12. CTAD 플라즈마에서 β-트롬보글로불린측정

1. 37 °C에서 수조에서 CTAD 플라즈마를 해동합니다.
2. 제조자의 지시에 따라 β-트롬보글로불린(β-TG) ELISA 키트를 사용한다: β-TG 대조군 및 β-TG 표준을 재구성하고 제공된 인산완충액을 이용하여 증류된_{H2 O.를}사용하여 세척액을 희석한다. 테스트를 시작하기 전에 모든 시약과 마이크로티터 플레이트를 RT에 30분 동안 둡니다.
3. 제공된 인산염 완충액으로 제조업체의 지침에 따라 표준 곡선과 컨트롤을 준비합니다. CTAD 플라즈마 샘플을 1:21로 희석합니다.
4. 인산완충액(블랭크), β-TG 표준, β-TG 대조군(고농도 및 저농도) 및 희석된 혈장 샘플을 웰 플레이트에 복제하여 200 μL을 추가합니다. 접시를 밀봉하고 RT에서 60 분 동안 배양하십시오. 그 후 300 μL의 세척 용액으로 플레이트를 5x 로 씻으십시오.
5. 각 우물에 효소 공액 항체의 200 μL을 추가합니다. 접시를 밀봉하고 RT에서 60 분 동안 배양하십시오. 그 후 300 μL의 세척 용액으로 플레이트를 5x 로 씻으십시오.
6. 각 우물에 TMB 기판 용액의 200 μL을 추가합니다. 접시를 밀봉하고 어둠 속에서 5 분 동안 RT에서 배양하십시오. 씰 필름을 제거하고 1M 황산(H2 SO_4)의50 μL을 각각 잘 첨가하여 반응을 멈춥니다.
7. 접시를 15-60 분 동안 방치 한 다음 450 nm의 광측기로 OD를 읽습니다. 표준 곡선 데이터를 추세선으로 맞추고 샘플의 농도를 계산합니다.

13. 전자 현미경 검사법을 검사하기위한 샘플 준비

1. 집게를 사용하여 튜브에서 임플란트를 제거하고 0.9 % NaCl 용액 3 x로 담그면 임플란트를 간략하게 헹구십시오.
2. 글루타랄데히드 용액(인산염 완충 식염수에 2% 글루타랄데히드 [CA^2++가없는 PBS 버퍼[CA 2+/Mg^2++])을4°C에서 밤새 보관하십시오.
3. 다음으로, 10분 동안 PBS 완충액으로 임플란트를 배양한다. 탈수된 샘플을 추가 분석이 될 때까지 100% 에탄올에 보관하십시오.
4. 전자 현미경 검사법(SEM)을 스캔하기 직전에 건조 장치 또는 문헌^10의 지시에 따라 임계 점 건조를 수행한다.

14. 전자 현미경 검사법 검사

1. 건조된 임플란트를 스캐닝 현미경용 샘플 캐리어에 부착하고 검정을 골드 팔라듐으로 스퍼터링합니다.
2. 스퍼터드 임플란트를 샘플 챔버에 도입합니다. 대표적인 표면 및 셀 접착력이 있는 영역의 100배, 500배, 1,000배 및 2,500배 배율로 사진을 찍습니다.

결과

간략하게 요약하면, 인간의 전혈은 헤파린로드 모노벳에서 수집된 다음 풀링하고 혈장 혈전성 마커뿐만 아니라 세포 수의 기준선 수준을 평가하는 데 사용되었습니다.

이어서, 신경혈관 임플란트 샘플을 함유하는 튜브를 채우고, 연동 펌프를 사용하여 150 mL/min 및 37°C에서 60분 동안 혈액을 관류하였다. 다시, 모든 그룹에서 세포 수를 분석하고, 혈장 샘플을 ELISA 분석을 위해 ?...

토론

제시된 프로토콜은 인간의 혈류를 모방하는 전단 흐름 모델에서 ISO 10993-4에 따라 혈액 접촉 임플란트의 혈중 호환성 테스트를 위한 포괄적이고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 연구는 레이저 컷 신경 혈관 임플란트의 테스트를 기반으로하지만 다양한 샘플로 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 혈액 세포 수, 여러 혈우적합성 마커의 보급, 혈액 접촉 후 장치 표면의 현미경 시각화와 같은 다양...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
aqua ad iniectabilia	Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany	1088813
beta-TG ELISA	Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany	00950
Centrifuge Rotana 460 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany	-
Citrat monovettes (1.4 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	6,16,68,001
CTAD monovettes (2.7 mL)	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	367562
EDTA monovettes (1.2 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	6,16,62,001
Ethanol p.A. (1000 mL)	AppliChem, Darmstadt, Germany	1,31,08,61,611
Glutaraldehyde (25 % in water)	SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany	23114.01
Heparin coating for tubes	Ension, Pittsburgh, USA	-
Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)	LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany	PZN 15261203
Multiplate Reader Mithras LB 940	Berthold, Bad Wildbad, Germany	-
NaCl 0,9%	Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany	1312813
Neutral monovettes (9 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	2,10,63,001
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	70011044
Peristaltic pump ISM444B	Cole Parmer, Wertheim, Germany	3475
Pipette (100 µL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	3124000075
Pipette (1000 µL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	3123000063
Plastic container (100 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	7,55,62,300
PMN-Elastase ELISA	Demeditec Diagnostics, Kiel Germany	DEH3311
Polyvinyl chloride tube	Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France	-
Reaction Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	30123328
neurovascular laser-cut implants	Acandis GmbH, Pforzheim	01-0011x
SC5b-9 ELISA	TECOmedical, Buende, Germany	A029
Scanning electron microscope	Cambridge Instruments, Cambridge, UK	-
Sealing tape (96 well plate)	Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15036
Syringe 10/12 mL Norm-Ject	Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany	10080010
TAT micro kit	Siemens Healthcare, Marburg, Germany	OWMG15
Waterbath Type 1083	Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany	-