Test di emocompatibilità degli impianti che si contattono con il sangue in un modello di flusso a ciclo continuo che imita il flusso sanguigno umano

Riepilogo

Questo protocollo descrive una valutazione completa dell'emocompatibilità dei dispositivi di contatto con il sangue utilizzando impianti neurovascolari tagliati al laser. Un modello di ciclo di flusso con sangue umano fresco ed eparinizzato viene applicato per imitare il flusso sanguigno. Dopo la perfusione, vari marcatori ematologici vengono analizzati e confrontati con i valori ottenuti direttamente dopo la raccolta del sangue per la valutazione dell'emocompatibilità dei dispositivi testati.

Abstract

L'uso crescente di dispositivi medici (ad esempio, innesti vascolari, stent e cateteri cardiaci) per scopi temporanei o permanenti che rimangono nel sistema circolatorio del corpo richiede un approccio affidabile e multiparametrico che valuti le possibili complicanze ematologiche causate da questi dispositivi (cioè, attivazione e distruzione di componenti ematici). Il primo passo verso un'implementazione in vivo di successo è il test completo di emocompatibilità in vitro degli impianti a contatto con il sangue. Pertanto, un'analisi approfondita secondo l'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione 10993-4 (ISO 10993-4) è obbligatoria prima dell'applicazione clinica. Il ciclo di flusso presentato descrive un modello sensibile per analizzare le prestazioni emostatiche degli stent (in questo caso, neurovascolare) e rivelare effetti negativi. L'uso di sangue fresco umano intero e di un leggero prelievo di sangue sono essenziali per evitare la preattivazione del sangue. Il sangue viene perfuso attraverso un tubo eparano contenente il campione di prova utilizzando una pompa peristaltica ad una velocità di 150 mL/min a 37 gradi centigradi per 60 min. Prima e dopo la perfusione, i marcatori ematologici (ad es. numero di cellule del sangue, emoglobulina, ematocrito e marcatori plasmatici) che indicano l'attivazione di leucociti (poliomorfonucleari [PMN]-elastassi), piastrine (tromrusbotina z -TG]), il sistema di coagulazione (thombin-antithrombin iii [TAT]), e la cascata superiore (SC5b-9) sono analizzati. In conclusione, presentiamo un modello essenziale e affidabile per test di emocompatibilità estesa di stent e altri dispositivi di contatto con il sangue prima dell'applicazione clinica.

Introduzione

L'applicazione in vivo di impianti e biomateriali, che interagiscono con il sangue umano, richiede intensi test preclinici incentrati sullo studio di vari marcatori del sistema emostatico. L'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione 10993-4 (ISO 10993-4) specifica i principi centrali per la valutazione dei dispositivi di contatto con il sangue (cioè stent e innesti vascolari) e considera la progettazione del dispositivo, l'utilità clinica e i materiali necessari¹.

Il sangue umano è un fluido che contiene varie proteine e cellule plasmatiche, tra cui leucociti (globuli bianchi [WBC]), eritrociti (globuli rossi [RBC]), e piastrine, che svolgono funzioni complesse nel corpo umano². Il contatto diretto di materiali estranei con sangue può causare effetti negativi, come l'attivazione del sistema immunitario o coagulante, che può portare a infiammazione o complicazioni trombotiche e gravi problemi dopo l'impianto^3,4,5. Pertanto, la convalida dell'emocompatibilità in vitro offre l'opportunità prima dell'impianto di rilevare ed escludere eventuali complicazioni ematologiche che possono essere indotte a contatto del sangue con una superficie estranea⁶.

Il modello di loop di flusso presentato è stato stabilito per valutare l'emocompatibilità di stent neurovascolari e dispositivi simili applicando una portata di 150 mL/min in tubi (diametro di 3,2 mm) per imitare le condizioni del flusso cerebrale e diametri arteriosi^2,7. Oltre alla necessità di un modello in vitro ottimale, la fonte di sangue è un fattore importante per ottenere risultati affidabili e inalterati quando si analizza l'emocompatibilità di un biomateriale⁸. Il sangue raccolto deve essere utilizzato immediatamente dopo il campionamento per evitare cambiamenti causati da un accumulo prolungato. In generale, una delicata raccolta di sangue senza stasi utilizzando un ago da 21 G deve essere eseguita per ridurre al minimo la preattivazione delle piastrine e la cascata di coagulazione durante il prelievo del sangue. Inoltre, i criteri di esclusione dei donatori includono coloro che fumano, sono incinte, sono in cattivo stato di salute o hanno assunto contraccettivi orali o antidolorifici nei 14 giorni precedenti.

Questo studio descrive un modello in vitro per l'emocompatibilità esteso dei test di stent in condizioni di flusso. Quando si confrontano gli stent rivestiti di fibrina eparina, i risultati dei test completi di emocompatibilità riflettono una migliore emocompatibilità degli stent rivestiti di mebrina-eparina⁹. Al contrario, gli stent non rivestiti inducono l'attivazione della cascata di coagulazione, come dimostrato da un aumento delle concentrazioni di thombin-antitrombopina III (TAT) e dalla perdita del numero di piastrine del sangue a causa dell'adesione delle piastrine alla superficie dello stent. Nel complesso, si raccomanda di integrare questo modello di emocompatibilità come test preclinico per rilevare eventuali effetti negativi sul sistema emostatico causati dal dispositivo.

Protocollo

La procedura di campionamento del sangue è stata approvata dal Comitato Etico della facoltà di medicina dell'Università di Tuebingen (codice di identificazione del progetto: 270/2010BO1). Tutti i soggetti hanno fornito il consenso scritto e informato per l'inclusione prima della partecipazione.

1. Preparazione delle Monovette caricate da Eparina

1. Mescolare l'eparina non diluita (5.000 IU/mL) con cloruro di sodio (NaCl, 0,9%) soluzione e preparare una soluzione con una concentrazione di 15 IU/mL di eparina.
2. Aggiungere 900 l della soluzione di eparina diluita a ciascuna monovette neutra (9 mL) per ottenere una concentrazione finale di eparina di 1,5 IU/mL dopo il campionamento del sangue. Preparate tre monovette per donatore più tre monovette di riserva e conservate le monovette cariche di eparina a 4 gradi centigradi fino al campionamento del sangue.

2. Campionamento del sangue

1. Estrarre le monovette caricate in eparina dal frigorifero 30 minuti prima del campionamento del sangue.
2. Raccogliere un campione di sangue da 27 mL da ogni donatore sano (n - 5) per venipuncture per il ciclo di flusso. Applicare solo un laccio emostatico liscio per evitare l'attivazione prematura delle piastrine e della cascata di coagulazione del sangue.
3. Raccogliere campioni di sangue in tre monovette contenenti 900 l della soluzione di eparina (1,5 IU/mL) e raggruppare tutte e tre le monovette in un contenitore di plastica per garantire che tutti i componenti siano distribuiti uniformemente.
4. Trasferire direttamente il sangue eparanato in tre diverse monovette contenenti EDTA (1,2 mL), citrato (1,4 mL), o una miscela di citrato, teofilina, adenosina e dipyridamole (CTAD, 2,7 mL) per raccogliere i valori di base. Procedere con i campioni, come descritto nelle sezioni 5-8.
   NOTA: per garantire un comportamento di coagulazione non influenzata, i donatori dovrebbero evitare l'assunzione di farmaci che colpiscono l'emostasi (ad esempio, acido acetilsalicilico, naprossene e carbenicillina) negli ultimi 14 giorni, nonché contraccettivi orali e fumo.

3. Preparazione del ciclo di flusso

1. Tagliare tre tubi di cloruro in polivinil rivestito di eparina con una lunghezza di 75 cm e un diametro interno di 3,2 mm. Caricare i tubi con gli impianti di taglio laser neurovascolare con o senza il rivestimento fibrina-eparina. Ricordatevi di lasciare una vasca scaricata come un controllo.
2. Mettere un'estremità del tubo in un serbatoio riempito con 0.9% NaCl, collegare il tubo alla testa della pompa e inserire l'altra estremità in un cilindro di misurazione.
3. Regolare le impostazioni della pompa peristaltica per raggiungere una portata di 150 mL/min utilizzando un timer durante il controllo del livello di riempimento nel cilindro di misurazione.

4. Prestazioni dei test di emocompatibilità

1. Utilizzare una siringa da 12 mL per riempire i tubi di sangue. Lasciare che 6 mL di flusso sanguigno senza intoppi in ogni tubo contenente un campione o un controllo scaricato.
2. Formare un circuito e chiudere i tubi saldamente utilizzando una lunghezza di 0,5 cm di tubi di collegamento in silicone. Mettere i tubi in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi e iniziare la perfusione per 60 min.

5. Analisi del numero di sangue intero

1. Mettere 1,2 mL di sangue dopo il campionamento (linea di base) o dopo la perfusione in una monovetta contenente EDTA e invertire con attenzione il tubo 5x.
2. Inserire la monovetta nell'analizzatore del sangue ed eseguire un'analisi del conteggio del sangue per ogni campione. Quindi, incubare le monovette sul ghiaccio per 15-60 min dopo la misurazione del conteggio del sangue per ulteriori analisi, come descritto nella sezione 7.

6. Collezione di Citrate Plasma

1. Riempire le monovette contenenti citrato con 1,4 mL di sangue (appena prelevato o dopo la circolazione) e invertire attentamente 5x.
2. Centrifugare i tubi per 18 min a 1.800 x g a temperatura ambiente (RT). Aliquota tre campioni da 250 litri della frazione di plasma in tubi di reazione da 1,5 ml e congelare i campioni di plasma in azoto liquido. Conservarli a -20 gradi centigradi fino all'analisi.

7. Collezione di plasma EDTA

1. Incubare le monovette sul ghiaccio per 15-60 min dopo la misurazione del conteggio del sangue. Quindi, centrifugare i tubi per 20 min a 2.500 x g e 4 gradi centigradi.
2. Aliquota tre campioni di 250 L della frazione di plasma in tubi di reazione da 1,5 ml dopo la centrifugazione e congelare i tubi in azoto liquido. Conservarli a -80 gradi centigradi fino all'analisi.

8. Collezione di plasma CTAD

1. Riempire le monovette contenenti la miscela di CTAD con 2,7 mL di sangue (appena prelevato o dopo l'incubazione) e invertire con attenzione 5x. In seguito, incubare le monovette sul ghiaccio per 15-60 min. Quindi, centrifugare i tubi per 20 min a 2.500 x g e 4 gradi centigradi.
2. Trasferire 700 l della frazione di plasma medio in un tubo di reazione di 1,5 mL e centrifugare i tubi di reazione riempiti per 20 min a 2.500 x g e 4 gradi centigradi.
3. Aliquota due campioni di 100 L della frazione media in tubi di reazione da 1,5 ml dopo la centrifugazione e congelare i tubi in azoto liquido. Conservarli a -20 gradi centigradi fino all'analisi.
   NOTA: La raccolta di plasma EDTA e plasma CTAD può essere eseguita insieme perché le condizioni operative sono le stesse.

9. Misurazione del TAT umano da Citrate Plasma

1. Scongelare il plasma di citrato in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi.
2. Utilizzare il kit ELISA (Immunosorbent assay Immunosorbent, ELISA) legato all'enzima TAT secondo le istruzioni del produttore. Ricostruire gli standard plasmatici e controllare e diluire la soluzione di lavaggio, anticorpo coniugato anti-umano-TAT (POD) e soluzione cromogena. Lasciare tutti i reagenti e la piastra del microtitero a RT (15-25 gradi centigradi) per 30 min prima di iniziare il test.
3. Pipet 50 l del buffer del campione in ogni pozzetto della piastra del microtitero e aggiungere 50 L del buffer campione (vuoto), plasma standard, controllo plasma e campione di plasma non diluito in duplicati alla piastra del pozzo. Sigillare la piastra e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min con agitazioni delicate. Quindi lavare il piatto 3x con 300 l di soluzione di lavaggio.
4. Aggiungete 100 l dell'anticorpo anti-umano-TAT coniugato POD ad ogni pozzo. Sigillare la piastra e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min con agitazioni delicate. Quindi lavare il piatto 3x con 300 l di soluzione di lavaggio.
5. Aggiungete 100 l della soluzione di cromogenia appena preparata a ciascun pozzo. Sigillare la piastra e incubare a RT per 30 min.
6. Rimuovere la pellicola di guarne e aggiungere 100 l di soluzione di arresto ad ogni pozzo. Leggete la densità ottica (OD) con un fotometro a 490-500 nm. Adattare i dati della curva standard come linea di tendenza e calcolare la concentrazione dei campioni.

10. Misurazione della PMN-elastase da Citrate Plasma

1. Scongelare il plasma di citrato in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
2. Utilizzare il kit ELISA polimorfonucleare (PMN)-elastase secondo le istruzioni del produttore: ricostruire il controllo PMN-elastase e lo standard PMN-elastase per preparare una curva standard utilizzando il buffer di diluizione del kit.
3. Diluire la soluzione di lavaggio in base alla descrizione del produttore. Lasciare tutti i reagenti e la piastra del microtitero a RT per 30 min prima di iniziare il test. Diluire i campioni di plasma di citrato a 1:100 con il tampone di diluizione.
4. Aggiungere 100 l del buffer campione (vuoto), la curva standard PMN-elastase (15,6,100ng/mL), i controlli PMN-elastase (concentrazioni alte e basse) e i campioni di plasma diluiti in duplicati nella piastra del pozzo. Sigillare la piastra e incubare a RT per 60 min con agitazione delicata. Successivamente, lavare la piastra 4x con 300 gradi di soluzione di lavaggio.
5. Aggiungete 150 l dell'anticorpo coniugato enzimatico ad ogni pozzo. Sigillare la piastra e incubare a RT per 60 min con agitazione delicata. Successivamente, lavare la piastra 4x con 300 gradi di soluzione di lavaggio.
6. Aggiungete 200 l della soluzione substrato 3,3',5,5'-tetramethylbenzin (TMB)-substrato ad ogni pozzo. Sigillare la piastra e incubare a RT per 20 min al buio. Quindi, rimuovere la pellicola di guarne e aggiungere 50 l della soluzione di arresto ad ogni pozzo.
7. Leggere l'OD con un fotometro a 450 nm con una lettura di riferimento a 630 nm. Adattare i dati della curva standard come linea di tendenza e calcolare la concentrazione dei campioni.

11. Misurazione del Terminal Complement Complex (TCC) da EDTA Plasma

1. Scongelare il plasma EDTA in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e conservarlo sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
2. Utilizzare il kit ELISA a cascata completa SC5b-9 secondo le istruzioni del produttore: diluire la soluzione di lavaggio come descritto nel protocollo del produttore. Lasciare tutti i reagenti e la piastra del microtitero a RT per 30 min prima di iniziare il test. Diluire i campioni di plasma EDTA a 1:10 con il buffer di diluizione del kit.
3. Aggiungete 300 l di soluzione di lavaggio per reidratare la superficie e aspirare dopo 2 min.
4. Sigillare la piastra e incubare a RT per 60 min. Successivamente, lavare la piastra 5x con 300 l di soluzione di lavaggio.
5. Aggiungete 50 l dell'anticorpo coniugato enzimatico ad ogni pozzo. Sigillare la piastra e incubare a RT per 30 min. Quindi lavare il piatto 5x con 300 o più l di soluzione di lavaggio.
6. Aggiungete 100 l della soluzione TMB-substrato ad ogni pozzo. Sigillare la piastra e incubare a RT per 15 min al buio.
7. Rimuovere la pellicola di guarne e aggiungere 100 l della soluzione di arresto ad ogni pozzo. Leggi l'OD con un fotometro a 450 nm. Adattare i dati della curva standard come linea di tendenza e calcolare la concentrazione dei campioni.

12. Misurazione della trombosina z dal plasma CTAD

1. Scongelare il plasma CTAD in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
2. Utilizzare il kit ELISA , con la forma del produttore, che sia ricostruibile in base allo standard di TG e dello standard di tG e diluire la soluzione di lavaggio utilizzando l'anticorpo coniugato POD con il buffer fosfato fornito. Lasciare tutti i reagenti e la piastra del microtitero a RT per 30 min prima di iniziare il test.
3. Preparare la curva standard e il controllo secondo le istruzioni del produttore con il buffer fosfato fornito. Diluire i campioni di plasma CTAD all'1:21.
4. Aggiungere 200 l del buffer di fosfato (vuoto), gli standard di TG, i controlli di TG (concentrazioni elevate e basse) e campioni di plasma diluiti in duplicati nella piastra del pozzo. Sigillare la piastra e incubare a RT per 60 min.
5. Aggiungere 200 l dell'anticorpo coniugato enzimatico ad ogni pozzo. Sigillare la piastra e incubare a RT per 60 min.
6. Aggiungete 200 l della soluzione TMB-substrato ad ogni pozzo. Sigillare la piastra e incubare a RT per 5 min al buio. Rimuovere la pellicola di foca e fermare la reazione aggiungendo 50 L di acido solforico da 1 M (H₂SO₄) a ciascun pozzo.
7. Lascia la piastra per 15-60 min, quindi leggi l'OD con un fotometro a 450 nm. Adattare i dati della curva standard come linea di tendenza e calcolare la concentrazione dei campioni.

13. Preparazione del campione per la microscopia elettronica a scansione

1. Rimuovere l'impianto dal tubo con pinze e risciacquare brevemente l'impianto immergendolo nella soluzione NaCl 0x.
2. Conservare in soluzione di glutaraldeide (2% glutaraldeide in salina tampone tampone di fosfato [PBS-buffer senza Ca^2o/Mg²⁾durante la notte a 4 gradi centigradi.
3. Successivamente, incubare gli impianti in PBS-buffer per 10 min. Disidratare i campioni incubando in etanolo con crescente concentrazione per 10 min ciascuno: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, e 100%. Conservare i campioni disidratati nel 100% di etanolo fino a un'ulteriore analisi.
4. Eseguire l'essiccazione dei punti critici secondo le istruzioni del dispositivo di essiccazione o della letteratura¹⁰ appena prima della microscopia elettronica a scansione (SEM).

14. Microscopia elettronica a scansione

1. Attaccare gli impianti secchi a un supporto campione per il microscopio a scansione e sputter i campioni con palladio d'oro.
2. Introdurre gli impianti sputtered nella camera campione. Scattare foto in un ingrandimento delle aree da 100, 500, 1.000 e 2.500 volte con la superficie e l'adesione alle cellule.

Risultati

Brevemente riassunto, il sangue umano intero è stato raccolto in monovette caricate in eparina poi raggruppate e utilizzate per valutare i livelli di base dei conteggi cellulari e dei marcatori di emocompatibilità plasmatica.

Successivamente, il tubo contenente i campioni di impianto neurovascolare è stato riempito, e il sangue è stato perfuso per 60 min a 150 mL/min e 37 gradi centigradi utilizzando una pompa peristaltica. Anche in questo caso, il numero di cellule è stato analizzato in ...

Discussione

Il protocollo presentato descrive un metodo completo e affidabile per il test di emocompatibilità degli impianti a contatto con il sangue in conformità con ISO 10993-4 in un modello di flusso di taglio che imita il flusso sanguigno umano. Questo studio si basa sul test di impianti neurovascolari tagliati al laser, ma può essere eseguito con una varietà di campioni. I risultati dimostrano che questo metodo consente l'analisi ampia di vari parametri come il numero di cellule del sangue, la prevalenza di diversi marcato...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
aqua ad iniectabilia	Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany	1088813
beta-TG ELISA	Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany	00950
Centrifuge Rotana 460 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany	-
Citrat monovettes (1.4 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	6,16,68,001
CTAD monovettes (2.7 mL)	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	367562
EDTA monovettes (1.2 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	6,16,62,001
Ethanol p.A. (1000 mL)	AppliChem, Darmstadt, Germany	1,31,08,61,611
Glutaraldehyde (25 % in water)	SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany	23114.01
Heparin coating for tubes	Ension, Pittsburgh, USA	-
Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL)	LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany	PZN 15261203
Multiplate Reader Mithras LB 940	Berthold, Bad Wildbad, Germany	-
NaCl 0,9%	Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany	1312813
Neutral monovettes (9 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	2,10,63,001
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	70011044
Peristaltic pump ISM444B	Cole Parmer, Wertheim, Germany	3475
Pipette (100 µL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	3124000075
Pipette (1000 µL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	3123000063
Plastic container (100 mL)	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	7,55,62,300
PMN-Elastase ELISA	Demeditec Diagnostics, Kiel Germany	DEH3311
Polyvinyl chloride tube	Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France	-
Reaction Tubes (1.5 mL)	Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany	30123328
neurovascular laser-cut implants	Acandis GmbH, Pforzheim	01-0011x
SC5b-9 ELISA	TECOmedical, Buende, Germany	A029
Scanning electron microscope	Cambridge Instruments, Cambridge, UK	-
Sealing tape (96 well plate)	Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15036
Syringe 10/12 mL Norm-Ject	Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany	10080010
TAT micro kit	Siemens Healthcare, Marburg, Germany	OWMG15
Waterbath Type 1083	Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany	-