Trennung von bioaktiven kleinen Molekülen, Peptiden aus natürlichen Quellen und Proteinen aus Mikroben durch Präparative Isoelektrische Fokussierung (IEF) Methode

Zusammenfassung

Ziel ist es, bioaktive kleine Moleküle, Peptide aus einem komplexen Pflanzenextrakt und Proteine aus pathogenen Mikroben durch die Anwendung der Flüssigphasen-Isotonisierungsmethode (IEF) zu fraktionieren und zu isolieren. Darüber hinaus wurden die getrennten Moleküle identifiziert und ihre Bioaktivität bestätigt.

Zusammenfassung

Natürliche Produkte aus Pflanzen und Mikroben sind eine reiche Quelle bioaktiver Moleküle. Vor ihrer Verwendung müssen die aktiven Moleküle aus komplexen Extrakten für nachgeschaltete Anwendungen gereinigt werden. Es gibt verschiedene chromatographische Methoden für diesen Zweck zur Verfügung, aber nicht alle Labore können sich Hochleistungsmethoden leisten und die Isolierung von komplexen biologischen Proben kann schwierig sein. Hier zeigen wir, dass präparative flüssige Phasen-Isoelektrische Fokussierung (IEF) Moleküle, einschließlich kleiner Moleküle und Peptide, von komplexen Pflanzenextrakten trennen kann, basierend auf ihren isoelektrischen Punkten (pI). Wir haben die Methode zur komplexen biologischen Probenfraktionierung und Charakterisierung eingesetzt. Als Beweis des Konzepts, Wir fraktioniert einen Gymnema sylvestre Pflanzenextrakt, Isolierung einer Familie von Terpenoid Saponin kleine Moleküle und ein Peptid. Wir haben auch eine effektive mikrobielle Proteintrennung mit dem Candida albicans Pilz als Modellsystem demonstriert.

Einleitung

Die Reinigung von Biomolekülen aus komplexen biologischen Proben ist ein wesentlicher und oft schwieriger Schritt in biologischen Experimenten¹. Isoelektrische Fokussierung (IEF) eignet sich gut für die hochauflösende Trennung komplexer Biomoleküle, bei denen Trägerampholyten nach ihrer Ladung reisen und den pH-Gradienten in einem elektrischen Feld³festlegen. Die erste kommerzielle Trägerampholyte für IEF wurde 1964 von Olof Vesterberg entwickelt und^4,5patentiert. Trägerampholyte sind aliphatische Oligo-Amino-Oligo-Carbonsäuremoleküle unterschiedlicher Länge und Verzweigung⁶. Anschließend verbesserten Vesterberg und andere die Trägerampholyten für ihren erweiterten Einsatz bei der Trennung von Biomolekülen^6,7.

Zu den Methoden zur Trennung von Biomolekülen gehören Agarose und Polyacrylamid-Gelelektrophorese, zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE), isoelektrische Fokussierung, Kapillarelektrophorese, Isotachophorese und andere chromatographische Techniken (z.B. TLC, FPLC, HPLC)². Liquid-Phase IEF in einem Instrument namens "Rotofor" durchgeführt wurde von Milan Bier⁸erfunden. Er war Pionier des Konzepts und der Gestaltung dieses Instruments und trug maßgeblich zur Theorie der elektrophoretischen Migration bei. Sein Team entwickelte auch ein mathematisches Modell des elektrophoretischen Trennverfahrens für Computersimulationen⁹.

Das Flüssigphasen-IEF-Gerät ist eine horizontal rotierende zylindrische Zelle, die aus einem Nylonkern besteht, der in 20 poröse Fächer und einen zirkulierenden Wasserkühlkeramikstab unterteilt ist. Die porösen Kammern ermöglichen es Molekülen, durch die wässrige Phase zwischen den Elektroden zu wandern und die Sammlung von gereinigten Proben unter Vakuum in Fraktionen zu ermöglichen. Dieses Reinigungssystem kann bis zu 1000-fache Reinigung eines bestimmten Moleküls in <4 Stunden ermöglichen. Ein wertvolles Merkmal dieses Instruments ist, dass es als erster Schritt für die Reinigung aus einer komplexen Mischung oder als letzter Schritt zur Erreichung der Reinheit¹⁰angewendet werden kann. Wenn das Molekül von Interesse ein Protein ist, ist ein weiterer Vorteil, dass seine native Konformation während der Trennung erhalten bleibt.

Die Verwendung von Flüssigphase IEF wurde weithin für Proteine, Enzyme und Antikörper-Reinigung^{6,10,11,12,13,14}berichtet. Hier beschreiben wir die Verwendung dieses Ansatzes zur Trennung und Reinigung kleiner Moleküle und Peptide von der Heilpflanze Gymnema sylvestre. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, aktive kleine Moleküle aus einem Pflanzenextrakt für nachgelagerte Anwendungen kostengünstig zu konzentrieren und zu reinigen. Darüber hinaus zeigen wir auch, dass die Anreicherung von Proteinen aus einem komplexen Proteinextrakt aus Candida albicans Pilz¹⁵ in diesem IEF-basierten System als zweites Beispiel.

Protokoll

1. Einrichtung und Vorlauf der Standard-Flüssigphasen-IEF-Einheit

1. Montieren Sie die flüssigen Phasen-IEF-Elektroden (anodenroter Knopf und Kathoden-Schwarzknopf) mit ihren jeweiligen Austauschmembranen gemäß der Bedienungsanleitung (siehe Materialtabelle). Gleichgewichten Sie die Anionenaustauschmembranen mit 0,1 M NaOH und die Kationenaustauschmembranen mit 0,1 M H₃PO₄ mindestens für 16 h, wenn neue Membranen verwendet werden.
   1. Bewahren Sie die Membranen zwischen den Durchläufen in Elektrolyten (0,1 M NaOH oder 0,1 M H₃PO₄) auf und lassen Sie sie nicht austrocknen.
2. Montieren Sie den inneren und äußeren Teil der Elektrode, indem Sie drei längs in den Ionenaustauschdichtungen ausrichten. Füllen Sie die Elektroden mit entsprechenden Elektrolyten (ca. 25-30 ml), um ein Austrocknen ihrer Membranen zu verhindern.
   1. Fügen Sie keinen überschüssigen Elektrolyten (mehr als 1/3^rd des Elektrodenkammervolumens) hinzu, der Druck innerhalb der Elektrode aufbauen und Leckagen verursachen kann.
3. Bedecken Sie die Probenentnahmeports mit Dichtungsband, das mit den Instrumentenbaugruppenteilen enthalten ist (siehe Tabelle der Materialien). Die Seite der Probenentnahmeanschlüsse kann durch die beiden vertikalen Metallausrichtungsstifte identifiziert werden. Alternativ können Sie Standard-Dichtungsband verwenden, um die Anschlüsse zu versiegeln.
4. Montieren Sie alle Teile der Fokussierkammerbaugruppe nacheinander (Anodenelektrode, Nylonmembrankern, Fokussierkammer und Kathodenelektrode) über den keramischen Kühlfinger.
5. Füllen Sie die Fokussierkammer mit vorgekühltem destilliertem Wasser (Gesamtvolumen von 60 ml für die Standard-IEF-Zelle) mit einer 50 ml Spritze.
6. Schließen Sie das Flüssigphasen-IEF-Instrument an ein zirkulierendes Kühlwasser bei 4 oC an und führen Sie das Gerät bei 15 W und 3.000 V für 3-5 min voroder bis sich die Spannung stabilisiert.
   HINWEIS: Im Allgemeinen erreicht die Spannung innerhalb einer Minute die maximalen solligen Werte. Das Vorlaufen mit destilliertem Wasser hilft, die Restionen aus der Fokussierkammer und dem Nylonmembrankern zu entfernen.
7. Schalten Sie die Stromquelle aus und entfernen Sie das Wasser aus der Zelle mit dem Fraktionskollektor. Versiegeln Sie die Sammelanschlüsse erneut mit Dichtband.
   HINWEIS: Jetzt ist das Instrument in Schritt 2.4 einsatzbereit.

2. Trennung und Reinigung von kleinen Molekülen und Peptiden aus Gymnema sylvestre Extrakt

1. 0,6 g Pflanzenextrakt messen und in destilliertem Wasser (60 ml) durch Mischen in einem Rollenrohr für 5 min auflösen.
   HINWEIS: Jede biologische Probe, die löslich und salzfrei ist, kann mit diesem IEF-Instrument zur Trennung und Reinigung verwendet werden. Proben mit puffernder Salzkonzentration bis zu 10 mM können mit leicht verringerter Auflösung verwendet werden. Wir interessieren uns für die Saponin-Familie von Triterpenoid-Verbindungen, die Gymnemsäuren, aus G. sylvestre Pflanze für ihre einzigartigen antimykotischen Eigenschaften¹⁶.
2. Zentrifugieren Sie den löslichen Pflanzenextrakt bei 10.000 x g für 5 min, um unlösliche Partikel zu entfernen.
3. Übertragen Sie den Überstand (ca. 60 ml) auf ein 80 ml Zentrifugenrohr und mischen Sie ihn mit 0,6 ml Ampholyt (pH 3-10) auf 1% (v/v).
4. Befolgen Sie die Schritte 1.1 – 1.7, um die Flüssigphasen-IEF-Einheit vorzubereiten. Die Kammer ist nun bereit, die Probe zu laden.
5. Verwenden Sie eine 50 ml Spritze mit einer 1-1/2 Zoll 19 G stumpfen Endnadel (kommt mit dem Instrument) und laden Sie die vorbereitete Probe mit Ampholyt (60 ml gesamt) in die Zelle durch Probenentnahmeports.
6. Entfernen Sie Luftblasen aus der Probenzelle, indem Sie die Fokussierzelle aus dem Ständer entfernen und auf die Elektrodenkammer tippen, um die Blasen zu lösen. Das Vorhandensein von Luftblasen wird Spannungs- und Stromschwankungen verursachen und den Lauf beeinflussen.
7. Schließen Sie das Gerät an das Wasserkühlmittel (4 °C) an und starten Sie die Fraktionierung mit dem Netzteil bei konstant 15 W.
8. Führen Sie das Gerät 3 h oder bis die Spannung einen konstanten Wert erreicht.
   HINWEIS: Wenn die Probe beginnt zu fokussieren, beginnt die Spannung allmählich zu klettern, bis sie einen konstanten Wert erreicht.
9. Nach dem Lauf bereiten Sie sich darauf vor, die mit der Vakuumpumpe verbundenen Fraktionen im Erntekasten (mit 20 Kunststoffrohren, 12 mm x 75 mm, 5-6 ml Volumen) zu sammeln, die mit der Vakuumpumpe verbunden sind, indem Sie den Ernteknopf EIN in der IEF-Einheit drücken.
10. Richten Sie die 20-Sammlungs-Pins an den 20-Sammlungs-Ports der Fokussierzelle aus, die mit dem Band versiegelt ist.
11. Drücken Sie die Sammelstifte durch das Dichtband und schalten Sie die Vakuumpumpe gleichzeitig ein (siehe Abbildung 2B, 2C & 2D).
    HINWEIS: Etwa 3 ml Fraktionen aus jeder Kammer werden für jedes Mal in die Rohre gesammelt. Fraktionen können für nachfolgende nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden (SDS-PAGE für Peptidquantifizierung, TLC und Bioassay für kleine Moleküle).

3. Trennung und Reinigung von Proteinen aus C. albicans

1. Einzelne Kolonie von C. Albicans in Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) Brühe¹⁶ bei 30 °C mit Schütteln (200 U/min) für die Nacht wachsen.
2. Sammeln Sie die Hefezellen durch Zentrifugation (10.000 x g für 5 min).
3. Hefezellen in Ammoniumcarbonat (1,89 g/L) mit einem Beta-Mercaptoethanol (1/10 des Kulturvolumens) in einem Walzenrohr um 1 h bei 5 °C¹⁵drehen.
4. Entfernen Sie die Hefezellen durch Zentrifugation (10.000 x g für 5 min) und filtern Sie den Proteinextrakt durch einen 0,45 m Filter.
   HINWEIS: Proteinproben aus C. albicans Cytosol, Membran oder Zellwand können für die IEF-Fraktionierung hergestellt und verwendet werden. Ebenso können Proteine aus Bakterien oder anderen biologischen Proben (Tiergewebeextrakt) nach Entfernung von Salz durch geeignete Methoden(z. B.durch Dialyse oder mit Entsalzungssäulen) verwendet werden.
5. Dialyse den Proteinextrakt in einem Dialyseschlauch (3.500 MWCO) gegen Wasser für 15 h bei 4 °C. Schätzen Sie die Proteinkonzentration nach der Bradford-Färbebindungsmethode unter Verwendung von Gammaglobulin als Standard¹⁷.
6. Verwenden Sie 500 mg Gesamtprotein in 60 ml Wasser, das 1% (v/v) Ampholyt (pH 5-8) für die Fraktionierung enthält.
   HINWEIS: Da ein Breitbereichs-Ampholyt (pH 3-10) bestimmte nicht glucan-gebundene Zellwandproteine von C. albicans nicht gut anreichert, verwenden Sie ein Engbereichs-Ampholyt (pH 5-8). Eine Ampholytkonzentration von bis zu 2% kann verwendet werden, wenn die Probenproteinkonzentration mehr als 2 mg/ml beträgt; Dies minimiert die Proteinaggregation während der Fokussierung. Bewahren Sie die Proben, Ampholyten und Wasser immer auf Eis auf.
7. Wiederholen Sie die Schritte 1.1- 1.7, um die IEF-Einheit vorzubereiten, und verwenden Sie die Proteinlösung ab Schritt 3.6, um sie in die IEF-Zelle zu laden.
8. Nach 4 h Fokussierung bei konstant 15 W, Ernten Sie Proteinfraktionen (1-20) wie oben beschrieben (Schritte 2.9-2.11) und analysieren Sie auf 12,5% SDS-PAGE nach Reduktion und Kochen der Proteinproben¹⁸.
9. Färben Sie die gelösten Proteine, indem Sie das SDS-PAGE-Gel mit dem Coomassie-Blaufarbstoff färben (0,01%) Lösung für 2-3 h bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Entzähen Sie das Gel und zeichnen Sie das Gelbild mit einem Gel-Imager auf.
   HINWEIS: Coomassie blauer Farbstoff (0,01%) kann durch Mischen von 0,01 g Coomassie-Blaupulver in einer entzähnten Lösung mit 40% Methanol und 10% Essigsäure hergestellt werden.

4. Bioaktivität von gereinigten kleinen Molekülen aus Pflanzenextrakt Gymnema sylvestre

1. Wachsen Sie C. albicans in Hefezellen wie in Schritt 3.1.
2. Zur Vorbereitung der Zellsuspension die Nachtkultur von C. albicans Hefezellen (1/1000 Verdünnung) in ein frisches RPMI-Zellkulturmedium, das mit 50 mM Glukose ergänzt wird.
   HINWEIS: C. Albicans wandelt von Hefewachstum zu Hyphen unter Hyphal-induzierenden Bedingungen um (RPMI bei 37 °C). Gymnemic Säure kleine Moleküle werden gezeigt, um die Umwandlung von Hefezellen in Hyphen unter Hypha induzierenden Bedingungen zu hemmen¹⁶. Wir wollten herausfinden, ob flüssigphasen-IEF-getrennte G. sylvestre Extrakt diese bioaktiven Moleküle enthalten.
3. Von der vorbereiteten Zellsuspension 90 l zu jedem Brunnen der 96-Well-Platte hinzufügen.
4. Aus jeder Fraktion (1-20 geerntete Fraktionen des G. sylvestre Extraktes aus flüssiger Phase IEF, Abbildung 4),fügen Sie 10 l in die Brunnen mit 90 l der oben genannten Zellsuspension (Schritt 4.2) hinzu. Führen Sie den Test in dreifacher Ausführung durch.
5. Fügen Sie 10 l Wasser hinzu, das Ampholyt enthält (1%) in separate Brunnen mit 90 l C. albicans Hefezellsuspension als Negativkontrolle.
   HINWEIS: Ampholyten haben Bioaktivitätspotenzial und daher ist es wichtig, eine Ampholyt-Kontrolle bei der Durchführung eines Bioassays¹⁹einzuschließen.
6. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei 37 °C für 12 h und beobachten Sie die Hemmung der C. albicans Hefe-zu-Hyphen-Umwandlung unter dem Mikroskop¹⁶. Bestimmen Sie auch den Prozentsatz der Hemmung der Hefe-zu-Hyphen-Umwandlung.

Ergebnisse

Trennung und Reinigung von kleinen Molekülen und Peptiden aus Gymnema sylvestre Pflanzenextrakt
Mit der präparativen Flüssigphase IEF-Methode fraktionierten wir medizinische Pflanzenextrakte und Zelloberflächenproteine aus einem menschlichen pathogenen Pilz, C. albicans. Ein Schaltplan dieser Fraktionierungsprotokolle ist in Abbildung 1dargestellt.

Aus 20 Fraktionen des G. sylvestre-Extrakts aus flüssiger Phase I...

Diskussion

Kleine Moleküle aus natürlichen Produktquellen (z. B. Pflanzen) umfassen komplexe sekundäre Metaboliten, die in der chemischen Struktur sehr unterschiedlich sind. Es wird angenommen, dass sie an Pflanzenabwehrmechanismen beteiligt sind. Darüber hinaus sind Polypeptide auch in Pflanzengeweben²²vorhanden. Diese natürlichen Produkt kleine Moleküle sind reiche Quellen von Testmolekülen für die Entdeckung und Entwicklung von Medikamenten. Die schwierigen und mühsamen Methoden, die für ihre Is...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Fisher scientfic	09-720-004
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	207861-500
Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	Bio-Rad	163-1113
Bio-Lyte 5/8 Ampholyte	Bio-Rad	163-1192
Compact low temperature thermostat	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B7920
Dialysis tubing (3,500 MWCO)	Spectrum Spectra/Por	132112T
Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids)	Suan Farma, NJ USA
Incubator	Lab companion	SI 300R
Microscope	Leica	DM 6B
Mini protean electrophoresis	Bio-Rad
pH meter	Mettler Toledo	S20	Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions
Rotofor	Bio-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)
RPMI-1640 Medium	HyClone	DH30255.01
Sealing tape	Bio-Rad	170-2960	Scotch tape may also be used.
Sorvall legend micro 17 centrifuge	Thermo scientific	75002432
TPP tissue culture plate -96 well flat bottom	TPP	TP92696