LarvaSPA, un método para montar larvas de Drosophila para imágenes de lapso de tiempo a largo plazo

Resumen

Este protocolo describe un método para el montaje de larvas de Drosophila para lograr más de 10 h de imágenes de lapso de tiempo ininterrumpidas en animales vivos intactos. Este método se puede utilizar para tomar imágenes de muchos procesos biológicos cerca de la pared del cuerpo larvario.

Resumen

Las imágenes en vivo son un enfoque valioso para investigar las preguntas sobre biología celular. La larva de Drosophila es particularmente adecuada para la toma de imágenes en vivo in vivo porque la pared del cuerpo larvario y la mayoría de los órganos internos son transparentes. Sin embargo, la imagen viva continua de larvas de Drosophila intactas durante más de 30 minutos ha sido un reto porque es difícil inmovilizar las larvas durante mucho tiempo. Aquí presentamos un método de montaje larvario llamado LarvaSPA que permite la toma de imágenes continuas de larvas droofílicas vivas con alta resolución temporal y espacial durante más de 10 horas. Este método consiste en unir parcialmente las larvas al cubreobjetos utilizando un pegamento reactivo uv-uv y, además, restringir el movimiento larvariado utilizando un bloque de polidimetilsiloxano (PDMS). Este método es compatible con larvas en etapas de desarrollo desde la segunda instar hasta la tercera estrella errante. Demostramos aplicaciones de este método en el estudio de procesos dinámicos de las neuronas Drosophila somatosensorial, incluyendo el crecimiento de dendrita y la degeneración inducida por lesiones. Este método también se puede aplicar para estudiar muchos otros procesos celulares que ocurren cerca de la pared del cuerpo larvario.

Introducción

Las imágenes en vivo de lapso de tiempo son un método potente para estudiar los procesos celulares dinámicos. La información espacial y temporal proporcionada por las películas de lapso de tiempo puede revelar detalles importantes para responder preguntas de biología celular. La larva Drosophila ha sido un modelo popular in vivo para las investigaciones utilizando imágenes en vivo porque su pared corporal transparente permite imágenes no invasivas de estructuras internas^1,2. Además, numerosas herramientas genéticas están disponibles en Drosophila para etiquetar fluorescentemente estructuras anatómicas y macromoléculas³. Sin embargo, las imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de las larvas de Drosophila son desafiantes. A diferencia de los embriones tempranos estacionarios o pusias, las larvas de Drosophila se mueven constantemente, lo que requiere inmovilización para obtener imágenes en vivo. Las formas efectivas de inmovilizar larvas de Drosophila vivas incluyen el montaje en aceite de halocarbono con cloroformo^4,anestesiando utilizando isoflurano o solución de Dichlorvos^5,y comprimiendo entre el cubreobjetos y el portaobjetos del microscopio⁶. Aunque algunos de estos métodos se han utilizado para la microscopía, ninguno de ellos es eficaz para imágenes en vivo a largo plazo. Se desarrollaron otros métodos para la toma de imágenes de neuronas de pared corporal en larvas rastreras utilizando microscopía confocal convencional o microscopía de láminas ligeras^7,8,9. Sin embargo, estos métodos no son ideales para monitorear la dinámica celular debido al movimiento de las larvas.

Se han desarrollado nuevos métodos para lograr imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de larvas de Drosophila. Utilizando un "chip larva" de polidimetilsiloxano (PDMS), las larvas de Drosophila pueden ser inmovilizadas eficazmente a través de la succión generada por vacío en una microcámara especializada sin anestesia. Sin embargo, este método no ofrece alta resolución temporal para estudios de biología celular y tiene estrictas limitaciones en el tamaño animal¹⁰. Otro método que utiliza un dispositivo de anestesia logró imágenes en vivo de larvas de Drosophila en múltiples momentos y se ha aplicado para estudiar las uniones neuromusculares^{11,12,13,14,15,16}. Sin embargo, este método tampoco permite la toma de imágenes continuas durante más de 30 min y requiere el uso de desflurano repetidamente, lo que puede inhibir la actividad neuronal y afectar al proceso biológico estudiado^17,18. Recientemente, se ha utilizado un nuevo método que combina dispositivo microfluídico y crioanestesia para inmovilizar larvas de varios tamaños durante cortos períodos de tiempo (minutos)^19. Sin embargo, este método requiere dispositivos especializados como un sistema de enfriamiento y períodos más largos de inmovilización requieren enfriamiento repetido de las larvas.

Aquí presentamos un método versátil de inmovilización de larvas de Drosophila que es compatible con imágenes de lapso de tiempo ininterrumpidas durante más de 10 h. Este método, que llamamos "Estabilización de larvas por apego parcial" (LarvaSPA), implica adherir la cutícula larval a un cubreobjetos para obtener imágenes en una cámara de imágenes personalizada. Este protocolo describe cómo hacer la cámara de imágenes y cómo montar larvas en una variedad de etapas de desarrollo. En el método LarvaSPA, los segmentos de cuerpo deseados se fijan a la capa con un pegamento reactivo UV. Un cuboide PDMS aplica además presión a las larvas, evitando el escape. El aire y la humedad en la cámara de imágenes aseguran la supervivencia de las larvas parcialmente inmovilizadas durante la toma de imágenes. Las ventajas de LarvaSPA sobre otras técnicas incluyen las siguientes: (1) Es el primer método que permite la toma continua de imágenes en vivo de larvas de Drosophila intactas durante horas con alta resolución temporal y espacial; (2) El método tiene menos limitaciones en el tamaño larvario; (3) La cámara de imágenes y los cuboides PDMS se pueden fabricar a un costo mínimo y son reutilizables.

Además de describir el método de montaje larvario, proporcionamos varios ejemplos de su aplicación para el estudio del desarrollo de dendrita y degeneración dendrita de las neuronas Drosophila dendrítica (da).

Protocolo

1. Hacer que la cámara de imágenes

1. El marco de metal se puede construir a partir de un bloque de aluminio en un taller de máquinas típico. Las especificaciones de la trama se ilustran en la Figura 1A.
2. Para construir la cámara de imágenes, selle la parte inferior del marco metálico con un cubreobjetos largos (22 mm x 50 mm) y pegamento UV(Figura 1A). Curar el pegamento UV con una lámpara UV de mano.

2. Fabricación de cuboides PDMS

1. Prepare el molde para cuboides PDMS.
   1. Fije las capas de cinta de embalaje a la superficie interior de una placa rectangular (80 mm x 55 mm) de placa de cultivo de celda redonda o placa de cultivo de celda redonda. Utilice una capa (0,063 mm de espesor) para larvas de segunda estrella, 2 capas (0,126 mm de espesor) para larvas de tercera estrella tempranas o tres capas (0,189 mm de espesor) para larvas de tercera estrella tardías(Figura 1B).
   2. Corte la cinta en tiras de anchura específica con una cuchilla de afeitar: 1,5 mm para la cinta de 1 capa y 2 mm para cinta de 2 o 3 capas. El ancho y el grosor de la tira determinarán el tamaño de las larvas que el cuboide final PDMS puede contener. Deje al menos un espacio de 5 mm entre las dos tiras. Quite las capas de cinta que cubren el espacio(Figura 1B).
   3. Retire el polvo de la superficie interior de la placa con cinta adhesiva. El molde está listo para su uso.
2. Prepare la combinación de PDMS.
   1. Mezclar 7 g de base PDMS y 0,7 g de agente de curado (relación 10:1) a fondo en un recipiente pequeño.
   2. Coloque el recipiente en un desecador al vacío durante al menos 15 minutos para eliminar el aire de la mezcla.
   3. Vierta lentamente alrededor de 5,5 g de mezcla PDMS sobre el molde para alcanzar un espesor de 1-2 mm(Figura 1B).
   4. Coloque de nuevo la mezcla PDMS en el desecador al vacío durante al menos 15 minutos para eliminar las burbujas de aire restantes de la mezcla. Rompe las últimas burbujas con una punta de pipeta.
   5. Curar el PDMS sobre una superficie plana en una incubadora de calor a 65oC durante 2 h.
   6. Utilice una cuchilla de afeitar para aflojar el PDMS curado a lo largo del borde del molde y separarlo del molde. Almacene el PDMS entre dos piezas de cinta adhesiva grande a temperatura ambiente.
   7. Para larvas de tercera instar tempranas y tardías, corte el PDMS en cuboides de 8 mm x 2 mm x 1 mm (a lo largo de las líneas punteadas de la Figura 1B)colocando la ranura creada por la tira de cinta (paso 2.1.2) en el centro del lado largo del cuboide(Figura 1B,C). Para larvas de segunda estrella, corte el cuboide a 8 mm x 1 mm x 1 mm.

3. Montaje de larvas para imágenes de lapso de tiempo a largo plazo

1. Prepare la cubierta superior para el montaje.
   1. Elija seis cuboides PDMS con ranuras que coincidan con los tamaños de las larvas. Siga la ranura y el tamaño recomendados de PDMS en función de los pasos 2.1.1, 2.1.2 y 2.2.7.
   2. Retire el polvo de la superficie del PDMS con cinta adhesiva.
   3. Coloque cuatro piezas de cinta de doble cara (12 mm x 5 mm) en un tapón largo (22 mm x 50 mm) para fijar más adelante cuboides PDMS. Los espacios entre las dos piezas de cinta de doble cara deben ser los mismos que la anchura de la ranura PDMS.
   4. Aplique una pequeña gota (-1,2 l) de pegamento UV en la ranura de cada cuboide PDMS y agregue seis pequeñas gotas de pegamento UV en el espacio entre la cinta de doble cara en el cubreobjetos.
2. Preparen las larvas para el montaje.
   1. Con un par de fórceps, limpie las larvas en agua para eliminar los alimentos de la superficie del cuerpo.
   2. Coloque las larvas limpias sobre un pequeño trozo de papel tisú humedecido en un plato Petri pequeño (35 mm) sin tapa. Coloque el pequeño plato Petri en un plato Petri grande (60 mm) que contenga un pedazo de papel de tejido seco. En una campana química, aplique de 8 a 12 gotas (160–240 l) de isoflurano sobre el papel de tejido seco utilizando una pipeta de transferencia de plástico y cierre la tapa de la gran placa Petri.
   3. Espere de 2 a 3 minutos mientras monitorea las larvas. Saca las larvas del plato grande de Petri una vez que sus ganchos bucales dejen de moverse.
3. Monte los animales.
   1. Para crear imágenes de estructuras en el lado dorsal del animal, coloque las larvas inmovilizadas en el pegamento UV entre la cinta de doble cara en el cubreobjetos con la cutícula dorsal mirando hacia el cubreobjetos.
   2. Cubra cada larva con un bloque PDMS y ajuste el tronco de la larva en la ranura del PDMS. Deje la cabeza y la cola de la larva fuera de la ranura pdmS. Evite bloquear los espiráculos de la larva por el pegamento.
   3. Presione hacia abajo en los extremos del bloque PDMS sobre la cinta de doble cara sin aplicar fuerza en la ranura. Tire suavemente de la cola de la larva para aplanar la cutícula debajo del PDMS.
   4. Curar el pegamento UV durante 4 minutos con una lámpara UV de mano en el ajuste alto (a aproximadamente 0,07 mW/mm²).
      ADVERTENCIA: Proteja los ojos con gafas de seguridad mientras utiliza la lámpara UV.
   5. Voltee el cubreobjetos hacia abajo y repita el paso 3.3.4.
   6. Humedezca un pequeño trozo de papel de lente (15 mm x 30 mm) con 20 s–30 l de agua. Coloque el papel de lente humedecido en la parte inferior de la cámara de imágenes(Figura 1A,D).
   7. Coloque el cubreobjetos en la cámara para que las larvas estén orientadas hacia el interior de la cámara. Adherir ambos extremos de la cubierta a la superficie metálica usando pegamento UV(Figura 1A,D). El lado dorsal de las larvas está listo para la toma de imágenes bajo microscopio confocal(Figura 1E).

4. Imágenes

1. Imagen de larvas con un microscopio apropiado. Todos los resultados mostrados en este protocolo(Figura 2, Figura 3, Video S2, Video S3y Video S4)se adquirieron utilizando un sistema confocal con un objetivo de aceite de 40x (1.30 NA).

5. Recuperación de cámara de imágenes y cuboides PDMS

1. Después de la toma de imágenes, retire el aceite de la cubierta superior con un papel de lente. Separe el cubreobjetos superiores de la estructura metálica cortando en el espacio entre el cubreobjetos y el marco de metal con una cuchilla de afeitar. La cámara de imágenes está lista para su reutilización.
2. Separe los cuboides PDMS de la cubierta superior con fórceps. Enrolle los cuboides PDMS en cinta adhesiva para eliminar los residuos de pegamento y el polvo. Los cuboides de PDMS están listos para su reutilización.

Resultados

La cámara de imágenes de larvas se construye pegando un marco de metal hecho a medida y dos tapas juntas. El diseño del marco metálico se especifica en la Figura 1A. Las larvas de Drosophila dentro de la cámara se adhieren a la cubierta superior con la ayuda de pegamento UV y cuboides PDMS. La ranura en el cuboide PDMS y la cinta de doble cara que el cuboide se une para crear el espacio para sostener las larvas(Figura 1B,C). El PDMS tambié...

Discusión

Aquí describimos LarvaSPA, un método versátil de montaje de larvas Drosophila vivas para imágenes de lapso de tiempo a largo plazo. Este método no requiere recuperar o volver a montar larvas, lo que permite imágenes ininterrumpidas. Por lo tanto, es ideal para el seguimiento de procesos biológicos que tardan horas en completarse, como la degeneración y regeneración de dendrita. Este método también se puede utilizar para la creación de imágenes de la dinámica de calcio intracelular y eventos subcelu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6061 Aluminum bars	McMaster-Carr	9246K421
3M double-sided tape	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch Packaging tape	3M		1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps	Fisher Scientific	50-241-34
Glass coverslip	Azer Scientific	1152250
Isoflurane	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Leica Confocal Microscope	Leica	SP8 equipped with a resonant scanner
Lens paper	Berkshire	LN90.0406.24
Petri dishes (medium)	VWR	25373-085
Petri dishes (small)	VWR	10799-192
Razor blade	Ted Pella, Inc.	121-20
Rectangular petri dish	VWR	25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Transferring pipette	Thermo Fisher Scientific	1371126
UV glue	Norland products	#6106, NOA 61	Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)	Maxxeon	MXN02003
Vacuum desiccator	Electron Microscopy Sciences	71232
Wipes	Kimberly-Clark	Kimwipes