JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель состоит в том, чтобы дробить и изолировать биологически активные мелкие молекулы, пептиды из сложного растительного экстракта и белки из патогенных микробов, используя жидко-фазный изоэлектрический метод фокусировки (IEF). Кроме того, были идентифицированы разделенные молекулы и подтверждена их биоактивность.

Аннотация

Натуральные продукты, полученные из растений и микробов, являются богатым источником биологически активных молекул. Перед их использованием активные молекулы из сложных экстрактов должны быть очищены для применения ниже по течению. Существуют различные хроматографические методы, доступные для этой цели, но не все лаборатории могут позволить себе методы высокой производительности и изоляции от сложных биологических образцов может быть трудно. Здесь мы демонстрируем, что preparative liquid-phase isoelectric focusing (IEF) может отделять молекулы, в том числе небольшие молекулы и пептиды из сложных растительных экстрактов, на основе их изоэлектрических точек (pI). Мы использовали метод для сложной фракционации и характеристики биологических образцов. В качестве доказательства концепции, мы дроболовый экстракт Гимнема сильвестр растений, изолируя семейство терпеноидных сапонин малых молекул и пептид. Мы также продемонстрировали эффективное разделение микробного белка с использованием грибка Candida Albicans в качестве модели системы.

Введение

Очистка биомолекулы из сложных биологических образцов является важным и часто трудным шагом в биологических экспериментах1. Изоэлектрическая фокусировка (IEF) хорошо подходит для разделения высокого разрешения сложных биомолекул, где несущая амфолиты путешествуют в соответствии с их зарядом и устанавливают градиент рН в электрическом поле3. Первый коммерческий авиаперевозчик для IEF был разработан Улофом Вестербергом в 1964 году и запатентовал4,5. Перевозчик амфолиты алифатические олиго-амино олиго-карбокслихиловой кислоты молекул различной длины и ветвящихся6. Впоследствии Вестерберг и другие улучшили перевозчик амфолитов для их расширенного использования в разделении биомолекул6,7.

Методы разделения биомолекул включают агарозу и полиакриламинид гель электрофорез, двухмерный гель электрофорез (2-DE), изоэлектрической фокусировки, капиллярный электрофорез, изотахофорез и другие хроматографические методы (например, TLC, FPLC, HPLC)2. Ликвид-фазный IEF, выполненный в инструменте под названием "Rotofor", был изобретен Миланом Биром8. Он был инициатором концепции и дизайна этого инструмента и внес значительный вклад в теорию электрофоретической миграции. Его команда также разработала математическую модель электрофоретического процесса разделения для компьютерного моделирования9.

Аппарат IEF-фазы является горизонтально вращающейся цилиндрической ячейкой, состоящей из нейлонового ядра, разделенного на 20 пористых отсеков и циркулирующего керамического стержня для охлаждения воды. Пористие камеры позволяют молекулам мигрировать через аквеи между электродами и позволяют сбор очищенных образцов под вакуумом в фракциях. Эта система очистки может обеспечить до 1000-кратное очищение конкретной молекулы в Зтт;4 часа. Ценной особенностью этого инструмента является то, что он может быть применен в качестве первого шага для очистки от сложной смеси или в качестве заключительного шага для достижения чистоты10. Если молекулой интереса является белок, еще одним преимуществом является то, что его родная конформация будет поддерживаться во время разделения.

Использование жидко-фазы IEF было широко сообщено для белков, ферментов и очищения антител6,,10,,11,12,13,14. Здесь мы описываем использование этого подхода для разделения и очистки малых молекул и пептидов от лекарственного растения Gymnema sylvestre. Этот протокол поможет исследователям сконцентрировать и очистить активные малые молекулы из растительного экстракта для приложений ниже по течению по низкой цене. Кроме того, мы также демонстрируем, что обогащение белков из сложного белкового экстракта из гриба Candida albicans 15 в этой системе на основе IEF в качестве второго примера.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Настройка и предзахугивание стандартного жидко-фазного блока IEF

  1. Соберите жидко-фазные электроды IEF (анодно-красная кнопка и катодно-черная кнопка) с их соответствующими мембранами обмена в соответствии с инструкцией (см. Таблицу Материалов). Эквилибрировать мембраны аниона обмена с 0,1 M NaOH и катиона обменных мембран с 0,1 M H3PO4 по крайней мере для 16 ч, когда новые мембраны используются.
    1. Храните мембраны в электролитах (0,1 M NaOH или 0.1 M H3PO4) между пробегами и не позволяйте высохнуть.
  2. Соберите внутреннюю и внешнюю часть электрода, выровняв три продолговатых отверстия в ионо-обменных прокладок. Заполните электроды соответствующими электролитами (25-30 мЛ), чтобы предотвратить высыхание их мембран.
    1. Не добавляйте избыток (более 1/3rd объема электродной камеры) электролит, который может создать давление внутри электрода и вызвать утечку.
  3. Обложка порта сбора образцов с уплотнительной лентой, которая поставляется с инструментами сборки частей (см. Таблица материалов). Сторона портов сбора образца может быть идентифицирована двумя вертикальными металлическими контактами выравнивания. Кроме того, используйте стандартную уплотнительную ленту для уплотнения портов.
  4. Соберите все части фокусировки камеры сборки в последовательности (анодный электрод, ядро нейлоновой мембраны, фокусировки камеры и катодный электрод) над керамическим охлаждающим пальцем.
  5. Заполните фокусировочный зал предварительно позолоченной дистиллированной водой (общий объем 60 мл для стандартной ячейки IEF) с помощью шприца 50 мл.
  6. Подключите жидкостную фазу IEF-прибора к циркулирующей охлаждающей воде при 4 oC и препроводите устройство при 15 Вт и 3000 В в течение 3-5 мин или до тех пор, пока напряжение не стабилизируется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, в течение одной минуты напряжение достигнет максимальных значений набора. Предварительное обслуживание дистиллированной водой помогает удалить остаточные ионы из фокусировочных камер и ядра нейлоновой мембраны.
  7. Выключите источник питания и удалите воду из ячейки с помощью фракционного коллектора. Повторно запечатывание коллекторских портов с уплотнительной лентой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь инструмент готов к использованию в шаге 2.4.

2. Разделение и очищение малых молекул и пептидов из экстракта Gymnema sylvestre

  1. Измерьте 0,6 г растительного экстракта и растворите в дистиллированной воде (60 мл) путем смешивания в роликовой трубке в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой биологический образец, который растворим и не состоит из соли, может быть использован для разделения и очистки с помощью этого инструмента IEF. Образцы с буферизацией концентрации соли до 10 мМ можно использовать с немного пониженным разрешением. Мы заинтересованы в сапонин семьи тритерпеноидных соединений, gymnemic кислоты, от G. sylvestre завода за их уникальные противогрибковые свойства16.
  2. Центрифуга солюбилизованный растительный экстракт на 10000 х г в течение 5 минут для удаления нерастворимых частиц.
  3. Перенесите супернатант (60 мЛ) в центрифуговую трубку 80 мЛ и смешайте его с 0,6 мл амфолита (рН 3-10) до 1% (v/v).
  4. Следуйте шагам 1.1 – 1.7 для подготовки жидко-фазного блока IEF. Камера готова к загрузке образца.
  5. Используйте шприц 50 мЛ с 1-1/2 дюйма 19 G тупой иглой конца (поставляется с инструментом) и загрузить подготовленный образец с амфолитом (60 мл всего) в ячейке через порты сбора образцов.
  6. Удалите пузырьки воздуха из образец ячейки, удалив фокусировки ячейки из стенда и нажав на электрод камеры, чтобы выбить пузырьки. Наличие пузырьков воздуха вызовет напряжение и текущие колебания и повлияет на пробег.
  7. Подключите устройство к водяной охлаждающей охлаждающей охлаждающей охлаждающей энергии (4 градуса По Цельсию) и начните фракционирование с блоком питания при постоянном 15 Вт.
  8. Выполнить аппарат для 3 ч или до тех пор, пока напряжение достигает постоянного значения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По мере того как образец начинает фокусировать, напряжение начнет поднимать постепенно до тех пор пока оно не достигнет постоянн значения.
  9. После пробежки приготовьтесь собирать фракции в ящике для сбора урожая (содержащих 20 пластиковых трубок, 12 мм х 75 мм, объем 5-6 мл), подключенных к вакуумному насосу, нажав кнопку сбора урожая ON в блоке IEF.
  10. Выровняйте 20-коллекционные булавки с 20-коллекционных портов фокусировочной ячейки, которая запечатана лентой.
  11. Нажмите коллекционные булавки через уплотнительную ленту и поверните вакуумный насос ON одновременно (см. рисунок 2B, 2C и 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Около 3 мЛ фракций от каждой камеры будут собраны в трубы для каждого времени. Фракции могут быть использованы для последующих приложений вниз по течению (SDS-PAGE для пептидной количественной оценки, TLC и биоанализа для малых молекул).

3. Разделение и очищение белков от C. albicans

  1. Выращивайте одноколечную колонию C. albicans в дрожжевом пептоне-декстрозы (YPD)бульоне 16 при 30 градусах с встряхиванием (200 об/мин) на ночь.
  2. Собирайте дрожжевые клетки путем центробежия (10 000 х г в течение 5 мин).
  3. Приостановить C. albicans дрожжевых клеток в карбонат аммония (1,89 г/ л) буфер, содержащий 1% (v/v) бета-меркаптоэтанол (Я-ME) (1/10th объема культуры) и вращаться в роликовой трубке на 1 ч при 5 С15.
  4. Удалите дрожжевые клетки путем центрифугации (10000 х г в течение 5 мин) и фильтруем экстракт белка через фильтр 0,45 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы белка из C. Albicans цитозол, мембраны или клеточной стенки могут быть подготовлены и использованы для фракционации IEF. Аналогичным образом, белки из бактерий или других биологических образцов (экстракт тканей животных) могут быть использованы после удаления любой соли соответствующими методами(например,путем диализа или с использованием опреснения столбцов).
  5. Диализный экстракт белка в диализной трубке (3500 МВТКО) против воды в течение 15 ч при 4 градусах Цельсия. Оцените концентрацию белка методом связывания красителей Брэдфорда с использованием гамма-глобулина в качестве стандартного17.
  6. Используйте 500 мг общего белка в 60 мл воды, содержащей 1% (v/v) амфолит (рН 5-8) для фракционации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку широко диапазон амфолита (рН 3-10) не обогащает некоторые неглукановые прикрепленные клеточные стенки белки C. albicans хорошо, используйте узкий диапазон (рН 5-8) амфолит. Концентрация амфолита до 2% может быть использована, если концентрация белка образца превышает 2 мг/мЛ; это сводит к минимуму агрегацию белка во время фокусировки. Всегда держите образцы, амфолиты, и вода предварительно помолилась на льду.
  7. Повторите шаги 1.1- 1.7 для подготовки блока IEF и используйте белковый раствор от шага 3.6 к нагрузке в ячейку IEF.
  8. После 4 h фокусировки на постоянной 15 Вт, урожай белковых фракций (1-20), как описано выше (шаги 2,9-2,11) и проанализировать на 12,5% SDS-PAGE после сокращения и кипячения белковых образцов18.
  9. Окрашивание решенных белков путем окрашивания гель SDS-PAGE с синим красителем Coomassie (0.01%) раствор для 2-3 ч при комнатной температуре на рокере. Отсейть гель и записать изображение геля с помощью геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кумасси синий краситель (0.01%) может быть подготовлен путем смешивания 0,01 г Синяя порошок Coomassie в растворе, содержащем 40% метанола и 10% уксусной кислоты.

4. Биоактивность очищенных малых молекул из растительного экстракта Gymnema sylvestre

  1. Выращивайте C. albicans в дрожжевых клетках как в шаге 3.1.
  2. Для подготовки клеточной суспензии разбавляйте ночную культуру дрожжевых клеток C. albicans (1/1000 разбавления) в свежую клеточную культуру RPMI, дополненную 50 мМ глюкозой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: C. albicans преобразует из роста дрожжей в гифы при гипхальском индуцирующих условиях (RPMI при 37 градусов по Цельсию). Гимнемические кислоты малых молекул, как показано, ингибируют преобразование дрожжевых клеток в гифы под гифа индуцирующих условия16. Мы стремились определить, содержит ли жидкий фаз-IEF-отделенный экстракт G. sylvestre эти биологически активные молекулы.
  3. Из подготовленной суспензии к каждому колодцу из 96-го колодца добавьте 90 л.
  4. Из каждой фракции (1-20 собранных фракций экстракта G. sylvestre, полученного из жидко-фазы IEF, Рисунок 4),добавьте 10 мл в скважины с 90 мл вышеуказанной клеточной подвески (шаг 4.2). Выполните анализ в трипликате.
  5. Добавьте 10 мл воды, содержащей амфолит (1%) в отдельные скважины с 90 мл суспензии дрожжевых клеток C. albicans в качестве отрицательного контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Амфолиты обладают потенциалом биоактивности, и поэтому необходимо включить контроль амфолита при выполнении любой биоанализии19.
  6. Инкубировать 96-хорошо пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 12 ч и наблюдать ингибирование C. albicans дрожжей к гифу преобразования под микроскопом16. Кроме того, определить процент ингибирования дрожжей к гифа преобразования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Разделение и очищение малых молекул и пептидов из экстракта растений Gymnema sylvestre
Используя предпаративный жидко-фазный метод IEF, мы дроболилили лекарственные растительные экстракты и белки поверхности клеток из патогенного гриба человека, C. albicans. Схема этих протоко?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Небольшие молекулы из натуральных источников продукта (например, растения) включают сложные вторичные метаболиты, которые очень разнообразны в химической структуре. Считается, что они участвуют в механизмах защиты растений. Кроме того, полипептиды также присутствуют в тканях растени?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы хотели бы заявить об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарны за источники финансирования из Отдела биологии и Джонсона онкологический научный центр BRIEF и ИРА награды, соответственно, GV. Мы также благодарим K-INBRE постдокторской награды Р.В. Эта работа была частично поддержана Премией за институциональное развитие (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под грантовым номером P20 GM103418. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национального института общих медицинских наук или Национальных институтов здравоохранения. Мы благодарим анонимных рецензентов за их полезные комментарии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 µm syringe filterFisher scientfic09-720-004
2-MercaptoethanolSigmaM3148
Ammonium carbonateSigma-Aldrich207861-500
Bio-Lyte 3/10 AmpholyteBio-Rad163-1113
Bio-Lyte 5/8 AmpholyteBio-Rad163-1192
Compact low temperature thermostatLauda -BrinkmannRM 6TSet water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.
Coomassie Brilliant Blue RSigma-AldrichB7920
Dialysis tubing (3,500 MWCO)Spectrum Spectra/Por132112T
Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids)Suan Farma, NJ USA
IncubatorLab companionSI 300R
MicroscopeLeicaDM 6B
Mini protean electrophoresisBio-Rad
pH meterMettler ToledoS20Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions
RotoforBio-Rad170-2972http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)
RPMI-1640 MediumHyCloneDH30255.01
Sealing tapeBio-Rad170-2960Scotch tape may also be used.
Sorvall legend micro 17 centrifugeThermo scientific75002432
TPP tissue culture plate -96 well flat bottomTPPTP92696

Ссылки

  1. Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
  2. Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
  3. Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
  4. Vesterberg, O. A. Y. Method of Isoelectric Fractionation. , US3485736A (1964).
  5. Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
  6. Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , Elsevier Science. 1(1983).
  7. Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
  8. Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
  9. Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
  10. Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
  11. Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
  12. Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
  13. Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
  14. Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
  15. Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
  16. Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189(2013).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  19. Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
  20. Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
  21. Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
  22. Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
  23. Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
  24. Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
  25. Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328(2019).
  26. Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

160Candida albicansGymnema sylvestreIEF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены