Test d’hémocompatibilité des implants de contact sanguin dans un modèle de boucle de flux imitant le flux sanguin humain

Résumé

Ce protocole décrit une évaluation complète de l’hémocompatibilité des dispositifs de contact sanguin à l’aide d’implants neurovasculaires découpés au laser. Un modèle de boucle de flux avec du sang humain frais et héparinisé est appliqué pour imiter le flux sanguin. Après perfusion, divers marqueurs hématologiques sont analysés et comparés aux valeurs acquises directement après la collecte de sang pour l’évaluation d’hémocompatibilité des dispositifs testés.

Résumé

L’utilisation croissante de dispositifs médicaux (p. ex. greffes vasculaires, endoprothèses et cathéters cardiaques) à des fins temporaires ou permanentes qui demeurent dans le système circulatoire de l’organisme exige une approche fiable et multiparamétrique qui évalue les complications hématologiques possibles causées par ces dispositifs (c.-à-d. l’activation et la destruction des composants sanguins). L’essai complet d’hémocompatibilité in vitro des implants de contact sanguin est la première étape vers la mise en œuvre in vivo réussie. Par conséquent, une analyse approfondie selon l’Organisation internationale pour la normalisation 10993-4 (ISO 10993-4) est obligatoire avant l’application clinique. La boucle de débit présentée décrit un modèle sensible pour analyser les performances hémostatiques des endoprothèses (dans ce cas, neurovasculaire) et révéler des effets indésirables. L’utilisation du sang entier humain frais et l’échantillonnage doux du sang sont essentiels pour éviter la préactivation du sang. Le sang est perfusé à travers un tube héparinisé contenant le spécimen d’essai à l’aide d’une pompe périssaltique à un taux de 150 ml/min à 37 oC pendant 60 min. Avant et après la perfusion, marqueurs hématologiques (c.-à-d. la numération des cellules sanguines, l’hémoglobine, l’hématocrit et les marqueurs plasmatiques) indiquant l’activation des leucocytes (polymorphonuclear [PMN]-elastase), des plaquettes (-thromboglobuline), du système de coagulation (thombin-antithrombin III [TAT]), et de la cascade de complément (SC5b-9) sont analysées. En conclusion, nous présentons un modèle essentiel et fiable pour des tests d’hémocompatibilité étendus des endoprothèses et autres dispositifs de contact sanguin avant l’application clinique.

Introduction

L’application in vivo d’implants et de biomatériaux, qui interagissent avec le sang humain, nécessite des tests précliniques intenses axés sur l’étude de divers marqueurs du système hémostatique. L’Organisation internationale pour la normalisation 10993-4 (ISO 10993-4) précise les principes centraux pour l’évaluation des dispositifs de contact sanguin (c.-à-d. les endoprothèses et les greffes vasculaires) et considère la conception de l’appareil, l’utilité clinique et les matériaux nécessaires¹.

Le sang humain est un liquide qui contient diverses protéines et cellules plasmatiques, y compris les leucocytes (globules blancs [WBC]), les érythrocytes (globules rouges [RBC]), et les plaquettes, qui effectuent des fonctions complexes dans le corps humain². Le contact direct des matériaux étrangers avec le sang peut causer des effets indésirables, tels que l’activation du système immunitaire ou de coagulation, qui peut conduire à une inflammation ou des complications thrombotiques et des problèmes graves après l’implantation^3,4,5. Parconséquent, la validation d’hémocompatibilité in vitro offre une occasion avant l’implantation de détecter et d’exclure toutes les complications hématologiques qui peuvent être induites au contact du sang avec une surface étrangère⁶.

Le modèle présenté de boucle d’écoulement a été établi pour évaluer l’hémocompatibilité des endoprothèses neurovasculaires et des dispositifs similaires en appliquant un débit de 150 ml/min dans les tubes (diamètre de 3,2 mm) pour imiter les conditions de débit cérébral et les diamètres de l’artère^2,7. Outre la nécessité d’un modèle in vitro optimal, la source de sang est un facteur important dans l’obtention de résultats fiables et inchangés lors de l’analyse de l’hémocompatibilité d’un biomatériau⁸. Le sang recueilli doit être utilisé immédiatement après l’échantillonnage afin d’éviter les changements causés par un stockage prolongé. En général, une douce collecte de sang sans stase à l’aide d’une aiguille de 21 G devrait être effectuée pour minimiser la préactivation des plaquettes et la cascade de coagulation pendant le prélèvement sanguin. En outre, les critères d’exclusion des donneurs comprennent ceux qui fument, sont enceintes, sont en mauvais état de santé ou ont pris des contraceptifs oraux ou des analgésiques au cours des 14 jours précédents.

Cette étude décrit un modèle in vitro pour les tests d’hémocompatibilité étendu des implants endoprothèses dans des conditions d’écoulement. En comparant les endoprothèses non couchées aux endoprothèses enduites de fibrine-heparin, les résultats des tests complets d’hémocompatibilité reflètent une amélioration de l’hémocompatibilité des endoprothèses enduites de fibrine-héparine⁹. En revanche, les endoprothèses non enduites induisent l’activation de la cascade de coagulation, comme en témoigne l’augmentation des concentrations de thombin-antithrombin III (TAT) et la perte du nombre de plaquettes sanguines due à l’adhérence des plaquettes à la surface en endoprothèse. Dans l’ensemble, l’intégration de ce modèle d’hémocompatibilité comme un test préclinique est recommandée pour détecter tout effet indésirable sur le système hémostatique qui sont causés par l’appareil.

Protocole

La procédure d’échantillonnage du sang a été approuvée par le Comité d’éthique de la faculté de médecine de l’Université de Tuebingen (code d’identification du projet: 270/2010BO1). Tous les sujets ont fourni un consentement écrit et éclairé pour l’inclusion avant la participation.

1. Préparation des Monovettes chargées d’Héparine

1. Mélanger l’héparine non diluée (5 000 UI/ml) avec du chlorure de sodium (NaCl, 0,9 %) solution et préparer une solution avec une concentration résultante de 15 UI/mL d’héparine.
2. Ajoutez 900 lil de la solution d’héparine diluée à chaque monovette neutre (9 ml) pour obtenir une concentration finale d’héparine de 1,5 UI/mL après l’échantillonnage sanguin. Préparer trois monovettes par donneur plus trois monovettes de réserve et entreposer les monovettes chargées d’héparine à 4 oC jusqu’à l’échantillonnage du sang.

2. Échantillonnage de sang

1. Sortir les monovettes chargées d’héparine du réfrigérateur 30 min avant l’échantillonnage sanguin.
2. Recueillir un échantillon de sang de 27 ml de chaque donneur en bonne santé (n - 5) par venipuncture pour la boucle d’écoulement. Appliquez seulement un tourniquet lisse pour éviter l’activation prématurée des plaquettes et de la cascade de coagulation du sang.
3. Recueillir des échantillons de sang dans trois monovettes contenant 900 lil de la solution d’héparine (1,5 UI/mL) et mettre en commun les trois monovettes dans un récipient en plastique pour s’assurer que tous les composants sont répartis uniformément.
4. Transférer directement le sang héparinisé en trois monovettes différentes contenant EDTA (1,2 ml), citrate (1,4 ml), ou un mélange de citrate, de théophylline, d’adénosine et de dipyridamole (CTAD, 2,7 ml) pour recueillir les valeurs de base. Procédez avec les échantillons tels que décrits dans les sections 5-8.
   REMARQUE : Pour garantir un comportement de coagulation non influencé, les donneurs devraient éviter la prise de médicaments affectant l’hémostase (p. ex., l’acide acétylsalicylique, le naproxène et la carbenicilline) au cours des 14 derniers jours, ainsi que les contraceptifs oraux et le tabagisme.

3. Préparation de la boucle de flux

1. Couper trois tubes de chlorure de polyvinyl recouverts d’héparine d’une longueur de 75 cm et d’un diamètre intérieur de 3,2 mm. Chargez les tubes avec les implants neurovasculaires coupés au laser avec ou sans revêtement de fibrine-héparine. N’oubliez pas de laisser une baignoire déchargée comme un contrôle.
2. Placer une extrémité du tube dans un réservoir rempli de 0,9% De NaCl, connecter le tube à la tête de la pompe et insérer l’autre extrémité dans un cylindre de mesure.
3. Ajuster les réglages de la pompe péristicienne pour atteindre un débit de 150 ml/min à l’aide d’une minuterie tout en vérifiant le niveau de remplissage du cylindre de mesure.

4. Performance des tests d’hémocompatibilité

1. Utilisez une seringue de 12 ml pour remplir les tubes de sang. Laissez 6 ml de sang circuler en douceur dans chaque tube contenant un échantillon ou un contrôle déchargé.
2. Former un circuit et fermer les tubes à l’aide d’un tube de connexion en silicone de 0,5 cm de longueur. Placer les tubes dans un bain d’eau de 37 oC et commencer la perfusion pendant 60 min.

5. Analyse de la numération sanguine entière

1. Mettre 1,2 ml de sang après l’échantillonnage (ligne de base) ou après perfusion dans une monovette contenant de l’EDTA et inverser soigneusement le tube 5x.
2. Insérez la monovette dans l’analyseur sanguin et effectuez une analyse de la numération sanguine pour chaque échantillon. Ensuite, incuber les monovettes sur la glace pendant 15-60 min après la mesure de la numération sanguine pour une analyse plus approfondie, comme décrit à la section 7.

6. Collection de plasma Citrate

1. Remplir les monovettes contenant du citrate de 1,4 ml de sang (fraîchement dessiné ou après la circulation) et inverser soigneusement 5x.
2. Centrifuge les tubes pendant 18 min à 1800 x g à température ambiante (RT). Aliquot trois échantillons de 250 lil de la fraction plasmatique en tubes de réaction de 1,5 mL et congeler les échantillons de plasma dans de l’azote liquide. Entreposez-les à -20 oC jusqu’à l’analyse.

7. Collection de plasma EDTA

1. Incuber les monovettes sur la glace pendant 15-60 min après la mesure de la numération sanguine. Puis, centrifuger les tubes pendant 20 min à 2 500 x g et 4 oC.
2. Aliquot trois échantillons de 250 lil de la fraction plasmatique en tubes de réaction de 1,5 mL après centrifugation et congeler les tubes dans de l’azote liquide. Entreposez-les à -80 oC jusqu’à l’analyse.

8. Collection de plasma CTAD

1. Remplir les monovettes contenant le mélange CTAD avec 2,7 ml de sang (fraîchement dessiné ou après l’incubation) et inverser soigneusement 5x. Ensuite, incuber les monovettes sur la glace pendant 15-60 min. Puis, centrifuger les tubes pendant 20 min à 2 500 x g et 4 oC.
2. Transférer 700 l’un de la fraction de plasma moyen dans un tube de réaction de 1,5 ml et centrifuger les tubes de réaction remplis pendant 20 min à 2 500 x g et 4 oC.
3. Aliquot deux échantillons de 100 l de la fraction moyenne en tubes de réaction de 1,5 mL après centrifugation et congeler les tubes dans de l’azote liquide. Entreposez-les à -20 oC jusqu’à l’analyse.
   REMARQUE : La collecte de plasma EDTA et de plasma CTAD peut être effectuée ensemble parce que les conditions de fonctionnement sont les mêmes.

9. Mesure du TAT humain à partir de plasma Citrate

1. Décongeler le plasma de citrate dans un bain d’eau de 37 oC.
2. Utilisez le kit d’essai immunosorbent (ELISA) lié à l’enzyme TAT selon les instructions du fabricant. Reconstruire les normes plasmatiques et le contrôle et diluer la solution de lavage, anti-humain-TAT peroxidase (POD) anticorps conjugués, et la solution de chromogène. Laissez tous les réactifs et la plaque de microtitre à RT (15 à 25 oC) pendant 30 minutes avant de commencer l’essai.
3. Pipet 50 L de la mémoire tampon de l’échantillon dans chaque puits de la plaque de microtiter et ajouter 50 L de la mémoire tampon de l’échantillon (blanc), norme plasmatique, contrôle du plasma, et échantillon de plasma non dilué dans les doublons à la plaque de puits. Sceller la plaque et incuber à 37 oC pendant 15 minutes avec des secousses douces. Ensuite, lavez la plaque 3x avec 300 lil de solution de lavage.
4. Ajoutez 100 lils de l’anticorps anti-humain-TAT conjugué à POD à chaque puits. Sceller la plaque et incuber à 37 oC pendant 15 minutes avec des secousses douces. Ensuite, lavez la plaque 3x avec 300 lil de solution de lavage.
5. Ajoutez 100 L de la solution de chromogène fraîchement préparée à chaque puits. Scellez la plaque et incuber à RT pendant 30 min.
6. Retirez le film de joint et ajoutez 100 L de solution d’arrêt à chaque puits. Lisez la densité optique (OD) avec un photomètre à 490 à 500 nm. Adaptez les données de courbe standard comme une ligne de tendance et calculez la concentration des échantillons.

10. Mesure de PMN-elastase à partir de plasma Citrate

1. Décongeler le plasma de citrate dans un bain d’eau à 37 oC.
2. Utilisez le kit ELISA polymorphonucléaire (PMN) -elastase selon les instructions du fabricant : reconstruire le contrôle PMN-elastase et la norme PMN-elastase pour préparer une courbe standard à l’aide du tampon de dilution du kit.
3. Diluer la solution de lavage selon la description du fabricant. Laissez tous les réactifs et la plaque de microtitre à RT pendant 30 minutes avant de commencer le test. Diluer les échantillons de plasma de citrate à 1:100 avec le tampon de dilution.
4. Ajouter 100 l’échantillon tampon (blanc), la courbe standard PMN-elastase (15,6 à 1 000 ng/ml), les commandes PMN-elastase (concentrations élevées et faibles) et les échantillons dilués de plasma en double à la plaque de puits. Scellez la plaque et incuber à RT pendant 60 minutes avec des secousses douces. Ensuite, laver la plaque 4x avec 300 l de solution de lavage.
5. Ajoutez 150 L d’anticorps conjugués à chaque puits. Scellez la plaque et incuber à RT pendant 60 minutes avec des secousses douces. Ensuite, laver la plaque 4x avec 300 l de solution de lavage.
6. Ajoutez 200 L de la solution de substrat de 3,3',5'-tétramethylbenzidin (TMB) à chaque puits. Scellez la plaque et incuber à RT pendant 20 minutes dans l’obscurité. Ensuite, retirez le film de joint et ajoutez 50 L de la solution d’arrêt à chaque puits.
7. Lisez l’OD avec un photomètre à 450 nm avec une lecture de référence à 630 nm. Adaptez les données de courbe standard comme une ligne de tendance et calculez la concentration des échantillons.

11. Mesure du complexe de compléments terminaux (CTC) à partir de plasma EDTA

1. Décongeler le plasma EDTA dans un bain d’eau à 37 oC, et conserver sur la glace après le dégivrage.
2. Utilisez le kit SC5b-9 ELISA en cascade complémentaire selon les instructions du fabricant : diluer la solution de lavage telle que décrite dans le protocole du fabricant. Laissez tous les réactifs et la plaque de microtitre à RT pendant 30 minutes avant de commencer le test. Diluer les échantillons de plasma EDTA à 1:10 avec le tampon de dilution du kit.
3. Ajouter 300 L de solution de lavage à chaque puits pour réhydratrant la surface et aspirer après 2 min. Ajouter 100 L de la mémoire tampon de l’échantillon (blanc), les normes SC5b-9, les commandes SC5b-9 (concentrations élevées et faibles) et les échantillons de plasma dilués en doublons à la plaque de puits.
4. Scellez la plaque et incuber à RT pendant 60 min. Ensuite, lavez l’assiette 5x avec 300 lil de solution de lavage.
5. Ajoutez 50 L d’anticorps conjugués à chaque puits. Scellez la plaque et incuber à RT pendant 30 min. Ensuite, lavez la plaque 5x avec 300 lil de solution de lavage.
6. Ajoutez 100 L de la solution TMB-substrate à chaque puits. Scellez la plaque et incuber à RT pendant 15 minutes dans l’obscurité.
7. Retirez le film de joint et ajoutez 100 L de la solution d’arrêt à chaque puits. Lisez l’OD avec un photomètre à 450 nm. Adaptez les données de courbe standard comme une ligne de tendance et calculez la concentration des échantillons.

12. Mesure de la thromboglobuline à partir de plasma CTAD

1. Décongeler le plasma CTAD dans un bain d’eau à 37 oC.
2. Utilisez le kit ELISA de thromboglobuline (TG) selon les instructions du fabricant : reconstruire le contrôle de l’G et la norme de TG et diluer la solution de lavage à l’aide de_{L’anticorps}distillé H 2 O. Reconstruire l’anticorps contaminé par le POD à l’aide du tampon de phosphate fourni. Laissez tous les réactifs et la plaque de microtitre à RT pendant 30 minutes avant de commencer le test.
3. Préparer la courbe standard et le contrôle selon les instructions du fabricant avec le tampon de phosphate fourni. Diluer les échantillons de plasma de l’ATC À 1:21.
4. Ajoutez 200 L de la mémoire tampon de phosphate (blanc), les normes de TG, les commandes de TG (concentrations élevées et faibles) et les échantillons de plasma dilués en double à la plaque de puits. Sceller la plaque et incuber à RT pendant 60 min. Ensuite, lavez la plaque 5x avec 300 ll de solution de lavage.
5. Ajoutez 200 lils de l’anticorps conjugué à l’enzyme à chaque puits. Sceller la plaque et incuber à RT pendant 60 min. Ensuite, lavez la plaque 5x avec 300 ll de solution de lavage.
6. Ajoutez 200 L de la solution TMB-substrate à chaque puits. Scellez la plaque et incuber à RT pendant 5 minutes dans l’obscurité. Retirez le film de joint et arrêtez la réaction en ajoutant 50 L d’acide sulfurique de 1 M (H₂SO₄) à chaque puits.
7. Laissez la plaque de 15 à 60 minutes, puis lisez l’OD avec un photomètre à 450 nm. Adaptez les données de courbe standard comme une ligne de tendance et calculez la concentration des échantillons.

13. Préparation d’échantillon pour la microscopie électronique de balayage

1. Retirez l’implant du tube à l’aide de forceps et rincez brièvement l’implant en le plongeant dans la solution 3x NaCl à 0,9 %.
2. Conserver en solution de glutaraldéhyde (2% de glutaraldéhyde en saline tamponnée par phosphate [TAMPON PBS sans Ca^{2 '/Mg2 '])}du jour au lendemain à 4 'C.
3. Ensuite, incuber les implants dans PBS-tampon pendant 10 min. Déshydrater les échantillons en incuber dans l’éthanol avec une concentration croissante pendant 10 min chacun: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, et 100%. Conservez les échantillons déshydratés dans 100 % d’éthanol jusqu’à une analyse plus approfondie.
4. Effectuez un séchage de point critique selon les instructions du dispositif de séchage ou de la littérature¹⁰ juste avant de scanner la microscopie électronique (SEM).

14. Microscopie électronique de balayage

1. Fixez les implants séchés à un porte-échantillons pour le microscope à balayage et pulvérisez les échantillons avec du palladium d’or.
2. Introduire les implants crachés dans la chambre de l’échantillon. Prenez des photos en magnification 100- 500-, 1000- et 2500 fois les zones avec l’adhérence représentative de surface et de cellules.

Résultats

Brièvement résumé, le sang entier humain a été recueilli dans les monovettes héparine-chargées puis mis en commun et employé pour évaluer les niveaux de base du nombre de cellules aussi bien que les marqueurs plasmatiques d’hémocompatibilité.

Par la suite, le tube contenant les échantillons d’implant neurovasculaire a été rempli, et le sang a été perfusé pendant 60 min à 150 ml/min et 37 oC à l’aide d’une pompe périsstale. Encore une fois, le nombre de cellules a é...

Discussion

Le protocole présenté décrit une méthode complète et fiable pour l’essai d’hémocompatibilité des implants de contact sanguin conformément à ISO 10993-4 dans un modèle de débit de cisaillement imitant le flux sanguin humain. Cette étude est basée sur l’essai d’implants neurovasculaires découpés au laser, mais peut être réalisée avec une variété d’échantillons. Les résultats démontrent que cette méthode permet l’analyse large de divers paramètres tels que la numération des cellules san...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
aqua ad iniectabilia	Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany	1088813
beta-TG ELISA	Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany	00950
Centrifuge Rotana 460 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany	-
Citrat monovettes (1.4 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	6,16,68,001
CTAD monovettes (2.7 mL)	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	367562
EDTA monovettes (1.2 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	6,16,62,001
Ethanol p.A. (1000 mL)	AppliChem, Darmstadt, Germany	1,31,08,61,611
Glutaraldehyde (25 % in water)	SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany	23114.01
Heparin coating for tubes	Ension, Pittsburgh, USA	-
Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)	LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany	PZN 15261203
Multiplate Reader Mithras LB 940	Berthold, Bad Wildbad, Germany	-
NaCl 0,9%	Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany	1312813
Neutral monovettes (9 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	2,10,63,001
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	70011044
Peristaltic pump ISM444B	Cole Parmer, Wertheim, Germany	3475
Pipette (100 µL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	3124000075
Pipette (1000 µL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	3123000063
Plastic container (100 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	7,55,62,300
PMN-Elastase ELISA	Demeditec Diagnostics, Kiel Germany	DEH3311
Polyvinyl chloride tube	Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France	-
Reaction Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	30123328
neurovascular laser-cut implants	Acandis GmbH, Pforzheim	01-0011x
SC5b-9 ELISA	TECOmedical, Buende, Germany	A029
Scanning electron microscope	Cambridge Instruments, Cambridge, UK	-
Sealing tape (96 well plate)	Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15036
Syringe 10/12 mL Norm-Ject	Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany	10080010
TAT micro kit	Siemens Healthcare, Marburg, Germany	OWMG15
Waterbath Type 1083	Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany	-