Separación de Moléculas Pequeñas Bioactivas, Péptidos de Fuentes Naturales y Proteínas de Microbios por Método de Enfoque Isoeléctrico Preparativo (IEF)

Resumen

El objetivo es fraccionar y aislar moléculas pequeñas bioactivas, péptidos de un extracto de planta complejo y proteínas de microbios patógenos mediante el empleo de un método de enfoque isoeléctrico de fase líquida (IEF). Además, se identificaron las moléculas separadas y se confirmó su bioactividad.

Resumen

Los productos naturales derivados de plantas y microbios son una rica fuente de moléculas bioactivas. Antes de su uso, las moléculas activas de extractos complejos deben purificarse para aplicaciones posteriores. Hay varios métodos cromatográficos disponibles para este propósito, pero no todos los laboratorios pueden permitirse métodos de alto rendimiento y el aislamiento de muestras biológicas complejas puede ser difícil. Aquí demostramos que el enfoque isoeléctrico de fase líquida preparatoria (IEF) puede separar moléculas, incluyendo moléculas pequeñas y péptidos de extractos de plantas complejas, basados en sus puntos isoeléctricos (pI). Hemos utilizado el método para la fraccionamiento y caracterización de muestras biológicas complejas. Como prueba de concepto, fraccionamos un extracto de planta de Gymnema sylvestre, aislando una familia de saponina terpenoides pequeñas moléculas y un péptido. También demostramos una separación eficaz de las proteínas microbianas utilizando el hongo Candida albicans como sistema modelo.

Introducción

La purificación de biomoléculas a partir de muestras biológicas complejas es un paso esencial y a menudo difícil en los experimentos biológicos¹. El enfoque isoeléctrico (IEF) es adecuado para la separación de alta resolución de biomoléculas complejas donde los anfieles portadores viajan de acuerdo con su carga y establecen el gradiente de pH en un campo eléctrico^3. El primer ampholyte de soporte comercial para IEF fue desarrollado por Olof Vesterberg en 1964 y patentado^4,5. Los anfólitos portadores son moléculas de ácido oligo-amino oligo-carboxílico alifático de longitud variable y ramificación^6. Posteriormente, Vesterberg y otros mejoraron los anfilitos portadores para su uso ampliado en la separación de biomoléculas^6,7.

Los métodos para separar las biomoléculas incluyen la electroforesis de gel de agarosa y policrilamida, la electroforesis de gel bidimensional (2-DE), el enfoque isoeléctrico, la electroforesis capilar, la isotachoforesis y otras técnicas cromatográficas (por ejemplo, TLC, FPLC, HPLC)². IEF de fase líquida interpretado en un instrumento llamado "Rotofor" fue inventado por el Milan Bier^8. Fue pionero en el concepto y diseño de este instrumento y contribuyó ampliamente a la teoría de la migración electroforética. Su equipo también desarrolló un modelo matemático de proceso de separación electroforética para simulaciones por ordenador^9.

El aparato IEF de fase líquida es una célula cilíndrica giratoria horizontal que consiste en un núcleo de nylon dividido en 20 compartimentos porosos y una varilla de cerámica de enfriamiento de agua circulante. Las cámaras porosas permiten que las moléculas migren a través de la fase acuosa entre los electrodos y permiten la recolección de muestras purificadas al vacío en fracciones. Este sistema de purificación puede proporcionar hasta 1000 veces la purificación de una molécula específica en <4 horas. Una característica valiosa de este instrumento es que se puede aplicar como un primer paso para la purificación de una mezcla compleja o como paso final para lograr la pureza¹⁰. Si la molécula de interés es una proteína, otra ventaja es que su conformación nativa se mantendrá durante la separación.

El uso de IEF de fase líquida se ha notificado ampliamente para proteínas, enzimas y purificación de anticuerpos^{6,10,11,12,13,14}. Aquí describimos el uso de este enfoque para separar y purificar pequeñas moléculas y péptidos de la planta medicinal Gymnema sylvestre. Este protocolo ayudará a los investigadores a concentrar y purificar moléculas pequeñas activas de un extracto de planta para aplicaciones posteriores a bajo costo. Además, también demostramos que el enriquecimiento de proteínas de un extracto de proteína complejo del hongo Candida albicans ¹⁵ en este sistema basado en IEF como segundo ejemplo.

Protocolo

1. Configuración y prerugiendo de la unidad IEF de fase líquida estándar

1. Montar los electrodos IEF de fase líquida (botón de ánodo-rojo y botón catódo-negro) con sus respectivas membranas de intercambio de acuerdo con el manual de instrucciones (ver Tabla de materiales). Equilibrar las membranas de intercambio de aniones con 0,1 M NaOH y las membranas de intercambio catiónicos con 0,1 M H₃PO₄ al menos durante 16 h cuando se utilizan nuevas membranas.
   1. Conservar las membranas en electrolitos (0,1 M NaOH o 0,1 M H₃PO₄) entre conductos y no permitir que se sequen.
2. Montar la parte interior y exterior del electrodo alineando tres orificios oblongos en las juntas de intercambio iónico. Llene los electrodos con los electrolitos respectivos (25-30 ml) para evitar que sus membranas se sequen.
   1. No agregue el exceso (más de 1/3^rd de volumen de la cámara del electrodo) de electrolito que pueda acumular presión dentro del electrodo y causar fugas.
3. Cubra los puertos de recogida de muestras con cinta de sellado que viene con las piezas de ensamblaje del instrumento (consulte Tabla de materiales). El lado de los puertos de colección de muestras se puede identificar mediante los dos pasadores de alineación de metal vertical. Alternativamente, utilice cinta de sellado estándar para sellar los puertos.
4. Montar todas las partes del conjunto de la cámara de enfoque en secuencia (electrodo de ánodo, núcleo de membrana de nylon, cámara de enfoque y electrodo de cátodo) sobre el dedo de enfriamiento de cerámica.
5. Llene la cámara de enfoque con agua destilada preenfriada (volumen total de 60 ml para la celda IEF estándar) utilizando una jeringa de 50 ml.
6. Conecte el instrumento IEF de fase líquida a un agua de refrigeración circulante a 4 oC y prerun la unidad a 15 W y 3,000 V durante 3-5 min o hasta que la tensión se estabilice.
   NOTA: Generalmente, en un minuto, la tensión alcanzará los valores máximos establecidos. Prerunning con agua destilada ayuda a eliminar los iones residuales de la cámara de enfoque y el núcleo de la membrana de nylon.
7. Apague la fuente de alimentación y retire el agua de la celda con el colector de fracciones. Vuelva a sellar los puertos de recogida con cinta adhesiva.
   NOTA: Ahora el instrumento está listo para su uso en el paso 2.4.

2. Separación y purificación de moléculas pequeñas y péptidos del extracto de Gymnema sylvestre

1. Mida 0,6 g de extracto de planta y disuelva en agua destilada (60 ml) mezclando en un tubo de rodillo durante 5 min.
   NOTA: Cualquier muestra biológica que sea soluble y libre de sal se puede utilizar para la separación y purificación utilizando este instrumento IEF. Las muestras con concentración de sal amortiguadora de hasta 10 mM se pueden utilizar con una resolución ligeramente disminuida. Estamos interesados en la familia saponina de compuestos triterpenoides, los ácidos gimnómicos, de la planta G. sylvestre por sus propiedades antifúngicas únicas¹⁶.
2. Centrifugar el extracto de planta solubilizada a 10.000 x g durante 5 min para eliminar partículas insolubles.
3. Transfiera el sobrenadante (60 ml) a un tubo centrífugo de 80 ml y mezcle con 0,6 ml de anfólito (pH 3-10) a 1% (v/v).
4. Siga los pasos 1.1 a 1.7 para preparar la unidad IEF de fase líquida. La cámara ya está lista para cargar la muestra.
5. Utilice una jeringa de 50 ml con una aguja de extremo romo de 1-1/2 pulgadas y 19 G (viene con el instrumento) y cargue la muestra preparada con anzuelo (60 ml en total) en la celda a través de puertos de recogida de muestras.
6. Retire las burbujas de aire de la celda de muestra quitando la célula de enfoque del soporte y tocando la cámara del electrodo para desalojar las burbujas. La presencia de burbujas de aire causará fluctuaciones de tensión y corriente y afectarán a la carrera.
7. Conecte la unidad al refrigerante de agua (4 oC) y arranque el fraccionamiento con la fuente de alimentación a una temperatura de 15 W.
8. Ejecute el aparato durante 3 h o hasta que la tensión alcance un valor constante.
   NOTA: A medida que la muestra comienza a enfocarse, el voltaje comenzará a subir gradualmente hasta que alcance un valor constante.
9. Después de la carrera, prepárese para recoger las fracciones en la caja de cosecha (que contiene 20 tubos de plástico, 12 mm x 75 mm, 5-6 ml de volumen) conectados a la bomba de vacío pulsando el botón de cosecha ON en la unidad IEF.
10. Alinee los pines de 20 colecciones con los puertos de 20 colecciones de la celda de enfoque que está sellada con la cinta.
11. Empuje los pasadores de recogida a través de la cinta de sellado y encienda la bomba de vacío simultáneamente (consulte la Figura 2B, 2C y 2D).
    NOTA: Alrededor de 3 fracciones de ml de cada cámara se recogerán en los tubos para cada vez. Las fracciones se pueden utilizar para aplicaciones posteriores posteriores (SDS-PAGE para la cuantificación de péptidos, TLC y bioensayo para moléculas pequeñas).

3. Separación y purificación de proteínas de C. albicans

1. Cultivar una sola colonia de C. albicans en caldo de levadura-peptona-dextrosa (YPD)¹⁶ a 30 oC con temblor (200 rpm) durante la noche.
2. Recoger las células de levadura por centrifugación (10.000 x g durante 5 min).
3. Suspenda las células de levadura C. albicans en carbonato de amonio (1,89 g/L) tampón que contenga un 1% (v/v) beta-mercaptoetanol (-ME) (1/10 del volumen de cultivo) y gire en un tubo de rodillos durante 1 h a 5 oC¹⁵.
4. Retire las células de levadura por centrifugación (10.000 x g durante 5 min) y filtre el extracto de proteína a través de un filtro de 0,45 m.
   NOTA: Las muestras de proteínas de C. albicans cytosol, membrana o pared celular se pueden preparar y utilizar para fraccionamiento IEF. Del mismo modo, las proteínas de bacterias u otras muestras biológicas (extracto de tejido animal) se pueden utilizar después de eliminar cualquier sal mediante métodos apropiados (porejemplo,mediante diálisis o utilizando columnas de desaladación).
5. Dialyze el extracto de proteína en un tubo de diálisis (3.500 MWCO) contra el agua durante 15 h a 4 oC. Estimar la concentración de proteínas por el método de unión de colorante Bradford utilizando la globulina gamma como estándar¹⁷.
6. Utilice 500 mg de proteína total en 60 ml de agua que contenga 1% (v/v) anzuelo (pH 5-8) para la fraccionación.
   NOTA: Dado que un anfilito de amplio alcance (pH 3-10) no enriquece bien ciertas proteínas de pared celular no-glucano de C. albicans, utilice un antillito de rango estrecho (pH 5-8). Se puede utilizar una concentración de anfilito de hasta 2% si la concentración de proteína de la muestra es superior a 2 mg/ml; esto minimiza la agregación de proteínas durante el enfoque. Mantenga siempre las muestras, los anfilitos y el agua preenfriado sobre hielo.
7. Repita los pasos 1.1 a 1.7 para preparar la unidad IEF y utilizar la solución proteica del paso 3.6 para cargarla en la célula IEF.
8. Después de 4 horas de enfocarse en una constante de 15 W, cosecha fracciones de proteínas (1-20) como se describió anteriormente (pasos 2.9-2.11) y analiza en 12.5% SDS-PAGE después de reducir y hervir las muestras de^{proteínas 18}.
9. Manchar las proteínas resueltas manchando el gel SDS-PAGE con el tinte azul Coomassie (0,01%) solución para 2-3 h a temperatura ambiente en un balancín. Detenga el gel y grabe la imagen del gel con un imán de gel.
   NOTA: Tinte azul Coomassie (0,01%) se puede preparar mezclando 0,01 g de polvo azul de Coomassie en una solución de detención que contiene 40% de metanol y 10% ácido acético.

4. Bioactividad de moléculas pequeñas purificadas del extracto de plantas Gymnema sylvestre

1. Cultivar C. albicans en células de levadura como en el paso 3.1.
2. Para preparar la suspensión celular, diluir el cultivo nocturno de C. albicans células de levadura (1/1000 dilución) en un medio de cultivo celular RPMI fresco complementado con 50 mM de glucosa.
   NOTA: C. albicans convierte del crecimiento de la levadura a hifas en condiciones de inductor hifalal (RPMI a 37 oC). Se ha demostrado que las moléculas pequeñas de ácido gimnómico inhiben la conversión de células de levadura en hifas en condiciones de inducción hifa¹⁶. Nuestro objetivo era determinar si el extracto de G. sylvestre separado por la fase líquida-IEF contiene estas moléculas bioactivas.
3. A partir de la suspensión de la célula preparada, agregue 90 l a cada pocód en cada pocód en la placa de 96 pocillos.
4. De cada fracción (1-20 fracciones cosechadas de extracto de G. sylvestre obtenidas de IEF de fase líquida, Figura 4), añadir 10 l en los pocós con 90 l de la suspensión celular anterior (paso 4.2). Realice el ensayo por triplicado.
5. Añadir 10 l de agua que contenga anfilito (1%) en pozos separados con 90 ml de C. suspensión de células de levadura albicans como un control negativo.
   NOTA: Los anfilitos tienen potencial de bioactividad, por lo que es esencial incluir un control de anfieles mientras se realiza cualquier bioensayo^19.
6. Incubar la placa de 96 pocillos a 37oC durante 12 h y observar la inhibición de la conversión de C. albicans de levadura a hifa bajo el microscopio¹⁶. Además, determinar el porcentaje de inhibición de la conversión de levadura a hifa.

Resultados

Separación y purificación de moléculas pequeñas y péptidos del extracto de la planta Gymnema sylvestre
Utilizando el método IEF de fase líquida preparatoria, fraccionamos extractos de plantas medicinales y proteínas de superficie celular de un hongo patógeno humano, C. albicans. Un esquema de estos protocolos de fraccionamiento se muestra en la Figura 1.

A partir de 20 fracciones de extracto de G. sylvestre obteni...

Discusión

Las moléculas pequeñas de fuentes de productos naturales (por ejemplo, plantas) incluyen metabolitos secundarios complejos que son muy diversos en la estructura química. Se cree que están involucrados en los mecanismos de defensa de las plantas. Además, los polipéptidos también están presentes en los tejidos vegetales²². Estas moléculas pequeñas de producto natural son ricas fuentes de moléculas de prueba para el descubrimiento y desarrollo de fármacos. Sin embargo, los métodos difíc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Fisher scientfic	09-720-004
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	207861-500
Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	Bio-Rad	163-1113
Bio-Lyte 5/8 Ampholyte	Bio-Rad	163-1192
Compact low temperature thermostat	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B7920
Dialysis tubing (3,500 MWCO)	Spectrum Spectra/Por	132112T
Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids)	Suan Farma, NJ USA
Incubator	Lab companion	SI 300R
Microscope	Leica	DM 6B
Mini protean electrophoresis	Bio-Rad
pH meter	Mettler Toledo	S20	Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions
Rotofor	Bio-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)
RPMI-1640 Medium	HyClone	DH30255.01
Sealing tape	Bio-Rad	170-2960	Scotch tape may also be used.
Sorvall legend micro 17 centrifuge	Thermo scientific	75002432
TPP tissue culture plate -96 well flat bottom	TPP	TP92696