LarvaSPA, שיטה להרכבה ממושכת על זחל לטווח ארוך הדמיה לזמן קצר

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה להרכבת הזחלים של דרוזוהילה כדי להשיג יותר מ-10 שעות של הדמיה של הפרעות זמן בבעלי חיים חיים שלמים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לדמות תהליכים ביולוגיים רבים קרוב לקיר הגוף הזחל.

Abstract

הדמיה חיה היא גישה רבת ערך לחקירת שאלות בביולוגיה של התאים. הזחל של דרוזוהילה מתאים במיוחד להדמיה vivo חיה, משום שהקיר של גוף הזחל והאברים הפנימיים ביותר הם שקופים. עם זאת, הדמיה חיה רציפה של הזחלים של דרוזוהילה שלמים במשך יותר מ -30 דקות מאתגרת משום שקשה לשתק את הזחלים במשך זמן רב. כאן אנו מציגים שיטה הרכבה זחל בשם LarvaSPA המאפשרת הדמיה רציפה של הזחלים לחיות Drosophila ילה עם רזולוציה גבוהה בזמן ומרחבית במשך יותר מ -10 שעות. שיטה זו כרוכה חלקית הצמדת הזחלים כדי coverslip באמצעות דבק UV-תגובתי ובנוסף הרחקה התנועה זחל באמצעות polydiמתיל siloxane (PDMS) לחסום. שיטה זו תואמת לזחלים בשלבים ההתפתחותיים משלב שני ועד לנדידה השלישית. אנו מדגימים יישומים של שיטה זו במחקר תהליכים דינמיים של הנוירונים המגע הדרוזופילה, כולל הצמיחה דנדט וניוון הנגרמת מפגיעת הדנדריטים. ניתן ליישם שיטה זו גם על מנת לחקור תהליכים סלולאריים רבים אחרים המתרחשים ליד קיר הזחל.

Introduction

הדמיה בזמן ההדמיה החיה היא שיטה רבת-עוצמה ללימוד תהליכים סלולאריים דינמיים. המידע המרחבי והזמני המסופק על ידי סרטים בזמן קפיצה יכול לחשוף פרטים חשובים למענה לשאלות בביולוגיה של התא. הזחל Drosophila ילה היה פופולרי במודל vivo לחקירות באמצעות הדמיה חיה, כי קיר הגוף השקוף שלה מאפשר הדמיה לא פולשנית של מבנים פנימיים^1,2. בנוסף, כלים גנטיים רבים זמינים ב Drosophila ילה כדי fluorescently תווית מבנים אנטומיים ו³. עם זאת, הדמיה לטווח ארוך של הזחלים של דרוזוהילה מאתגרת. בשונה מעוברים מוקדמים נייחים או מגלמים, הזחלים דרוזופילה מתרחקים כל הזמן, ומצריכות הדמיה חיה. דרכים יעילות לשתק את הזחלים החיים בדרוזוהילה כוללים הרכבה בשמן הלוגן עם כלורופורם⁴, הרדמה באמצעות התמיסה Isof, או dichlorvos⁵, ודחיסה בין הכיסויים לבין שקופית המיקרוסקופ⁶. למרות שחלק מהשיטות הללו שימשו למיקרוסקופיה, אף אחד מהם אינו יעיל להדמיה חיה לטווח ארוך. שיטות אחרות פותחו עבור הדמיה קיר גוף נוירונים בזחלים זוחלים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית יקרוסקופית קונבנציונאלי או^{האור גיליון מיקרוסקופ 7,8,9}. עם זאת, שיטות אלה אינן אידיאליות לניטור הדינמיקה התאית בשל התנועה של הזחלים.

שיטות חדשות פותחו על מנת להשיג הדמיה ארוכת טווח של הזחלים של דרוזוהילה . באמצעות שימוש פולידימיתיל siloxane (PDMS) "זחל", הזחלים Drosophila ילה ניתן להשתמש ביעילות באמצעות שאיבה שנוצר על ידי ואקום במיקרו בחדר מיוחד בלי לרפוטיזציה. עם זאת, שיטה זו אינה מציעה רזולוציה גבוהה בזמן עבור לימודי הביולוגיה של התא והיא בעלת מגבלות קפדניות על מידה¹⁰של בעלי חיים. שיטה נוספת המשתמשת במכשיר ההרדמה השיגה הדמיה חיה של הזחלים של דרוזופילה בנקודות זמן מרובות, והחלה לחקור את הצמתים הנוירוקולסטיים^{11,12,13,14,15,16}. עם זאת, שיטה זו אינה מאפשרת הדמיה רציפה במשך יותר מ -30 דקות ודורשת שימוש בדפלוראנה שוב ושוב, אשר יכול לעכב את הפעילות העצבית ולהשפיע על התהליך הביולוגי שנלמד^17,18. לאחרונה, שיטה חדשה המשלבת התקן microflu, וקריוהרדמה השתמשו כדי לשתק את הזחלים בגדלים שונים לפרקי זמן קצרים (דקות)¹⁹. עם זאת, שיטה זו מחייבת התקנים מיוחדים כגון מערכת קירור, ופרקי זמן ארוכים יותר דורשים צינון חוזר ונשנה של הזחלים.

כאן אנו מציגים שיטה רב-תכליתית של הזחלים דרוזופילה שתואם לדימות זמן ממושך של הדמיה במשך יותר מ -10 שעות. שיטה זו, אשר אנו מכנים "ייצוב זחל על ידי קובץ מצורף חלקית" (LarvaSPA), כרוך שמירה על העור הזחל לתוך coverslip עבור הדמיה בחדר הדמיה בנוי אישית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפוך את חדר ההדמיה וכיצד לטעון זחלים במגוון שלבים התפתחותיים. בשיטה LarvaSPA, מקטעי הגוף הרצוי מודבקת את שמיכות באמצעות דבק UV-תגובתי. בנוסף, מתחיל הלחץ על הזחלים של PDMS, מניעת בריחה. האוויר והלחות בחדר ההדמיה מבטיחים את הישרדותם של הזחלים המוחדרים חלקית במהלך ההדמיה. היתרונות של LarvaSPA על טכניקות אחרות כוללים את הפעולות הבאות: (1) זוהי השיטה הראשונה המאפשרת הדמיה מתמשכת של הזחלים הדרוזופילה שלמים במשך שעות עם הזמן הגבוה והרזולוציה המרחבית; (2) לשיטה יש פחות הגבלות על גודל הזחל; (3) חדר ההדמיה ו-pdms קובוידס יכול להיות מיוצר בעלות מינימלית הם לשימוש חוזר.

בנוסף לתיאור שיטת הרכבת הזחל, אנו מספקים מספר דוגמאות של היישום שלה לחקר התפתחות הדנדריטים ו הדנדריטים מניוון של דרוסופילה הדנדריטים הדנדריזציה (da) נוירונים.

Protocol

1. הפיכת חדר ההדמיה לתמונה

1. ניתן לבנות את מסגרת המתכת מבלוק אלומיניום בחנות מכונות טיפוסית. המפרט של המסגרת מומחש באיור 1א.
2. כדי לבנות את חדר ההדמיה, לאטום את החלק התחתון של מסגרת מתכת באמצעות coverslip ארוך (22 מ"מ x 50 מ"מ) ו-UV דבק (איור 1א). מרפאים את הדבק UV באמצעות מנורת UV שנערך ביד.

2. ביצוע pdms קובוידס

1. הכן את העובש. לגבי cuboids של PDMS
   1. צרף שכבות של נייר אריזה למשטח הפנימי של מלבני (80 מ"מ x 55 מ"מ) צלחת פטרי או לוח עגול התרבות התאים. השתמש בשכבה אחת (0.063 מ"מ עבה) עבור הזחלים השני, 2 שכבות (0.126 מ"מ עבה) עבור הזחלים השלישי מוקדם, או שלוש שכבות (0.189 מ"מ עבה) עבור הזחלים השלישיהראשון העשרה (איור 1B).
   2. חותכים את הקלטת לרצועות של רוחב ספציפי עם להב תער: 1.5 mm עבור הקלטת 1-layer, ו-2 מ"מ עבור קלטת 2-שכבה או 3-שכבה. רוחב ועובי של הרצועה יקבע את גודל הזחלים כי קוביות PDMS הסופי יכול להחזיק. השאירו לפחות מרווח של 5 מ"מ בין שתי הרצועות. הסר את שכבות הקלטת המכסות את השטח (איור 1B).
   3. להסיר אבק מהמשטח הפנימי של הצלחת באמצעות סרט דביק. . העובש מוכן לשימוש
2. הכן את תמהיל ה-PDMS.
   1. מערבבים 7 גרם של בסיס PDMS ו 0.7 g של ריפוי סוכן (10:1 יחס) ביסודיות במיכל קטן.
   2. מניחים את המיכל בתוך ואקום desiccator לפחות 15 דקות כדי להסיר את האוויר מן התערובת.
   3. לאט למזוג כ 5.5 g של התערובת PDMS על התבנית כדי להגיע לעובי של 1 – 2 מ"מ (איור 1B).
   4. מניחים את התערובת PDMS ב ואקום desiccator שוב לפחות 15 דקות כדי להסיר את בועות האוויר הנותרים מן התערובת. לשבור את הבועות האחרונים עם טיפ פיפטה.
   5. לרפא את PDMS על משטח שטוח בחממה חום ב 65 ° c עבור 2 h.
   6. השתמש להב גילוח כדי לשחרר את PDMS נרפא לאורך קצה העובש ולנתק אותו מן העובש. אחסן את ה-PDMS בין שתי פיסות נייר דביק גדול בטמפרטורת החדר.
   7. עבור הזחלים השלישי מוקדם ומאוחר, לחתוך את pdms לתוך 8 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מילימטר קובוידס (לאורך הקווים מנוקד באיור 1B) על-ידי מיקום החריץ שנוצר על-ידי רצועת הקלטת (step 2.1.2) במרכז הצד הארוך של התיבה (איור 1ב, ג). עבור הזחלים השני, לחתוך את התיבה כדי 8 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ.

3. הרכבה הזחלים לאורך זמן להדמיה לטווח ארוך

1. הכינו את הכיסויים העליונים להרכבה.
   1. לבחור שש pdms קובוידס עם חריצים התואמים את הגדלים של הזחלים. בצע את החריץ והגודל המומלצים של PDMS בהתבסס על שלבים 2.1.1, 2.1.2 ו2.2.7.
   2. להסיר אבק מהמשטח של PDMS עם קלטת דביק.
   3. צרף ארבע חתיכות של קלטת כפולה (12 מ"מ x 5 מ"מ) על שמיכות ארוך (22 מ"מ x 50 מ"מ) לתיקון קובוידס pdms מאוחר יותר. הרווחים בין שתי הפרוסות של הסרט הכפול אמורים להיות זהים לרוחב החריץ של PDMS.
   4. החל טיפה קטנה (~ 1.2 μL) של דבק UV לתוך החריץ של כל אחד מקוביות ה-PDMS והוסף שש טיפות קטנות של דבק UV לחלל שבין הקלטת הכפולה על הכיסויים.
2. . הכן את הזחלים להרכבה
   1. באמצעות זוג מלקחיים, לנקות את הזחלים במים כדי להסיר מזון מפני השטח של הגוף.
   2. הניחו את הזחלים הנקיים על פיסת נייר קטנה של רקמה מצומצמת בצלחת פטרי קטנה (35 מ"מ) ללא מכסה. מניחים את צלחת פטרי קטנה לתוך גדול (60 מ"מ) צלחת פטרי המכילה פיסת נייר טישו יבש. בשכונה כימית, להחיל 8 – 12 טיפות (160-240 μL) של isof, על נייר הרקמה היבשה באמצעות הצנרת פלסטיק העברת ולסגור את המכסה של צלחת פטרי גדול.
   3. המתן 2 – 3 דקות תוך ניטור הזחלים. להוציא את הזחלים מהצלחת פטרי גדולה פעם ווים הפה שלהם להפסיק לזוז.
3. . הר החיות
   1. כדי מבני התמונה בצד השני של החיה, מניחים את הזחלים מקיבוע על הדבק UV בין הקלטת הדו על הכיסויים עם הקוטיקולה הצדדית מול הכיסויים.
   2. לכסות כל זחל עם בלוק PDMS ולהתאים את המטען של הזחל לתוך החריץ של PDMS. השאר את הראש ואת זנב הזחל מחוץ לחריץ PDMS. הימנע מחסימת הנושפות של הזחל על ידי הדבק.
   3. לחץ על קצות הבלוק של PDMS אל הקלטת הכפולה מבלי להחיל כוח על החריץ. משוך בעדינות את זנב הזחל כדי לשטח את הקוטיקולה מתחת ל-PDMS.
   4. לרפא את הדבק UV עבור 4 דקות באמצעות מנורת UV מוחזק ביד בסביבה גבוהה (על 0.07 mW/mm²).
      התראה: הגן על העיניים עם משקפי הבטיחות בעת שימוש במנורת UV.
   5. הפוך את הכיסויים הפוכים וחזור על שלב 3.3.4.
   6. מויסטן חתיכה קטנה של נייר עדשה (15 מ"מ x 30 מ"מ) עם 20 μL – 30 μL של מים. הציבו את נייר העדשה ההרטיב בתחתית חדר ההדמיה (איור 1א, ד).
   7. הניחו את הכיסויים על החדר כדי שזחלים יהיו מול החלק הפנימי של החדר. לדבוק שני הקצוות של שמיכות למשטח המתכת באמצעות דבק UV (איור 1A, D). הצד השני של הזחלים מוכן להדמיה במיקרוסקופ קונפוקלית וקד (איור 1E).

4. הדמיה

1. הזחלים של התמונה עם המיקרוסקופ המתאים. כל התוצאות המוצגות בפרוטוקול זה (איור 2, איור 3, וידאו S2, S3 וידאו, ו- video S4) נרכשו באמצעות מערכת קונפוקלית וקד עם 40x (1.30 NA) מטרת הנפט.

5. השחזור של חדר הדמיה pdms קובוידס

1. לאחר הדמיה, להסיר את השמן על שמיכות העליון באמצעות נייר עדשה. לנתק את שמיכות העליון מתוך מסגרת מתכת על ידי חיתוך לחלל בין שמיכות ומסגרת מתכת עם להב תער. . חדר ההדמיה מוכן לשימוש חוזר
2. לנתק את קובוידס pdms מתוך coverslip העליון עם מלקחיים. גלגל את קובוידס pdms על סרט דביק כדי להסיר שאריות דבק אבק. קובוידס pdms מוכנים לשימוש חוזר.

תוצאות

חדר ההדמיה הזחל נבנה על ידי הדבקת מסגרת מתכת בהתאמה אישית ושני כיסוי ביחד. העיצוב של מסגרת המתכת מצוין באיור 1א. הזחלים של דרוזופילה בתוך החדר מדבקים לסרבל העליון בעזרת דבק UV ו-pdms cuboids. החריץ בתיבה הצדדית PDMS ובקלטת הדו-צידית מצורפת התיבה כדי ליצור את החלל להחזיק את הזח...

Discussion

כאן אנו מתארים LarvaSPA, שיטה רב-תכליתית של הרכבה חיה דרוזופילה לחיות לטווח ארוך הדמיה הזמן. שיטה זו אינה דורשת החלמה או הרכבה מחדש של זחלים, המאפשרים הדמיה ללא הפרעה. לכן הוא אידיאלי למעקב אחר תהליכים ביולוגיים שייקח שעות להשלים, כגון ניוון דנדט והתחדשות. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור הדמיה ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6061 Aluminum bars	McMaster-Carr	9246K421
3M double-sided tape	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch Packaging tape	3M		1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps	Fisher Scientific	50-241-34
Glass coverslip	Azer Scientific	1152250
Isoflurane	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Leica Confocal Microscope	Leica	SP8 equipped with a resonant scanner
Lens paper	Berkshire	LN90.0406.24
Petri dishes (medium)	VWR	25373-085
Petri dishes (small)	VWR	10799-192
Razor blade	Ted Pella, Inc.	121-20
Rectangular petri dish	VWR	25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Transferring pipette	Thermo Fisher Scientific	1371126
UV glue	Norland products	#6106, NOA 61	Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)	Maxxeon	MXN02003
Vacuum desiccator	Electron Microscopy Sciences	71232
Wipes	Kimberly-Clark	Kimwipes