Separazione delle piccole molecole bioattive, Peptidi da fonti naturali e proteine dai microbi di Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Metodo

Riepilogo

L'obiettivo è frazionare e isolare piccole molecole bioattive, peptidi da un complesso estratto vegetale e proteine da microbi patogeni utilizzando il metodo di messa a fuoco isoelettrica a fase liquida (IEF). Inoltre, sono state identificate le molecole separate e la loro bioattività è stata confermata.

Abstract

I prodotti naturali derivati da piante e microbi sono una ricca fonte di molecole bioattive. Prima del loro utilizzo, le molecole attive da estratti complessi devono essere purificate per applicazioni a valle. Ci sono vari metodi cromatografici disponibili per questo scopo, ma non tutti i laboratori possono permettersi metodi ad alte prestazioni e l'isolamento da campioni biologici complessi può essere difficile. Qui dimostriamo che la messa a fuoco isoelettrica in fase liquida preparata (IEF) può separare le molecole, tra cui piccole molecole e peptidi da complessi estratti vegetali, in base ai loro punti isoelettrici (pI). Abbiamo usato il metodo per la frazionamento e la caratterizzazione complesse dei campioni biologici. Come prova di concetto, abbiamo frazionato un estratto di pianta di Gymnema sylvestre, isolando una famiglia di salonina terpenoide piccole molecole e un peptide. Abbiamo anche dimostrato un'efficace separazione delle proteine microbiche usando il fungo Candida albicans come sistema modello.

Introduzione

La purificazione delle biomolecole da complessi campioni biologici è un passo essenziale e spesso difficile negli esperimenti biologici¹. La messa a fuoco isoelettrica (IEF) è adatta per la separazione ad alta risoluzione di biomolecole complesse in cui gli amplificatori portante viaggiano secondo la loro carica e stabiliscono il gradiente di pH in un campo elettrico³. Il primo amplificatore commerciale per IEF è stato sviluppato da Olof Vesterberg nel 1964 e brevettato^4,5. Gli ampifiti portatrici sono molecole di acido oligo-amino-amino-carboxylicia alatoriche a varia lunghezza e ramificazione⁶. Successivamente, Vesterberg e altri migliorarono gli amplificatori del vettore per il loro uso espanso nel separare le biomolecole^6,7.

I metodi per separare le biomolecole includono l'elettroforesi gel agarosa e poliacrilamina, l'elettroforesi gel bidimensionale (2-DE), la messa a fuoco isoelettrica, l'elettroforesi capillare, l'isotachophoresi e altre tecniche cromografiche (ad esempio, TLC, FPLC, HPLC)². La IEF in fase liquida eseguita in uno strumento chiamato "Rotofor" è stata inventata da Milan Bier⁸. Fu pioniere nel concetto e nella progettazione di questo strumento e contribuì ampiamente alla teoria della migrazione elettroforetica. Il suo team ha anche sviluppato un modello matematico del processo di separazione elettroforetica per simulazioni al computer⁹.

L'apparato IEF a fase liquida è una cella cilindrica a rotazione orizzontale costituita da un nucleo di nylon diviso in 20 compartimenti porosi e un'asta di ceramica di raffreddamento ad acqua circolante. Le camere porose permettono alle molecole di migrare attraverso la fase acquosa tra gli elettrodi e permettono la raccolta di campioni purificati sotto vuoto in frazioni. Questo sistema di purificazione può fornire fino a 1000 volte la purificazione di una molecola specifica in <4 ore. Una caratteristica preziosa di questo strumento è che può essere applicato come primo passo per la purificazione da una miscela complessa o come passo finale per raggiungere la purezza¹⁰. Se la molecola di interesse è una proteina, un altro vantaggio è che la sua conformazione nativa sarà mantenuta durante la separazione.

L'uso di IEF a fase liquida è stato ampiamente segnalato per proteine, enzimi e purificazione degli anticorpi^6,10,^11,12,,13,14. Qui descriviamo l'uso di questo approccio per separare e purificare piccole molecole e peptidi dalla pianta medicinale Gymnema sylvestre. Questo protocollo aiuterà i ricercatori a concentrato e a purificare le piccole molecole attive da un estratto di pianta per applicazioni a valle a basso costo. Inoltre, dimostriamo anche che l'arricchimento delle proteine da un complesso estratto di proteine da Candida albicans fungo¹⁵ in questo sistema basato su IEF come secondo esempio.

Protocollo

1. Configurazione e pre-esecuzione dell'unità IEF standard in fase liquida

1. Assemblare gli elettrodi IEF a fase liquida (pulsante anodo-rosso e pulsante catodo-nero) con le rispettive membrane di scambio secondo il manuale di istruzioni (vedere Tabella dei materiali). E' necessario scambiare le membrane di scambio dell'anione con 0,1 M NaOH e le membrane di scambio di 0,1 M H₃₄ almeno per 16 h quando vengono utilizzate nuove membrane.
   1. Conservare le membrane negli elettroliti (0,1 M NaOH o 0,1 M H₃PO₄) tra le rampe e non lasciare asciugare.
2. Assemblare la parte interna ed esterna dell'elettrodo allineando tre fori oblunghi nelle guarnizioni di scambio io-io. Riempire gli elettrodi con i rispettivi elettroliti (25-30 mL) per evitare che le loro membrane si asciughino.
   1. Non aggiungere l'elettrolita in eccesso (più di 1/3^rd di volume della camera dell'elettrodo) che può accumulare pressione all'interno dell'elettrodo e causare perdite.
3. Coprire le porte di raccolta di esempio con nastro di sguarsione fornito con le parti di assieme dello strumento (vedere Tabella dei materiali). Il lato delle porte di raccolta del campione può essere identificato dai due perni di allineamento in metallo verticale. In alternativa, utilizzare il nastro di sguarsioni standard per sigillare le porte.
4. Assemblare tutte le parti dell'assieme della camera di messa a fuoco in sequenza (elettrodo anodo, nucleo di membrana di nylon, camera di messa a fuoco ed elettrodo catodo) sopra il dito di raffreddamento in ceramica.
5. Riempire la camera di messa a fuoco con acqua distillata preraffreddata (volume totale di 60 mL per la cella iEF standard) utilizzando una siringa da 50 mL.
6. Collegare lo strumento IEF a fase liquida ad un'acqua di raffreddamento circolante a 4 oC e preeseguire l'unità a 15 W e 3.000 V per 3-5 min o fino a quando la tensione si stabilizza.
   NOTA: Generalmente, entro un minuto, la tensione raggiungerà i valori massimi impostati. Pre-running con acqua distillata aiuta a rimuovere gli ioni residui dalla camera di messa a fuoco e dal nucleo della membrana di nylon.
7. Spegnere la fonte di alimentazione e rimuovere l'acqua dalla cella utilizzando il collettore di frazioni. Sigillare nuovamente le porte di raccolta con nastro adesivo.
   NOTA: Ora lo strumento è pronto per l'uso nel passaggio 2.4.

2. Separazione e purificazione di piccole molecole e peptidi dall'estratto di Gymnema sylvestre

1. Misurare 0,6 g di estratto vegetale e sciogliere in acqua distillata (60 mL) mescolando in un tubo a rulli per 5 min.
   NOTA: Qualsiasi campione biologico solubile e privo di sale può essere utilizzato per la separazione e la purificazione utilizzando questo strumento IEF. I campioni con concentrazione di sale da tampone fino a 10 mM possono essere utilizzati con una risoluzione leggermente ridotta. Siamo interessati alla famiglia saponina di composti triterpenoidi, gli acidi gymnemici, dalla pianta di G. sylvestre per le loro proprietà antifungini uniche¹⁶.
2. Centrifugare l'estratto di pianta solubile a 10.000 x g per 5 min per rimuovere le particelle insolubili.
3. Trasferire il supernatante (60 mL) in un tubo di centrifuga di 80 mL e mescolarlo con 0,6 mL di ampholyte (pH 3-10) all'1% (v/v).
4. Seguire i passaggi da 1.1 a 1.7 per preparare l'unità IEF in fase liquida. La camera è ora pronta per caricare il campione.
5. Utilizzare una siringa da 50 mL con un ago di estremità consuntifino da 1-1/2 pollice (fornito con lo strumento) e caricare il campione preparato con ampholyte (60 mL totali) nella cella attraverso le porte di raccolta dei campioni.
6. Rimuovere le bolle d'aria dalla cella campione rimuovendo la cella di messa a fuoco dal supporto e toccando la camera dell'elettrodo per spostare le bolle. La presenza di bolle d'aria causerà fluttuazioni di tensione e corrente e influenzerà la corsa.
7. Collegare l'unità al refrigerante per l'acqua (4 gradi centigradi) e iniziare la frazione con l'alimentazione a una costante di 15 W.
8. Eseguire l'apparato per 3 h o fino a quando la tensione raggiunge un valore costante.
   NOTA: Quando il campione inizia a mettere a fuoco, la tensione inizierà a salire gradualmente fino a raggiungere un valore costante.
9. Dopo la corsa, prepararsi a raccogliere le frazioni nella scatola di raccolta (contenente 20 tubi di plastica, 12 mm x 75 mm, 5-6 mL di volume) collegati alla pompa a vuoto premendo il pulsante di raccolta ON nell'unità IEF.
10. Allineare i pin di raccolta 20 con le 20 porte di raccolta della cella di messa a fuoco che è sigillato con il nastro.
11. Spingere i perni di raccolta attraverso il nastro di sigillatura e accendere contemporaneamente la pompa a vuoto (vedere Figura 2B, 2C e 2D).
    NOTA: Circa 3 frazioni mL da ogni camera saranno raccolte nei tubi per ogni volta. Le frazioni possono essere utilizzate per le successive applicazioni a valle (SDS-PAGE per la quantificazione dei peptidi, Il TLC e il bioassaggio per piccole molecole).

3. Separazione e purificazione delle proteine dai C. albicans

1. Coltivare una singola colonia di C. albicans nel brodo di lievito-peptone-dextrose (YPD)¹⁶ a 30 s con agitazione (200 rpm) per una notte.
2. Raccogliere le cellule di lievito mediante centrifugazione (10.000 x g per 5 min).
3. Sospendere le celle di lievito C. albicans nel buffer di carbonato di ammonio (1,89 g/L) contenente 1% (v/v) beta-mercaptoetanolo (-ME) (1/10 del volume di coltura) e ruotare in un tubo a rulli per 1 h a 5 .¹⁵
4. Rimuovere le cellule di lievito mediante centrifugazione (10.000 x g per 5 min) e filtrare l'estratto di proteina attraverso un filtro di 0,45 m.
   NOTA: campioni di proteine da C. albicans cytosol, membrana o parete cellulare possono essere preparati e utilizzati per la frazione IEF. Allo stesso modo, le proteine di batteri o altri campioni biologici (estratto di tessuto animale) possono essere utilizzate dopo la rimozione di qualsiasi sale con metodi appropriati(ad esempio,mediante dialisi o utilizzando colonne di delsalazione).
5. Dialisi l'estratto di proteine in un tubo di dialisi (3.500 MWCO) contro l'acqua per 15 h a 4 gradi centigradi. Stimare la concentrazione proteica con il metodo di legame dei coloranti Bradford utilizzando la globulina gamma come standard¹⁷.
6. Utilizzare 500 mg di proteine totali in 60 mL di acqua contenente 1% (v/v) ampholyte (pH 5-8) per la frazione.
   NOTA: Poiché un ampholyte ad ampio raggio (pH 3-10) non arricchisce bene alcune proteine cellulari non gluchesi di C. albicans, utilizzare un ampholyte a fascia stretta (pH 5-8). Una concentrazione di ampiste fino al 2% può essere utilizzata se la concentrazione proteica del campione è superiore a 2 mg/mL; questo riduce al minimo l'aggregazione proteica durante la messa a fuoco. Tenere sempre i campioni, gli amplificatori e l'acqua preraffreddati sul ghiaccio.
7. Ripetere i passaggi da 1.1 a 1.7 per preparare l'unità IEF e utilizzare la soluzione proteica del passaggio 3.6 per caricare nella cella IEF.
8. Dopo 4 h di messa a fuoco a una costante di 15 W, raccogliere le frazioni proteiche (1-20) come descritto sopra (passaggi 2.9-2.11) e analizzare su 12.5% SDS-PAGE dopo aver ridotto e bollito i campioni di proteine¹⁸.
9. Macchiare le proteine risolte macchiando il gel SDS-PAGE con la tintura blu Coomassie (0,01%) soluzione per 2-3 h a temperatura ambiente su un rocker. Demacchiare il gel e registrare l'immagine gel utilizzando un imager gel.
   NOTA: Colora blu Coomassie (0,01%) può essere preparato mescolando 0,01 g di polvere blu Coomassie in una soluzione di destaining contenente il 40% di metanolo e il 10% di acido acetico.

4. Bioattività di piccole molecole purificate dall'estratto vegetale Gymnema sylvestre

1. Crescere C. albicans in cellule di lievito come nel passaggio 3.1.
2. Per preparare la sospensione cellulare, diluire la coltura notturna delle cellule di lievito di C. albicans (1/1000 diluizione) in un nuovo mezzo di coltura cellulare RPMI integrato con 50 mM di glucosio.
   NOTA: C. albicans converte dalla crescita del lievito alle iphae in condizioni di induzione dell'isatra (RPMI a 37 gradi centigradi). L'acido gymnemico piccole molecole sono mostrate per inibire la conversione delle cellule di lievito in hyphae in condizioni di ipfa che inducono¹⁶. Abbiamo cercato di determinare se l'estratto di G. silvestre separato da G. IEF dalla fase liquida contenga queste molecole bioattive.
3. Dalla sospensione a celle preparate, aggiungere 90 gradi a ogni pozzetto della piastra di 96 pozze.
4. Da ogni frazione (1-20 frazioni raccolte dell'estratto di G. sylvestre ottenute dalla IEF in fase liquida, figura 4),aggiungere 10 l nelle pozze con 90 gradi l della sospensione cellulare di cui sopra (passaggio 4.2). Eseguire il saggio in triplice copia.
5. Aggiungere 10 - L di acqua che contiene ampholyte (1%) in pozzi separati con 90 L di C. albicans lievito sospensione cellulare come controllo negativo.
   NOTA: Gli ampeti hanno un potenziale di bioattività e quindi è essenziale includere un controllo amplificato durante l'esecuzione di qualsiasi bioassay¹⁹.
6. Incubare la piastra di 96 pozzea a 37 gradi centigradi per 12 h e osservare l'inibizione della conversione da lievito a ipofha C. albicans al microscopio¹⁶. Inoltre, determinare la percentuale di inibizione della conversione tra lievito e ipha.

Risultati

Separazione e purificazione di piccole molecole e peptidi dall'estratto vegetale di Gymnema sylvestre
Utilizzando il metodo iEF preparativo in fase liquida, abbiamo frazionato estratti vegetali medicinali e proteine della superficie cellulare da un fungo patogeno umano, C. albicans. Uno schema di questi protocolli di frazionamento è illustrato nella Figura 1.

Da 20 frazioni di G. sylvestre estratto ottenuto da Liquid...

Discussione

Le piccole molecole provenienti da fonti di prodotti naturali (ad esempio, piante) includono metaboliti secondari complessi che sono altamente diversificati nella struttura chimica. Si ritiene che siano coinvolti nei meccanismi di difesa delle piante. Inoltre, i polipeptidi sono presenti anche nei tessuti vegetali²². Questi piccoli molecole di prodotto naturale sono ricche fonti di molecole di prova per la scoperta e lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, i metodi difficili e noiosi necessari per il lo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Fisher scientfic	09-720-004
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	207861-500
Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	Bio-Rad	163-1113
Bio-Lyte 5/8 Ampholyte	Bio-Rad	163-1192
Compact low temperature thermostat	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B7920
Dialysis tubing (3,500 MWCO)	Spectrum Spectra/Por	132112T
Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids)	Suan Farma, NJ USA
Incubator	Lab companion	SI 300R
Microscope	Leica	DM 6B
Mini protean electrophoresis	Bio-Rad
pH meter	Mettler Toledo	S20	Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions
Rotofor	Bio-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)
RPMI-1640 Medium	HyClone	DH30255.01
Sealing tape	Bio-Rad	170-2960	Scotch tape may also be used.
Sorvall legend micro 17 centrifuge	Thermo scientific	75002432
TPP tissue culture plate -96 well flat bottom	TPP	TP92696