JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает метод для монтажа личинок Дрозофилы для достижения более длительного времени, чем 10 ч непрерывного промежуток времени изображения в нетронутых живых животных. Этот метод может быть использован для изображения многих биологических процессов вблизи стенки личиночного тела.

Аннотация

Live изображений является ценным подходом для изучения вопросов клеточной биологии. Личка Drosophila особенно подходит для in vivo живой визуализации, потому что личиночной стенки тела и большинство внутренних органов прозрачны. Тем не менее, непрерывное живое изображение нетронутых личинок дрозофилы в течение более 30 минут было сложной задачей, потому что трудно неинвазивно иммобилизовать личинок в течение длительного времени. Здесь мы представляем метод личинки крепления называется LarvaSPA, что позволяет непрерывное изображение живых личинок Дрозофилы с высоким височной и пространственного разрешения в течение более 10 часов. Этот метод включает в себя частичное присоединение личинок к крышке с помощью УФ-реактивного клея и дополнительно сдерживающих личиночного движения с помощью полидиметилсилоксана (PDMS) блока. Этот метод совместим с личинками на стадиях развития от второго instar к блуждающим третий instar. Мы демонстрируем применение этого метода при изучении динамических процессов соматосенсорных нейронов Дрозофилы, включая рост дендрита и дегенерацию дендритов, вызванную травмами. Этот метод также может быть применен для изучения многих других клеточных процессов, которые происходят вблизи стенки личиночного тела.

Введение

Замедленное живое изображение является мощным методом изучения динамических клеточных процессов. Пространственная и временная информация, предоставляемая замедленной кино, может выявить важные детали для ответа на вопросы клеточной биологии. Larva Drosophila была популярной моделью in vivo для исследований с использованием живой визуализации, потому что ее прозрачная стенка тела позволяет неинвазивную визуализацию внутренних структур1,2. Кроме того, многочисленные генетические инструменты доступны в Drosophila флуоресцентно этикетки анатомических структур и макромолекулы3. Тем не менее, долгосрочные замедленной визуализации личинки Дрозофилы является сложной задачей. В отличие от стационарных ранних эмбрионов или кусков, личинки Дрозофилы постоянно двигаются, что требует иммобилизации для живой визуализации. Эффективные способы иммобилизации живых личинок Drosophila включают монтаж в галоуглеродном масле с хлороформом4,анестезию с использованием изофларана или раствора Dichlorvos5,и сжатие между крышкой и микроскопом слайд6. Хотя некоторые из этих методов были использованы для микроскопии, ни один из них не эффективен для долгосрочной живой визуализации. Другие методы были разработаны для визуализации нейронов стенки тела в ползающих личинок с помощью обычной конфокальной микроскопии или световой микроскопии7,8,9. Однако эти методы не являются идеальными для мониторинга клеточной динамики из-за движения личинок.

Разработаны новые методы для получения долгосрочной замедленной визуализации личинок Дрозофилы. Используя polydimemesiloxane (PDMS) "личинки" личинки drosophila могут быть эффективно обездвижены через вакуумгенерационного всасывания в специализированной микрокамере без анестезии. Тем не менее, этот метод не предлагает высокое временное разрешение для исследований клеточной биологии и имеет строгие ограничения на размер животного10. Другой метод с помощью анестезии устройство достигло живой визуализации личинок Дрозофилы в нескольких точках времени и был применен для изучения нервно-мышечныхсоединений 11,12,13,14,15,16. Тем не менее, этот метод также не позволяет непрерывной визуализации дольше, чем 30 мин и требует использования desflurane неоднократно, что может препятствовать нервной активности и повлиять на биологический процесс изучены17,18. Недавно, новый метод, который сочетает в себе микрофлюидное устройство и криоанестезия была использована для обездвиживания личинок различных размеров в течение коротких периодов времени (минуты)19. Однако этот метод требует специализированных устройств, таких как система охлаждения и более длительные периоды иммобилизации требуют повторного охлаждения личинок.

Здесь мы представляем универсальный метод иммобилизации личинок Дрозофилы, который совместим с непрерывной визуализацией замедленного времени дольше 10 ч. Этот метод, который мы называем "Larva Стабилизация частичным креплением" (LarvaSPA), включает в себя присоединение личинки кутикулы к крышке для визуализации в специально построенной камеры изображения. Этот протокол описывает, как сделать камеру изображения и как смонтировать личинки на различных стадиях развития. В методе LarvaSPA нужные сегменты тела прикрепляются к крышке с помощью УЛЬТРАактивного клея. Кубид PDMS дополнительно применяет давление на личинки, предотвращая побег. Воздух и влага в камере визуализации обеспечивают выживание частично обездвиженых личинок во время визуализации. Преимущества LarvaSPA по сравнению с другими методами включают в себя следующее: (1) Это первый метод, который позволяет непрерывной живой визуализации нетронутых личинок Дрозофилы в течение нескольких часов с высоким временным и пространственным разрешением; (2) Метод имеет меньше ограничений на размер личинки; (3) Камера изображений и кубоиды PDMS могут быть изготовлены при минимальных затратах и многоразовые.

В дополнение к описанию метода монтажа личинок, мы предоставляем несколько примеров его применения для изучения развития дендритов и дегенерации дендритов дендритной дендритной беседки Drosophila (da) нейронов.

протокол

1. Создание камеры визуализации

  1. Металлическая рама может быть построена из алюминиевого блока в типичном машинном цехе. Характеристики кадра иллюстрируются на рисунке 1A.
  2. Чтобы построить камеру изображения, уплотнение нижней части металлической рамы с помощью длинного покрытия (22 мм х 50 мм) и УФ-клей(рисунок 1А). Лечить ультрафиолетовый клей с помощью ручной ультрафиолетовой лампы.

2. Изготовление кубоидов PDMS

  1. Подготовка формы для CUBoids PDMS.
    1. Прикрепите слои упаковочной ленты к внутренней поверхности прямоугольной (80 мм х 55 мм) чашке Петри или круглой пластине культуры клеток. Используйте один слой (0,063 мм толщиной) для вторых личинок instar, 2 слоя (0,126 мм толщиной) для ранних третьих личинок instar, или три слоя (0,189 мм толщиной) для поздних третьих личинок instar(рисунок 1B).
    2. Нарежьте ленту полосками определенной ширины лезвием: 1,5 мм для 1-слойной ленты и 2 мм для 2-слойной или 3-слойной ленты. Ширина и толщина полосы определят размер личинок, которые может вместить конечный кубоид PDMS. Оставьте по крайней мере 5 мм пространство между двумя полосами. Удалите ленточные слои, покрывающие пространство(рисунок 1B).
    3. Удалите пыль с внутренней поверхности пластины с помощью липкой ленты. Плесень готова к использованию.
  2. Подготовка смеси PDMS.
    1. Тщательно смешайте 7 г основания PDMS и 0,7 г лечебного средства (коэффициент 10:1) в небольшом контейнере.
    2. Поместите контейнер в вакуумный обезвреженку в течение по крайней мере 15 минут, чтобы удалить воздух из смеси.
    3. Медленно залить около 5,5 г смеси PDMS на плесень, чтобы достичь 1-2 мм толщины(рисунок 1B).
    4. Поместите смесь PDMS в вакуумный desiccator снова, по крайней мере 15 минут, чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха из смеси. Разбейте последние несколько пузырей с кончиком пипетки.
    5. Лечить PDMS на плоской поверхности в тепловом инкубаторе при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
    6. Используйте лезвие бритвы, чтобы ослабить вылечить PDMS вдоль края формы и отделить его от формы. Храните PDMS между двумя кусками большой липкой ленты при комнатной температуре.
    7. Для ранних и поздних третьих личинок instar, разрезать PDMS на 8 мм х 2 мм х 1 мм кубоидов (вдоль пунктирных линий на рисунке 1B) путем позиционирования паз создан ленты полосы (шаг 2.1.2) в центре длинной стороны кубоида(Рисунок 1B, C). Для второго личинок instar, вырезать кубоид до 8 мм х 1 мм х 1 мм.

3. Монтаж личинок для долгосрочного замедленного изображения

  1. Подготовьте верхний покрывало для монтажа.
    1. Выберите шесть кубоидов PDMS с канавками, соответствующими размерам личинок. Следуйте рекомендуемому пазу и размеру PDMS на основе шагов 2.1.1, 2.1.2 и 2.2.7.
    2. Удалите пыль с поверхности PDMS с помощью липкой ленты.
    3. Прикрепите четыре части двусторонней ленты (12 мм х 5 мм) на длинном обкрытии (22 мм х 50 мм) для крепления кубодов PDMS позже. Пространства между двумя кусками двусторонней ленты должны быть такими же, как ширина паз PDMS.
    4. Нанесите небольшую каплю (1,2 евро) УФ-клея в паз каждого кубида PDMS и добавьте шесть небольших капель УФ-клея в пространство между двусторонней лентой на крышке.
  2. Подготовьте личинки для монтажа.
    1. Используя пару щиптем, очистить личинки в воде, чтобы удалить пищу с поверхности тела.
    2. Поместите чистые личинки на небольшой кусочек увлажненной бумаги в небольшой (35 мм) чашку Петри без крышки. Поместите небольшое блюдо Петри в большое (60 мм) чашку Петри, содержащую кусок сухой бумаги ткани. В химическом капюшоне нанесите 8-12 капель (160-240 л) изофлюрани на бумагу изофруран с помощью пластиковой передаваемой пипетки и закройте крышку большой чашки Петри.
    3. Подождите 2-3 мин при мониторинге личинок. Выняйте личинки из большой чашки Петри, как только их крючки рот перестают двигаться.
  3. Смонтировать животных.
    1. Для изображения структур на стороне вдовы животного, поместите обездвиженными личинок на УЛЬТРАВ-клей между двусторонней лентой на крышке с нижней кутикулы, обращенной к крышке.
    2. Обложка каждой личинки с блоком PDMS и поместить ствол личинки в паз PDMS. Оставьте голову и хвост личинки за пределами канавки PDMS. Избегайте блокирования брызг личинок клеем.
    3. Нажмите на концах блока PDMS на двусторонню ленту, не применяя силы на паз. Аккуратно потяните на хвост личинки, чтобы сгладить кутикулу под PDMS.
    4. Вылечить ультрафиолетовый клей в течение 4 минут с помощью ручной ультрафиолетовой лампы на высокой установке (при 0,07 мВт/мм2).
      ВНИМАНИЕ: Защитите глаза с помощью защитных очков при использовании УФ-лампы.
    5. Переверните coverslip вверх дном и повторите шаг 3.3.4.
    6. Смочите небольшой кусок бумаги объектива (15 мм х 30 мм) с 20 л-30 л воды. Поместите увлажненную бумагу объектива в нижней части камеры изображения(Рисунок 1A,D).
    7. Поместите крышку на камеру так, чтобы личинки сталкиваются с внутренней стороны камеры. Придерживайтесь обоих концов крышки к металлической поверхности с помощью УФ-клея(рисунок 1A,D). Дорсальная сторона личинок готова для визуализации под конфокальным микроскопом(рисунок 1E).

4. Визуализация

  1. Личинки изображений с соответствующим микроскопом. Все результаты, показанные в этом протоколе(Рисунок 2, Рисунок 3, Видео S2, Видео S3, и видео S4) были приобретены с помощью конфокальной системы с 40x (1.30 NA) нефтяной цели.

5. Восстановление камеры изображения и кубоидов PDMS

  1. После изображения, удалить масло на верхней крышкой с помощью бумаги объектива. Отсоедините верхний покрывало от металлического рамы, разрезая в пространство между крышкой и металлическим каркасом с лезвием бритвы. Камера изображения готова к повторному использованию.
  2. Отсоедините кубоиды PDMS от верхнего покрывала щипками. Roll PDMS кубоидов на липкой ленте, чтобы удалить остатки клея и пыли. Кубоиды PDMS готовы к повторному использованию.

Результаты

Камера личинок построена путем склеивания ручной металлической рамы и двух обложек вместе. Конструкция металлического каркаса указана на рисунке 1А. Личинки дрозофилы внутри камеры прилипают к верхнему облику с помощью УФ-клея и кубоидов PDMS. Паз на кубидоиде PDMS ?...

Обсуждение

Здесь мы описываем LarvaSPA, универсальный метод монтажа живых личинок Дрозофилы для долгосрочного замедленного изображения. Этот метод не требует восстановления или монтажа личинок, что позволяет непрерывно ею. Поэтому он идеально подходит для отслеживания биологических процессов...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.

Благодарности

Мы благодарим Lingfeng Tang за создание более ранней версии метода LarvaSPA; Гленн Лебедь в корнелл Олин Зал машинный цейт для изготовления более ранних прототипов камеры изображений; Филипп Исерман нон за изготовление металлических каркасов и предоставление предложений по изготовлению кубоидов PDMS; Cornell BRC Imaging для доступа к микроскопам (финансируется грантом NIH S10OD018516); Мария Сапар для критического прочтения рукописи. Эта работа была поддержана Корнелл стипендий присуждается HJ; Корнелл стартовый фонд и гранты NIH (R01NS099125 и R21OD023824), присужденные C.H. H.J. и C.H., задумали проект и разработали эксперименты. Х.Джей проводил эксперименты. Х.Джей и К.Х. написали рукопись.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6061 Aluminum barsMcMaster-Carr9246K421
3M double-sided tapeTed Pella, Inc.16093
3M Scotch Packaging tape3M1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 ForcepsFisher Scientific50-241-34
Glass coverslipAzer Scientific1152250
IsofluraneMidwest Veterinary Supply193.33161.3
Leica Confocal MicroscopeLeicaSP8 equipped with a resonant scanner
Lens paperBerkshireLN90.0406.24
Petri dishes (medium)VWR25373-085
Petri dishes (small)VWR10799-192
Razor bladeTed Pella, Inc.121-20
Rectangular petri dishVWR25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)Electron Microscopy Sciences24236-10
Transferring pipetteThermo Fisher Scientific1371126
UV glueNorland products#6106, NOA 61Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)MaxxeonMXN02003
Vacuum desiccatorElectron Microscopy Sciences71232
WipesKimberly-ClarkKimwipes

Ссылки

  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
  2. Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
  3. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
  4. Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
  5. Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
  6. Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
  7. He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
  8. Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
  9. Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
  10. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
  11. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
  12. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
  13. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
  14. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
  15. Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
  16. Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
  17. Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
  18. Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
  19. Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
  20. Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
  21. Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
  22. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  23. Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
  24. Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
  25. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
  26. Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
  27. Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
  28. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
  29. Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
  30. Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
  31. Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены