LarvaSPA, une méthode pour monter la larve de Drosophila pour l’imagerie à long terme de time-lapse

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour monter les larves de Drosophila pour atteindre plus de 10 h d’imagerie ininterrompue en accéléré chez des animaux vivants intacts. Cette méthode peut être utilisée pour l’image de nombreux processus biologiques près de la paroi du corps larvaire.

Résumé

L’imagerie en direct est une approche précieuse pour étudier les questions de biologie cellulaire. La larve Drosophila est particulièrement adaptée à l’imagerie vivante in vivo parce que la paroi du corps larvaire et la plupart des organes internes sont transparents. Cependant, l’imagerie vivante continue des larves intactes de Drosophila pendant plus de 30 min a été difficile parce qu’il est difficile d’immobiliser les larves non invasivement immobilisant pendant une longue période. Ici, nous présentons une méthode de montage larvaire appelée LarvaSPA qui permet l’imagerie continue des larves vivantes de Drosophila avec une résolution temporelle et spatiale élevée pendant plus de 10 heures. Cette méthode consiste à attacher partiellement les larves à la glissière à l’aide d’une colle réactive aux UV et à retenir le mouvement larvaire à l’aide d’un bloc de polydiméthylsiloxane (PDMS). Cette méthode est compatible avec les larves à des stades de développement de la deuxième étoile à la troisième étoile errante. Nous démontrons des applications de cette méthode en étudiant des processus dynamiques des neurones somatosensory de Drosophila, y compris la croissance de dendrite et la dendrite de dendrite des dommages-induits. Cette méthode peut également être appliquée pour étudier de nombreux autres processus cellulaires qui se produisent près de la paroi du corps larvaire.

Introduction

L’imagerie en direct en accéléré est une méthode puissante pour étudier les processus cellulaires dynamiques. L’information spatiale et temporelle fournie par les films en time-lapse peut révéler des détails importants pour répondre aux questions de biologie cellulaire. La larve Drosophila a été un modèle in vivo populaire pour les enquêtes utilisant l’imagerie en direct parce que sa paroi transparente du corps permet l’imagerie non invasive des structures internes^1,2. En outre, de nombreux outils génétiques sont disponibles dans Drosophila pour étiqueter fluorescentement les structures anatomiques et les macromolécules³. Cependant, l’imagerie en accéléré à long terme des larves de Drosophila est difficile. Contrairement aux embryons ou aux pupae fixes, les larves de Drosophila se déplacent constamment, ce qui nécessitait l’immobilisation pour l’imagerie vivante. Les moyens efficaces d’immobiliser les larves vivantes de Drosophila comprennent le montage dans l’huile d’halocarbone avec chloroforme⁴, l’anesthésie à l’aide d’isoflurane ou de dichlorvos solution⁵, et la compression entre la couverture et la diapositive du microscope⁶. Bien que certaines de ces méthodes aient été utilisées pour la microscopie, aucune d’entre elles n’est efficace pour l’imagerie en direct à long terme. D’autres méthodes ont été développées pour l’imagerie des neurones de la paroi du corps chez les larves rampantes à l’aide d’une microscopie confocale conventionnelle ou d’une microscopie par feuille de lumière^7,8,9. Cependant, ces méthodes ne sont pas idéales pour surveiller la dynamique cellulaire en raison du mouvement des larves.

De nouvelles méthodes ont été mises au point pour parvenir à l’imagerie à long terme des larves de Drosophila. À l’aide d’une « puce de larve » polydiméthylsiloxiane (PDMS), les larves de Drosophila peuvent être efficacement immobilisées par aspiration sous vide dans une microchambre spécialisée sans anesthésie. Cependant, cette méthode n’offre pas de haute résolution temporelle pour les études de biologie cellulaire et elle a des limites strictes sur la taille animale¹⁰. Une autre méthode utilisant un dispositif d’anesthésiation a réalisé l’imagerie en direct des larves de Drosophila à plusieurs points de temps et a été appliquée pour étudier les jonctions neuromusculaires^{11,12,13,14,15,16}. Cependant, cette méthode ne permet pas non plus l’imagerie continue pendant plus de 30 min et nécessite l’utilisation de desflurane à plusieurs reprises, ce qui peut inhiber l’activité neuronale et affecter le processus biologique étudié^17,18. Récemment, une nouvelle méthode qui combine dispositif microfluidique et cryoanesthésie a été utilisée pour immobiliser les larves de différentes tailles pour de courtes périodes de temps (minutes)¹⁹. Cependant, cette méthode nécessite des dispositifs spécialisés tels qu’un système de refroidissement et des périodes d’immobilisation plus longues nécessitent un refroidissement répété des larves.

Ici, nous présentons une méthode polyvalente d’immobilisation des larves de Drosophila qui est compatible avec l’imagerie time-lapse ininterrompue pour plus de 10 h. Cette méthode, que nous appelons « stabilisation de la larve par attachement partiel » (LarvaSPA), consiste à adhérer à la cuticule larvaire à une couverture pour l’imagerie dans une chambre d’imagerie sur mesure. Ce protocole décrit comment faire la chambre d’imagerie et comment monter des larves à une variété de stades de développement. Dans la méthode LarvaSPA, les segments du corps désirés sont fixés sur le bordereau à l’aide d’une colle réactive aux UV. Un cuboïde PDMS applique en outre une pression sur les larves, empêchant l’évasion. L’air et l’humidité de la chambre d’imagerie assurent la survie des larves partiellement immobilisées pendant l’imagerie. Les avantages de LarvaSPA par rapport à d’autres techniques comprennent les suivants: (1) C’est la première méthode qui permet l’imagerie en direct continue des larves intactes de Drosophila pendant des heures avec une haute résolution temporelle et spatiale; (2) La méthode a moins de limites sur la taille larvaire; (3) La chambre d’imagerie et les cuboïdes PDMS peuvent être fabriqués à un coût minime et sont réutilisables.

En plus de décrire la méthode de montage larvaire, nous fournissons plusieurs exemples de son application pour étudier le développement de dendrite et la dégénérescence de dendrite des neurones d’arborisation dendritique de Drosophila (da).

Protocole

1. Fabrication de la chambre d’imagerie

1. Le cadre métallique peut être construit à partir d’un bloc d’aluminium dans un atelier de machinerie typique. Les spécifications du cadre sont illustrées dans la figure 1A.
2. Pour construire la chambre d’imagerie, sceller le fond du cadre métallique à l’aide d’une longue glissade (22 mm x 50 mm) et de colle UV (Figure 1A). Cure de la colle UV à l’aide d’une lampe UV à main.

2. Fabrication de cuboïdes PDMS

1. Préparer le moule pour les cuboïdes PDMS.
   1. Fixez des couches de ruban adhésif à la surface intérieure d’un plat Petri rectangulaire (80 mm x 55 mm) ou d’une plaque de culture de cellules rondes. Utiliser une couche (0,063 mm d’épaisseur) pour les larves de deuxième étoile, 2 couches (0,126 mm d’épaisseur) pour les larves du troisième rang, ou trois couches (0,189 mm d’épaisseur) pour les larves de troisième étoile tardives(figure 1B).
   2. Couper le ruban en bandes de largeur spécifique avec une lame de rasoir : 1,5 mm pour le ruban à 1 couche, et 2 mm pour le ruban adhésif à 2 ou 3 couches. La largeur et l’épaisseur de la bande détermineront la taille des larves que le cuboïde PDMS final peut contenir. Laissez au moins un espace de 5 mm entre les deux bandes. Retirez les couches de ruban qui recouvrent l’espace (Figure 1B).
   3. Retirer la poussière de la surface intérieure de la plaque à l’aide de ruban adhésif. Le moule est prêt à l’emploi.
2. Préparer le mix PDMS.
   1. Mélanger 7 g de base PDMS et 0,7 g d’agent de durcissement (rapport 10:1) à fond dans un petit récipient.
   2. Placer le récipient dans un dessiccateur sous vide pendant au moins 15 min pour retirer l’air du mélange.
   3. Verser lentement environ 5,5 g de mélange PDMS sur le moule pour atteindre une épaisseur de 1 à 2 mm (Figure 1B).
   4. Placer le mélange De PDMS dans le dessiccateur sous vide à nouveau pendant au moins 15 minutes pour enlever les bulles d’air restantes du mélange. Casser les dernières bulles avec une pointe de pipette.
   5. Guérir le PDMS sur une surface plane dans un incubateur thermique à 65 oC pendant 2 h.
   6. Utilisez une lame de rasoir pour desserrer le PDMS durci le long du bord du moule et le détacher du moule. Entreposer le PDMS entre deux morceaux de gros ruban adhésif à température ambiante.
   7. Pour les larves de troisième étoile précoces et tardives, couper le PDMS en cuboïdes de 8 mm x 2 mm x 1 mm (le long des lignes pointillées de la figure 1B)en positionnant la rainure créée par la bande de ruban adhésif (étape 2.1.2) au centre du long côté du cuboïde(figure 1B,C). Pour les larves de deuxième étoile, couper le cuboïde à 8 mm x 1 mm x 1 mm.

3. Montage de larves pour l’imagerie à long terme

1. Préparer le bordereau supérieur pour le montage.
   1. Choisissez six cuboïdes PDMS avec des rainures correspondant à la taille des larves. Suivez la rainure et la taille recommandées de PDMS en fonction des étapes 2.1.1, 2.1.2 et 2.2.7.
   2. Retirer la poussière de la surface du PDMS à l’eau avec du ruban adhésif.
   3. Attachez quatre morceaux de ruban adhésif recto-verso (12 mm x 5 mm) sur un long bordereau (22 mm x 50 mm) pour fixer les cuboïdes PDMS plus tard. Les espaces entre les deux morceaux de ruban adhésif recto-verso doivent être les mêmes que la largeur de la rainure PDMS.
   4. Appliquer une petite goutte (1,2 l) de colle UV dans la rainure de chaque cuboïde PDMS et ajouter six petites gouttes de colle UV dans l’espace entre le ruban à double face sur le bordereau.
2. Préparer les larves pour le montage.
   1. À l’aide d’une paire de forceps, nettoyez les larves dans l’eau pour enlever les aliments de la surface du corps.
   2. Placer les larves propres sur un petit morceau de papier de soie humidifié dans un petit plat Petri (35 mm) sans couvercle. Placer le petit plat Petri dans un grand plat Petri (60 mm) contenant un morceau de papier de soie sec. Dans une hotte chimique, appliquer de 8 à 12 gouttes (160 à 240 l) d’isoflurane sur le papier de soie sec à l’aide d’une pipette de transfert en plastique et fermer le couvercle du grand plat Petri.
   3. Attendez de 2 à 3 min tout en surveillant les larves. Sortez les larves du grand plat Petri une fois que leurs crochets buccaux cessent de bouger.
3. Montez les animaux.
   1. Pour imager les structures du côté dorsal de l’animal, placez les larves immobilisées sur la colle UV entre le ruban à double face sur la bande de couverture avec la cuticule dorsal faisant face à la couverture.
   2. Couvrir chaque larve d’un bloc PDMS et s’adapter au tronc de la larve dans la rainure du PDMS. Laissez la tête et la queue de la larve à l’extérieur de la rainure PDMS. Évitez de bloquer les spiracles de la larve par la colle.
   3. Appuyez sur les extrémités du bloc PDMS sur le ruban à double face sans appliquer de force sur la rainure. Tirez doucement sur la queue de la larve pour aplatir la cuticule sous le PDMS.
   4. Cure de la colle UV pendant 4 min à l’aide d’une lampe UV à main au réglage élevé (à environ 0,07 mW/mm²).
      CAUTION: Protégez les yeux avec des lunettes de sécurité tout en utilisant la lampe UV.
   5. Retournez le bordereau à l’envers et répétez l’étape 3.3.4.
   6. Humidifiez un petit morceau de papier d’objectif (15 mm x 30 mm) avec 20 l à 30 l d’eau. Placez le papier de lentille humidifié au fond de la chambre d’imagerie (Figure 1A,D).
   7. Placez la glissière de couverture sur la chambre de sorte que les larves sont face à l’intérieur de la chambre. Adhérer aux deux extrémités de la couverture à la surface métallique à l’aide de colle UV (Figure 1A,D). Le côté dorsal des larves est prêt pour l’imagerie sous microscope confocal(figure 1E).

4. Imagerie

1. Image ruse avec un microscope approprié. Tous les résultats présentés dans ce protocole (Figure 2, Figure 3, Video S2, Video S3, et Video S4) ont été acquis à l’aide d’un système confocal avec un objectif 40x (1,30 NA) d’huile.

5. Récupération de la chambre d’imagerie et des cuboïdes PDMS

1. Après l’imagerie, retirer l’huile sur le couvercle supérieur à l’aide d’un papier de lentille. Détachez le couvercle supérieur du cadre métallique en coupant dans l’espace entre la glissière et le cadre métallique à l’arme de rasoir. La chambre d’imagerie est prête à être réutilisée.
2. Détachez les cuboïdes PDMS du couvercle supérieur avec des forceps. Rouler les cuboïdes PDMS sur du ruban adhésif pour enlever les résidus de colle et la poussière. Les cuboïdes PDMS sont prêts à être réutilisés.

Résultats

La chambre d’imagerie de larve est construite en collant un cadre en métal sur mesure et deux couvertures ensemble. La conception du cadre métallique est spécifiée dans la figure 1A. Les larves de Drosophila à l’intérieur de la chambre sont adhérées à la couverture supérieure à l’aide de colle UV et de cuboïdes PDMS. La rainure sur le cuboïde PDMS et le ruban à double face le cuboïde est attaché pour créer l’espace pour tenir les larves (Figure 1...

Discussion

Ici nous décrivons LarvaSPA, une méthode polyvalente de montage des larves vivantes de Drosophila pour l’imagerie à long terme de time-lapse. Cette méthode ne nécessite pas de récupération ou de remontage des larves, ce qui permet une imagerie ininterrompue. Il est donc idéal pour le suivi des processus biologiques qui prennent des heures à compléter, tels que la dégénérescence et la régénération dendrite. Cette méthode peut également être utilisée pour l’imagerie de la dynamique du calci...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6061 Aluminum bars	McMaster-Carr	9246K421
3M double-sided tape	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch Packaging tape	3M		1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps	Fisher Scientific	50-241-34
Glass coverslip	Azer Scientific	1152250
Isoflurane	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Leica Confocal Microscope	Leica	SP8 equipped with a resonant scanner
Lens paper	Berkshire	LN90.0406.24
Petri dishes (medium)	VWR	25373-085
Petri dishes (small)	VWR	10799-192
Razor blade	Ted Pella, Inc.	121-20
Rectangular petri dish	VWR	25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Transferring pipette	Thermo Fisher Scientific	1371126
UV glue	Norland products	#6106, NOA 61	Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)	Maxxeon	MXN02003
Vacuum desiccator	Electron Microscopy Sciences	71232
Wipes	Kimberly-Clark	Kimwipes