LarvaSPA，一种用于长期延时成像的安装果蝇幼虫的方法

摘要

该协议描述了一种在完整的活体动物中安装果蝇幼虫以实现超过10小时的不间断延时成像的方法。该方法可用于成像许多靠近幼虫体壁的生物过程。

摘要

活成像是研究细胞生物学问题的宝贵方法。果蝇幼虫特别适合体内活体成像，因为幼虫体壁和大多数内部器官是透明的。然而，对完整果蝇幼虫进行超过30分钟的连续活成像一直具有挑战性，因为长期以来很难非侵入性的防活动幼虫。在这里，我们提出了一种称为LarvaSPA的幼虫安装方法，它允许对具有高时空分辨率的活果蝇幼虫进行连续成像，时间及空间分辨率超过10小时。此方法涉及使用紫外线反应胶将幼虫部分附着在盖玻片上，并使用聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 块额外限制幼虫运动。该方法与处于发育阶段的幼虫相容，从第二星到游荡第三星。我们演示了这种方法在研究果蝇体细胞感觉神经元的动态过程中的应用，包括树突生长和损伤引起的树突退化。该方法还可用于研究在幼虫体壁附近发生的许多其他细胞过程。

引言

延时实时成像是研究动态细胞过程的有力方法。延时电影提供的空间和时间信息可以揭示回答细胞生物学问题的重要细节。果蝇幼虫一直是一个流行的体内模型，用于使用活成像研究，因为它透明的体壁允许对内部结构^1，2进行非侵入性成像。此外，在果蝇中，有许多遗传工具可用于荧光标记解剖结构和大分子^3。然而，对果蝇幼虫进行长期延时成像具有挑战性。与静止的早期胚胎或幼虫不同，果蝇幼虫不断移动，需要固定进行活体成像。固定活果蝇幼虫的有效方法包括:用氯仿⁴安装在卤化碳油中，使用胶原素或二氯沃斯溶液⁵进行麻醉，以及压缩盖玻片和显微镜幻灯片^6。虽然其中一些方法已用于显微镜，但没有一个对长期活成像有效。其他方法被开发成像身体壁神经元在爬行幼虫使用传统的共聚焦显微镜或光片显微镜^7，8，9。然而，由于幼虫的运动，这些方法不是监测细胞动力学的理想方法。

开发了新的方法，以实现果蝇幼虫的长期延时成像。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）"幼虫芯片"，果蝇幼虫可以通过真空产生的吸力在专用微室中有效固定，无需麻醉。然而，这种方法没有为细胞生物学研究提供高时间分辨率，对动物大小¹⁰有严格的限制。另一种使用麻醉装置的方法在多个时间点实现了果蝇幼虫的活成像，并已应用于研究神经肌肉结11、12、13、14、15、16。然而，这种方法也不允许连续成像超过30分钟，并要求反复使用去氟化物，这可以抑制神经活动，影响研究^17，18的生物过程。最近，一种将微流体装置和冷冻麻醉相结合的新方法被用于短时间（分钟^）19固定各种大小的幼虫。然而，这种方法需要专门的设备，如冷却系统，长时间的固定需要反复冷却幼虫。

在这里，我们提出了一种多功能的固定果蝇幼虫的方法，与不间断的延时成像相容，时间超过10小时。这种方法，我们称之为"拉瓦稳定部分附件"（LarvaSPA），涉及将幼虫角膜粘附在一个覆盖玻片上，用于在定制的成像室进行成像。该协议描述了如何使成像室，以及如何在各种发育阶段安装幼虫。在 LarvaSPA 方法中，所需的车身段使用紫外线反应胶贴在盖玻片上。PDMS 立体体另外对幼虫施加压力，防止逃生。成像室中的空气和水分可确保在成像过程中部分固定的幼虫存活。LarvaSPA 比其他技术的优点包括:（1） 它是允许对完整的果蝇幼虫进行连续活成像的第一种方法，其时间和空间分辨率较高;（2）该方法对幼虫大小的限制较少;（3） 成像室和PDMS立体体可以以最低的成本制造，并且可重复使用。

除了描述幼虫安装方法外，我们还提供了几个用于研究树突发育和树突变性的树突树种树突化（da）神经元的例子。

研究方案

1. 制作成像室

1. 金属框架可以从典型机器车间的铝块中构造。图1A说明了框架的规格。
2. 要构建成像室，请使用长盖玻片（22 mm x 50 mm）和 UV 胶水（图 1A） 密封金属框架的底部。使用手持紫外线灯固化 UV 胶水。

2. 制作 PDMS 立体体

1. 为 PDMS 立体体准备模具。
   1. 将包装胶带层连接到矩形（80 mm x 55 mm）培养盘或圆形细胞培养板的内表面。使用一层（0.063 毫米厚）用于第二星幼虫，2 层（0.126 毫米厚）用于早期第三星幼虫，或为后三星幼虫使用三层（0.189 毫米厚）（图 1B）。
   2. 使用剃刀刀片将胶带切成特定宽度的条状:1 层胶带为 1.5 mm，2 mm 用于 2 层或 3 层胶带。条带的宽度和厚度将决定最终 PDMS 立体体可以容纳的幼虫的大小。在两条条之间留出至少 5 mm 的空间。拆下覆盖空间的胶带层 （图 1B）。
   3. 使用胶带清除板内表面的灰尘。模具已准备就绪，可供使用。
2. 准备 PDMS 组合。
   1. 将 7 g 的 PDMS 底座和 0.7 g 的固化剂（10:1 比例）彻底混合在小容器中。
   2. 将容器置于真空干燥器中至少 15 分钟，以清除混合物中的空气。
   3. 缓慢将约 5.5 g 的 PDMS 混合物倒入模具中，达到 1⁄2 mm 厚度（图 1B）。
   4. 将 PDMS 混合物再次放入真空干燥器至少 15 分钟，以清除混合物中剩余的气泡。用移液器尖端打破最后几个气泡。
   5. 在65°C的热培养箱中将PDMS固化在平坦的表面上2小时。
   6. 使用剃刀刀片沿模具边缘松开固化的 PDMS 并将其从模具上拆下。在室温下将 PDMS 存放在两块大型胶带之间。
   7. 对于早期和晚期的第三星幼虫，通过将胶带条（步骤 2.1.2）创建的凹槽放置在长方的中侧中心（图 1B，C）将 PDMS 切成 8 mm x 2 mm x 1 mm 立体体（沿图1BB中的虚线）。对于第二个星幼虫，将小方体切割为 8 mm x 1 mm x 1 mm。

3. 安装幼虫，进行长期延时成像

1. 准备顶盖玻片进行安装。
   1. 选择六个与幼虫大小相匹配的凹槽的PDMS立体体。根据步骤 2.1.1、2.1.2 和 2.2.7 遵循建议的 PDMS 槽和尺寸。
   2. 用胶带清除 PDMS 表面的灰尘。
   3. 在长盖玻上（22 毫米 x 50 毫米）上连接四块双面胶带（12 mm x 5 mm），以便以后固定 PDMS 立体体。两块双面胶带之间的空间应与 PDMS 凹槽的宽度相同。
   4. 将一小滴（±1.2 μL）UV胶水涂入每个PDMS立方体的凹槽中，并在盖玻上双面胶带之间的空间中加入六小滴UV胶。
2. 准备幼虫进行安装。
   1. 使用一对钳子，清洁水中的幼虫，从身体表面去除食物。
   2. 将干净的幼虫放在一小块湿润纸巾上，放入一个没有盖子的小（35毫米）培养皿中。将小培养皿放入一个大（60毫米）培养皿中，里面装着一块干纸巾。在化学罩中，使用塑料转移移液器将 8⁄12 滴（160–240 μL） 的烟胶涂抹在干纸巾上，并合上大型培养皿的盖子。
   3. 在监测幼虫时等待 2-3 分钟。一旦它们的嘴钩停止移动，从大培养皿中拿出幼虫。
3. 安装动物。
   1. 要对动物背端的结构进行成像，将固定的幼虫放在覆盖唇上的双面胶带之间的UV胶水上，背角质朝向盖玻片。
   2. 用PDMS块覆盖每个幼虫，并将幼虫的躯干放入PDMS的凹槽中。将幼虫的头部和尾部留在 PDMS 凹槽外。避免用胶水堵住幼虫的尖刺。
   3. 将 PDMS 块的两端向下压到双面胶带上，而不对凹槽施加力。轻轻拉上幼虫的尾巴，将 PDMS 下的角质层压平。
   4. 在高设置（约 0.07 mW/mm²）使用手持紫外线灯固化 UV 胶水 4 分钟。
      注意:使用紫外线灯时，用安全眼镜保护眼睛。
   5. 倒置盖玻片并重复步骤 3.3.4。
   6. 用 20 μL×30 μL 的水润湿一小片透镜纸（15 毫米 x 30 毫米）。将湿透镜纸放在成像室底部（图1A，D）。
   7. 将盖玻片放在造型室上，使幼虫朝向造型室内部。使用 UV 胶水将盖玻片的两端粘附在金属表面（图 1A，D）。幼虫的背侧已准备好在共聚焦显微镜下成像（图1E）。

4. 成像

1. 使用适当的显微镜成像幼虫。该协议中显示的所有结果（图2，图3，视频S2，视频S3和视频S4）都是使用具有40倍（1.30 NA）油目标的共聚焦系统获得的。

5. 成像室和PDMS立体体的恢复

1. 成像后，使用透镜纸去除顶盖玻片上的机油。使用剃刀刀片切入盖玻片和金属框架之间的空间，将顶盖玻片从金属框架上拆下。成像室已准备好重复使用。
2. 用钳子将 PDMS 立体体从顶盖滑上拆下。将 PDMS 立体体卷在胶带上，以去除胶水残留物和灰尘。PDMS 立体体已准备好重复使用。

结果

幼虫成像室通过将定制的金属框架和两个盖玻片一起胶合而成。金属框架的设计在图1A中指定。在紫外线胶水和PDMS立体体的帮助下，室内的果蝇幼虫粘附在顶盖玻片上。PDMS 立体体上的凹槽和立方体的双面胶带连接，以创建容纳幼虫的空间（图 1B，C）。PDMS 还施加轻柔压力以压平幼虫体壁，并实际限制幼虫运动。最后，将一小块湿透镜纸放...

讨论

在这里，我们描述了LarvaSPA，一种用于长期延时成像的多功能安装活果蝇幼虫的方法。此方法不需要恢复或重新安装幼虫，可实现不间断的成像。因此，它是跟踪需要数小时才能完成的生物过程的理想选择，例如树突退化和再生。该方法还可用于成像细胞内钙动力学和亚细胞事件，如微管生长。由于幼虫体壁在成像过程中是稳定的，因此可以调整空间和时间分辨率以适应手头的成像应用（?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6061 Aluminum bars	McMaster-Carr	9246K421
3M double-sided tape	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch Packaging tape	3M		1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps	Fisher Scientific	50-241-34
Glass coverslip	Azer Scientific	1152250
Isoflurane	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Leica Confocal Microscope	Leica	SP8 equipped with a resonant scanner
Lens paper	Berkshire	LN90.0406.24
Petri dishes (medium)	VWR	25373-085
Petri dishes (small)	VWR	10799-192
Razor blade	Ted Pella, Inc.	121-20
Rectangular petri dish	VWR	25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Transferring pipette	Thermo Fisher Scientific	1371126
UV glue	Norland products	#6106, NOA 61	Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)	Maxxeon	MXN02003
Vacuum desiccator	Electron Microscopy Sciences	71232
Wipes	Kimberly-Clark	Kimwipes