LarvaSPA, um método para montagem de larva drosophila para imagem de lapso de tempo de longo prazo

Resumo

Este protocolo descreve um método para montar larvas drosophila para alcançar mais de 10 h de imagens ininterruptas de lapso de tempo em animais vivos intactos. Este método pode ser usado para visualizar muitos processos biológicos próximos à parede do corpo larval.

Resumo

Imagens vivas são uma abordagem valiosa para investigar questões de biologia celular. A larva Drosophila é particularmente adequada para imagens ao vivo ao vivo porque a parede do corpo larval e a maioria dos órgãos internos são transparentes. No entanto, imagens contínuas ao vivo de larvas Drosophila intactas por mais de 30 min têm sido desafiadoras porque é difícil imobilizar larvas não invasivamente imobilizadas por muito tempo. Aqui apresentamos um método de montagem larval chamado LarvaSPA que permite imagens contínuas de larvas Drosophila vivas com alta resolução temporal e espacial por mais de 10 horas. Este método envolve anexar parcialmente larvas ao deslizamento de cobertura usando uma cola uv-reativa e também restringir o movimento larval usando um bloco de polidimetilsiloxano (PDMS). Este método é compatível com larvas em estágios de desenvolvimento de segunda instar a terceira instar vagando. Demonstramos aplicações desse método no estudo de processos dinâmicos de neurônios somatosensoriais Drosophila, incluindo crescimento dendrito e degeneração induzida por lesões. Este método também pode ser aplicado para estudar muitos outros processos celulares que acontecem perto da parede corporal larval.

Introdução

A imagem ao vivo por lapso de tempo é um método poderoso para estudar processos celulares dinâmicos. As informações espaciais e temporais fornecidas por filmes de lapso de tempo podem revelar detalhes importantes para responder a perguntas de biologia celular. A larva Drosophila tem sido um modelo popular in vivo para investigações usando imagens vivas porque sua parede corporal transparente permite imagens não invasivas de estruturas internas^1,2. Além disso, inúmeras ferramentas genéticas estão disponíveis em Drosophila para rotular fluorescentemente estruturas anatômicas e macromoléculas³. No entanto, a imagem de lapso de tempo de longo prazo das larvas de Drosophila é desafiadora. Ao contrário dos embriões estacionários ou pupas, as larvas de Drosophila se movem constantemente, necessitando de imobilização para imagens vivas. Formas eficazes de imobilizar larvas drosophila vivas incluem montagem em óleo de halcarbono com clorofórmio^4,anestesia usando solução isoflurano ou Dichlorvos⁵, e comprimindo entre o deslizamento de cobertura e o deslizamento de microscópio⁶. Embora alguns desses métodos tenham sido usados para microscopia, nenhum deles é eficaz para imagens ao vivo de longo prazo. Outros métodos foram desenvolvidos para imagens de neurônios da parede corporal em larvas rastejantes usando microscopia confocal convencional ou microscopia de folha de luz^7,8,9. No entanto, esses métodos não são ideais para monitorar a dinâmica celular devido ao movimento das larvas.

Novos métodos foram desenvolvidos para alcançar imagens de lapso de tempo de longo prazo de larvas drosophila. Usando um "chip larva" de polidimetiletilsiloxano (PDMS), as larvas de Drosophila podem ser efetivamente imobilizadas através da sucção gerada pelo vácuo em uma microcâmara especializada sem anestesia. No entanto, este método não oferece alta resolução temporal para estudos de biologia celular e possui limitações estritas no tamanho^{animal 10}. Outro método utilizando um dispositivo de anestesia alcançou imagens vivas de larvas de Drosophila em vários pontos de tempo e foi aplicado para estudar junções neuromusculares^{11,12,13,14,15,16}. No entanto, este método também não permite imagens contínuas por mais de 30 min e requer o uso de desflurane repetidamente, o que pode inibir a atividade neural e afetar o processo biológico estudado^17,18. Recentemente, um novo método que combina dispositivo microfluido e crioanesteria tem sido usado para imobilizar larvas de vários tamanhos por curtos períodos de tempo (minutos)¹⁹. No entanto, este método requer dispositivos especializados, como um sistema de resfriamento e períodos mais longos de imobilização, requerem resfriamento repetido das larvas.

Aqui apresentamos um método versátil de imobilizar larvas drosophila que é compatível com imagens ininterruptas de lapso de tempo por mais de 10 h. Este método, que chamamos de "Estabilização de Larvas por Anexo Parcial" (LarvaSPA), envolve a adesão da cutícula larval a um deslizamento de cobertura para imagem em uma câmara de imagem personalizada. Este protocolo descreve como fazer a câmara de imagem e como montar larvas em uma variedade de estágios de desenvolvimento. No método LarvaSPA, os segmentos do corpo desejado são afixados ao deslizamento de cobertura usando uma cola reativa UV. Um cuboide PDMS adicionalmente aplica pressão às larvas, impedindo a fuga. O ar e a umidade na câmara de imagens garantem a sobrevivência das larvas parcialmente imobilizadas durante a imagem. As vantagens do LarvaSPA sobre outras técnicas incluem o seguinte: (1) É o primeiro método que permite imagens contínuas ao vivo de larvas Drosophila intactas por horas com alta resolução temporal e espacial; (2) O método tem menos limitações no tamanho larval; (3) Os cuboides da câmara de imagem e do PDMS podem ser fabricados a um custo mínimo e são reutilizáveis.

Além de descrever o método de montagem larval, fornecemos vários exemplos de sua aplicação para estudar desenvolvimento dendrito e degeneração dendrite de neurônios de arborização dendríticas drosophila (da).

Protocolo

1. Fazendo a câmara de imagem

1. A estrutura metálica pode ser construída a partir de um bloco de alumínio em uma loja de máquinas típica. As especificações do quadro são ilustradas na Figura 1A.
2. Para construir a câmara de imagem, veda a parte inferior da estrutura metálica usando um deslizamento de cobertura longo (22 mm x 50 mm) e cola UV(Figura 1A). Cure a cola UV usando uma lâmpada UV portátil.

2. Fazendo cuboides PDMS

1. Prepare o molde para cuboides PDMS.
   1. Conecte camadas de fita de embalagem à superfície interna de uma placa de petri retangular (80 mm x 55 mm) placa de petri ou placa de cultura celular redonda. Use uma camada (0,063 mm de espessura) para segunda larvas instar, 2 camadas (0,126 mm de espessura) para larvas de terceira instar precoce, ou três camadas (0,189 mm de espessura) para larvas de terceira instar(Figura 1B).
   2. Corte a fita em tiras de largura específica com uma lâmina de barbear: 1,5 mm para a fita de 1 camada e 2 mm para fita de 2 camadas ou 3 camadas. A largura e espessura da tira determinarão o tamanho das larvas que o cuboide PDMS final pode conter. Deixe pelo menos um espaço de 5 mm entre as duas tiras. Remova as camadas de fita que cobrem o espaço(Figura 1B).
   3. Remova a poeira da superfície interna da placa usando fita adesiva. O molde está pronto para uso.
2. Prepare o mix PDMS.
   1. Misture 7 g de base PDMS e 0,7 g de agente de cura (proporção 10:1) completamente em um recipiente pequeno.
   2. Coloque o recipiente em um dessecador a vácuo por pelo menos 15 min para remover o ar da mistura.
   3. Despeje lentamente cerca de 5,5 g de mistura pdms no molde para atingir uma espessura de 1-2 mm (Figura 1B).
   4. Coloque a mistura PDMS no dessecador a vácuo novamente por pelo menos 15 minutos para remover bolhas de ar restantes da mistura. Quebre as últimas bolhas com uma ponta de pipette.
   5. Cure o PDMS em uma superfície plana em uma incubadora de calor a 65 °C por 2 h.
   6. Use uma lâmina de barbear para soltar o PDMS curado ao longo da borda do molde e desatura-a do molde. Armazene o PDMS entre duas peças de fita adesiva grande à temperatura ambiente.
   7. Para larvas de terceira instar precoce e tardia, corte o PDMS em cuboides de 8 mm x 2 mm x 1 mm (ao longo das linhas pontilhadas na Figura 1B) posicionando o sulco criado pela tira de fita (passo 2.1.2) no centro do lado longo do cuboide (Figura 1B,C). Para segunda larvas instar, corte o cuboide para 8 mm x 1 mm x 1 mm.

3. Larvas de montagem para imagens de lapso de tempo a longo prazo

1. Prepare o deslizamento de cobertura superior para montagem.
   1. Escolha seis cuboides PDMS com ranhuras que correspondam aos tamanhos das larvas. Siga o ritmo e o tamanho recomendados de PDMS com base nas etapas 2.1.1, 2.1.2 e 2.2.7.
   2. Remova a poeira da superfície do PDMS com fita adesiva.
   3. Conecte quatro peças de fita dupla (12 mm x 5 mm) em um longo deslizamento de cobertura (22 mm x 50 mm) para fixar cuboides PDMS mais tarde. Os espaços entre as duas peças de fita dupla face devem ser os mesmos da largura do sulco PDMS.
   4. Aplique uma pequena gota (~1,2 μL) de cola UV no sulco de cada cuboide PDMS e adicione seis pequenas gotas de cola UV no espaço entre a fita de dois lados no tampado.
2. Prepare as larvas para montagem.
   1. Usando um par de fórceps, limpe as larvas na água para remover alimentos da superfície do corpo.
   2. Coloque larvas limpas em um pequeno pedaço de papel tecido umedecido em uma pequena (35 mm) placa de petri sem tampa. Coloque a pequena placa de Petri em uma grande (60 mm) placa de petri contendo um pedaço de papel de tecido seco. Em uma capa química, aplique 8-12 gotas (160-240 μL) de isoflurano no papel de tecido seco usando uma pipeta de transferência de plástico e feche a tampa da grande placa de Petri.
   3. Espere de 2 a 3 min enquanto monitora as larvas. Tire as larvas da grande placa de Petri quando seus ganchos de boca pararem de se mover.
3. Monte os animais.
   1. Para estruturas de imagem no lado dorsal do animal, coloque as larvas imobilizadas na cola UV entre a fita de dois lados no deslizamento de cobertura com a cutícula dorsal voltada para o deslizamento de cobertura.
   2. Cubra cada larva com um bloco PDMS e encaixe o tronco da larva no sulco do PDMS. Deixe a cabeça e a cauda da larva fora do sulco PDMS. Evite bloquear os spiracles da larva pela cola.
   3. Pressione para baixo nas extremidades do bloco PDMS na fita dupla lateral sem aplicar força no sulco. Puxe suavemente a cauda da larva para achatar a cutícula o PDMS.
   4. Cure a cola UV por 4 min usando uma lâmpada UV portátil na configuração alta (a cerca de 0,07 mW/mm²).
      ATENÇÃO: Proteja os olhos com óculos de segurança enquanto usa a lâmpada UV.
   5. Vire o deslizamento de cobertura de cabeça para baixo e repita o passo 3.3.4.
   6. Umedecer um pequeno pedaço de papel de lente (15 mm x 30 mm) com 20 μL-30 μL de água. Coloque o papel de lente umedecido na parte inferior da câmara de imagem (Figura 1A,D).
   7. Coloque o deslizamento de cobertura na câmara para que as larvas estejam voltadas para o interior da câmara. Adere ambas as extremidades do deslizamento de cobertura à superfície metálica usando cola UV(Figura 1A,D). O lado dorsal das larvas está pronto para imagens microscópio confocal (Figura 1E).

4. Imagem

1. Larvas de imagem com um microscópio apropriado. Todos os resultados apresentados neste protocolo (Figura 2, Figura 3,Vídeo S2, Vídeo S3e Vídeo S4) foram adquiridos utilizando um sistema confocal com um objetivo de óleo de 40x (1,30 NA).

5. Recuperação de câmara de imagem e cuboides PDMS

1. Após a imagem, remova o óleo no deslizamento de cobertura superior usando um papel de lente. Desaque o tampamento superior da estrutura metálica cortando o espaço entre o tampado e a estrutura metálica com uma lâmina de barbear. A câmara de imagens está pronta para reutilização.
2. Desative os cuboides PDMS do tampamento superior com fórceps. Enrole os cuboides PDMS em fita adesiva para remover resíduos de cola e poeira. Os cuboides PDMS estão prontos para reutilização.

Resultados

A câmara de imagem larva é construída colando uma estrutura metálica feita medida e dois coverslips juntos. O design da estrutura metálica é especificado na Figura 1A. Larvas de drosophila dentro da câmara são aderidas ao deslizamento de cobertura superior com o auxílio de cola UV e cuboides PDMS. O sulco no cuboide PDMS e a fita dupla lateral o cuboide é anexado para criar o espaço para segurar as larvas(Figura 1B,C). O PDMS também ...

Discussão

Aqui descrevemos larvaspa, um método versátil de montagem larvas drosophila vivas para imagens de lapso de tempo a longo prazo. Este método não requer recuperação ou remontagem de larvas, permitindo imagens ininterruptas. Por isso, é ideal para acompanhar processos biológicos que levam horas para serem concluídos, como degeneração e regeneração. Este método também pode ser usado para imagens de dinâmica scalcicelular e eventos subcelulares, como o crescimento de microtúbulos. Como a parede do co...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6061 Aluminum bars	McMaster-Carr	9246K421
3M double-sided tape	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch Packaging tape	3M		1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps	Fisher Scientific	50-241-34
Glass coverslip	Azer Scientific	1152250
Isoflurane	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Leica Confocal Microscope	Leica	SP8 equipped with a resonant scanner
Lens paper	Berkshire	LN90.0406.24
Petri dishes (medium)	VWR	25373-085
Petri dishes (small)	VWR	10799-192
Razor blade	Ted Pella, Inc.	121-20
Rectangular petri dish	VWR	25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Transferring pipette	Thermo Fisher Scientific	1371126
UV glue	Norland products	#6106, NOA 61	Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)	Maxxeon	MXN02003
Vacuum desiccator	Electron Microscopy Sciences	71232
Wipes	Kimberly-Clark	Kimwipes