LarvaSPA, 장기 시간 경과 이미징을 위한 초파리 유충을 장착하는 방법

요약

이 프로토콜은 그대로 살아있는 동물에서 중단없는 시간 경과 이미징의 10 시간 이상을 달성하기 위해 Drosophila 애벌레를 장착하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 애벌레 몸벽에 가까운 많은 생물학적 과정을 이미지화하는데 사용될 수 있다.

초록

살아있는 화상 진찰은 세포 생물학 질문을 조사하기 를 위한 귀중한 접근입니다. Drosophila 애벌레는 애벌레 바디 벽 및 대부분의 내부 기관이 투명하기 때문에 생체 내 살아있는 화상 진찰을 위해 특히 적당합니다. 그러나, 30분 이상 온전한 초파리 유충의 지속적인 실시간 영상촬영은 오랜 시간 동안 비침습적으로 고정화하기 어렵기 때문에 도전적이다. 여기에서 우리는 10 시간 이상 높은 시간 및 공간 해결책을 가진 살아있는 Drosophila 애벌레의 연속적인 화상 진찰을 허용하는 LarvaSPA에게 불린 애벌레 장착 방법을 제시합니다. 이 방법은 UV 반응성 접착제를 사용하여 커버 슬립에 유충을 부분적으로 부착하고 폴리디메틸실록산 (PDMS) 블록을 사용하여 애벌레 의 움직임을 추가로 억제하는 것을 포함합니다. 이 방법은 두 번째 instar에서 방황 세 번째 instar에 개발 단계에서 애벌레와 호환됩니다. 우리는 수상 돌기 성장 및 부상 유발 모수석 변성을 포함하여 Drosophila 체감각 뉴런의 동적 과정을 연구하는이 방법의 응용 프로그램을 보여줍니다. 이 방법은 또한 애벌레 바디 벽 의 가까이에 일어나는 많은 그밖 세포 프로세스를 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다.

서문

타임랩스 라이브 이미징은 동적 세포 과정을 연구하는 강력한 방법입니다. 타임랩스 영화에서 제공하는 공간적 및 시간적 정보는 세포 생물학 질문에 답하기 위한 중요한 세부 사항을 나타낼 수 있습니다. Drosophila 애벌레는 그것의 투명한 바디 벽이 내부 구조물의 비침범성 화상 진찰을 허용하기 때문에 살아있는 화상 진찰을 사용하여 조사를 위한 대중적인 생체 내^{모형이었습니다 1,2.} 또한, 수많은 유전 도구는 형광 적으로 해부학 구조 및 거대 분자 를 라벨 에 Drosophila에서 사용할 수 있습니다^3. 그러나, 초파리 유충의 장기 시간 경과 화상 진찰은 도전적입니다. 고정된 초기 태아 또는 pupae와는 달리, Drosophila 애벌레는 살아있는 화상 진찰을 위한 고정화를 필요로 하는 끊임없이 움직입니다. 살아있는 Drosophila 유충을 고정시키는 효과적인 방법은 클로로포름^4를가진 할로카본 오일에 장착, 이소플루란 또는 디클로르보스 용액^5를사용하여 마취하고, 커버슬립과 현미경^{슬라이드(6)}사이를 압축하는 것을 포함한다. 이 방법 중 일부는 현미경 검사법을 위해 이용되었더라도, 그(것)들의 아무도는 장기 살아있는 화상 진찰을 위해 효과적이지 않습니다. 다른 방법은 기존의 공초점 현미경 또는 광시트 현미경^7,8,9를사용하여 유충을 크롤링하는 체내 벽 뉴런을 이미징하기 위해 개발되었다. 그러나, 이러한 방법은 애벌레의 움직임으로 인해 세포 역학을 모니터링하는 데 이상적이지 않습니다.

새로운 방법은 초파리 애벌레의 장기 시간 경과 영상을 달성하기 위해 개발되었다. 다디디메틸실록산(PDMS) "유충 칩"을 사용하여, 드로소필라 유충은 마취 없이 특수 마이크로챔버에서 진공 생성 흡입을 통해 효과적으로 고정화될 수 있다. 그러나,이 방법은 세포 생물학 연구에 대한 높은 시간적 해상도를 제공하지 않으며 동물 크기^10에엄격한 제한이 있습니다. 마취 장치를 이용한 또 다른 방법은 여러 시점에서 초파리 유충의 실시간 이미징을 달성하고 신경근^{접합부 11,12,13,14,15,16을}연구하기 위해 적용되었다. 그러나, 이 방법은 또한 30분 이상 연속적인 이미징을 허용하지 않으며,^17,18을연구한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있는 데스플루란을 반복적으로 사용해야 한다. 최근에는 미세유체 장치와 극저온 마취를 결합하는 새로운 방법이 단기간(분)^19시간동안 다양한 크기의 유충을 고정시키는 데 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 냉각 시스템과 같은 특수 장치를 필요로하고 고정화의 긴 기간은 유충의 반복 냉각을 필요로한다.

여기에서 우리는 10 시간 이상 동안 중단 없는 시간 경과 화상 진찰과 호환되는 Drosophila 애벌레를 고정시키는 다재다능한 방법을 제시합니다. 우리가 "부분 부착에 의한 애벌레 안정화"(LarvaSPA)라고 부르는이 방법은 맞춤형 이미징 챔버에서 이미징을위한 커버 슬립에 애벌레 표피를 부착하는 것을 포함합니다. 이 프로토콜은 이미징 챔버를 만드는 방법과 다양한 발달 단계에서 애벌레를 장착하는 방법을 설명합니다. LarvaSPA 방법에서, 원하는 바디 세그먼트는 UV 반응성 접착제를 사용하여 커버슬립에 부착된다. PDMS 입방체는 또한 유충에 압력을 가하여 탈출을 방지합니다. 이미징 챔버의 공기와 습기는 이미징 중에 부분적으로 고정된 유충의 생존을 보장합니다. 다른 기술에 비해 LarvaSPA의 장점은 다음과 같습니다 : (1) 높은 시간 및 공간 해상도와 시간 동안 그대로 Drosophila 유충의 지속적인 라이브 이미징을 허용하는 첫 번째 방법입니다; (2) 방법은 애벌레 크기에 적은 제한이; (3) 이미징 챔버 와 PDMS 입방체는 최소한의 비용으로 제조 할 수 있으며 재사용할 수 있습니다.

애벌레 장착 방법을 설명하는 것 외에도, 우리는 초파리 수지상 arborization (da) 뉴런의 모수석 개발 및 모수석 변성을 연구하기위한 응용 프로그램의 몇 가지 예를 제공합니다.

프로토콜

1. 이미징 챔버 만들기

1. 금속 프레임은 일반적인 기계 공장의 알루미늄 블록으로 구성할 수 있습니다. 프레임의 사양은 그림 1A에나와 있습니다.
2. 이미징 챔버를 구성하려면 긴 커버슬립(22mm x 50mm)과 UV접착제(그림 1A)를사용하여 금속 프레임의 바닥을 밀봉합니다. 핸드 헬드 UV 램프를 사용하여 UV 접착제를 경화.

2. PDMS 입방체 만들기

1. PDMS 입방체에 대한 금형을 준비합니다.
   1. 직사각형(80mm x 55mm) 페트리 접시 또는 원형 셀 배양 판의 내부 표면에 포장 테이프 층을 부착합니다. 1층(두께 0.063 mm)을 제2 스타 애벌레에, 2층(두께 0.126mm)을 초기 3인성 애벌레에 사용하거나, 3층(두께 0.189mm)을 후반 3층 애벌레(그림1B)에사용한다.
   2. 면도날로 테이프를 특정 너비의 스트립으로 자르세요: 1층 테이프의 경우 1.5mm, 2층 또는 3층 테이프의 경우 2mm입니다. 스트립의 폭 과 두께는 최종 PDMS 입방체가 보유 할 수있는 애벌레의 크기를 결정합니다. 두 스트립 사이에 최소 5mm 의 공간을 둡니다. 공간을 덮는 테이프 레이어를 제거합니다(그림1B).
   3. 끈적끈적한 테이프를 사용하여 플레이트 의 내부 표면에서 먼지를 제거합니다. 금형을 사용할 준비가 되었습니다.
2. PDMS 믹스를 준비합니다.
   1. PDMS 염기 7 g과 경화제 0.7 g(10:1 비율)을 작은 용기에 완전히 섞습니다.
   2. 용기를 진공 건조기에서 적어도 15분 동안 놓고 혼합물에서 공기를 제거합니다.
   3. 1-2 mm 두께에 도달하기 위해 금형에 PDMS 혼합물 약 5.5 g을 천천히 붓습니다(그림 1B).
   4. PDMS 혼합물을 진공 건조기에서 적어도 15분 동안 다시 놓고 혼합물에서 남은 기포를 제거합니다. 파이펫 팁으로 마지막 몇 개의 거품을 부수게 합니다.
   5. 65°C에서 2시간 동안 열 인큐베이터에서 평평한 표면에서 PDMS를 경화한다.
   6. 면도날을 사용하여 금형 가장자리를 따라 경화 된 PDMS를 느슨하게하고 금형에서 분리하십시오. PDMS를 두 개의 큰 스티커 테이프 사이에 실온에서 보관하십시오.
   7. 초기 및 후반 세 번째 instar 애벌레의 경우, 테이프 스트립에 의해 생성 된 홈을 배치하여 8 mm x 2mm x 1 mm 입방체 (그림 1B의점선을 따라)로 PDMS를 잘라 (단계 2.1.2) 입방체의 긴 측면의 중심에(그림 1B,C). 두 번째 인스타 애벌레의 경우, 입방체를 8mm x 1mm x 1mm로 자른다.

3. 장기 시간 경과 이미징을 위한 애벌레 장착

1. 상단 커버슬립을 준비하여 장착합니다.
   1. 유충의 크기와 일치하는 홈여섯 PDMS 입방체를 선택합니다. 2.1.1단계, 2.1.2 및 2.2.7단계를 기준으로 PDMS의 권장 홈 및 크기를 따릅니다.
   2. 끈적끈적한 테이프로 PDMS 표면에서 먼지를 제거합니다.
   3. 나중에 PDMS 입방체를 고정하기 위해 긴 커버 슬립 (22mm x 50mm)에 양면 테이프 4 개 (12mm x 5mm)를 부착하십시오. 양면 테이프의 두 조각 사이의 공간은 PDMS 홈의 폭과 동일해야 합니다.
   4. 각 PDMS 입방체의 홈에 UV 접착제의 작은 방울 (~ 1.2 μL)을 적용하고 커버 슬립에 양면 테이프 사이의 공간에 UV 접착제 의 여섯 방울을 추가합니다.
2. 장착을 위해 애벌레를 준비합니다.
   1. 한 쌍의 집게를 사용하여 애벌레를 물에서 청소하여 신체 표면에서 음식을 제거하십시오.
   2. 깨끗한 애벌레를 작은 티슈 페이퍼에 뚜껑없이 작은 (35mm) 페트리 접시에 놓습니다. 작은 페트리 접시를 마른 티슈 페이퍼가 들어 있는 대형 페트리 접시에 넣습니다. 화학 후드에 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 이소플루란 8-12 방울 (160-240 μL)을 건조 티슈 페이퍼에 바르고 큰 페트리 접시의 뚜껑을 닫습니다.
   3. 애벌레를 모니터링하는 동안 2-3 분 기다립니다. 입걸이 움직이지 않는 큰 페트리 접시에서 애벌레를 꺼내십시오.
3. 동물을 마운트합니다.
   1. 동물의 등쪽 의 등쪽 구조에 구조물을 이미지하려면 고정 된 유충을 커버 슬립의 양면 테이프 사이에 UV 접착제에 놓고 등쪽 표피절을 덮음 슬립을 향하게합니다.
   2. PDMS 블록으로 각 애벌레를 덮고 유충의 트렁크를 PDMS의 홈에 맞춥습니다. 머리와 유충의 꼬리를 PDMS 홈 바깥쪽에 둡니다. 접착제에 의해 애벌레의 첨탑을 차단하지 마십시오.
   3. 홈에 힘을 가하지 않고 PDMS 블록의 끝을 양면 테이프에 누릅니다. 부드럽게 PDMS 아래 표피를 평평하게 하기 위해 애벌레의 꼬리를 당깁니다.
   4. 높은 설정에서 휴대용 UV 램프를 사용하여 4 분 동안 UV 접착제를 경화하십시오 (약 0.07 mW / mm^2).
      주의: UV 램프를 사용하는 동안 안전 안경으로 눈을 보호하십시오.
   5. 커버슬립을 거꾸로 뒤집고 3.3.4단계를 반복합니다.
   6. 20 μL-30 μL의 물로 렌즈 용지(15mm x 30mm)를 적시세요. 이미징 챔버 의 하단에 촉촉한 렌즈 용지를 놓습니다(그림 1A, D).
   7. 애벌레가 챔버의 내부를 향할 수 있도록 챔버에 덮개 슬립을 놓습니다. UV 접착제를 사용하여 커버 슬립의 양쪽 끝을 금속 표면에 부착하십시오(그림 1A, D). 유충의 등쪽은 공초점 현미경의 밑에 화상 진찰을 위해 준비됩니다(그림 1E).

4. 이미징

1. 적절한 현미경을 가진 이미지 애벌레. 이 프로토콜에 도시된 모든결과(그림 2, 도 3, 비디오 S2, 비디오 S3,및 비디오 S4)는40x(1.30 NA) 오일 스레커즈를 가진 공초점 시스템을 사용하여 획득하였다.

5. 이미징 챔버 및 PDMS 입방체의 회복

1. 이미징 후 렌즈 용지를 사용하여 상단 커버슬립의 오일을 제거합니다. 상단 커버슬립을 면도날로 커버슬립과 금속 프레임 사이의 공간으로 절단하여 상단 커버슬립을 금속 프레임에서 분리합니다. 이미징 챔버는 재사용할 준비가 되었습니다.
2. PDMS 입방체를 상단 커버슬립에서 집게로 분리합니다. 끈적끈적한 테이프에 PDMS 입방체를 굴려 접착제 잔여물과 먼지를 제거합니다. PDMS 입방체는 재사용할 준비가 되어 있습니다.

결과

유충 이미징 챔버는 맞춤형 금속 프레임과 두 개의 커버슬립을 함께 접착하여 구성됩니다. 금속 프레임의 설계는 그림 1A에지정되어 있습니다. 챔버 내부의 초파리 유충은 UV 접착제 및 PDMS 입방체의 도움으로 상부 커버 슬립에 부착된다. PDMS 입방체 및 양면 테이프에 홈은 유충을 보유하는 공간을 만들기 위해 부착된다(도 1B,C). PDMS는 또한 ?...

토론

여기에서 우리는 LarvaSPA, 장기 시간 경과 화상 진찰을 위한 살아있는 초파리 애벌레를 설치의 다재다능한 방법을 기술합니다. 이 방법은 유충을 복구하거나 재장착할 필요가 없기 때문에 중단 없는 이미징이 가능합니다. 따라서 모수석 변성 및 재생과 같이 완료하는 데 몇 시간이 걸리는 생물학적 과정을 추적하는 데 이상적입니다. 이 방법은 또한 화상 진찰 세포 내 칼슘 역학 및 microtubule ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6061 Aluminum bars	McMaster-Carr	9246K421
3M double-sided tape	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch Packaging tape	3M		1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps	Fisher Scientific	50-241-34
Glass coverslip	Azer Scientific	1152250
Isoflurane	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Leica Confocal Microscope	Leica	SP8 equipped with a resonant scanner
Lens paper	Berkshire	LN90.0406.24
Petri dishes (medium)	VWR	25373-085
Petri dishes (small)	VWR	10799-192
Razor blade	Ted Pella, Inc.	121-20
Rectangular petri dish	VWR	25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Transferring pipette	Thermo Fisher Scientific	1371126
UV glue	Norland products	#6106, NOA 61	Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)	Maxxeon	MXN02003
Vacuum desiccator	Electron Microscopy Sciences	71232
Wipes	Kimberly-Clark	Kimwipes