Separação de Pequenas Moléculas Bioativas, Peptídeos de Fontes Naturais e Proteínas de Micróbios pelo Método De Foco Isoelétrico Preparatório (IEF)

Resumo

O objetivo é fracionar e isolar pequenas moléculas bioativas, peptídeos de um complexo extrato vegetal e proteínas de micróbios patogênicos, empregando o método de focalização isoelétrica de fase líquida (IEF). Além disso, as moléculas separadas foram identificadas e sua bioatividade confirmada.

Resumo

Produtos naturais derivados de plantas e micróbios são uma rica fonte de moléculas bioativas. Antes de seu uso, as moléculas ativas de extratos complexos devem ser purificadas para aplicações a jusante. Existem vários métodos cromatográficos disponíveis para este fim, mas nem todos os laboratórios podem pagar métodos de alto desempenho e o isolamento de amostras biológicas complexas pode ser difícil. Aqui demonstramos que o foco isoelétrico de fase líquida (IEF) pode separar moléculas, incluindo pequenas moléculas e peptídeos de extratos de plantas complexas, com base em seus pontos isoelétricos (iI). Utilizamos o método para fracionamento e caracterização de amostras biológicas complexas. Como prova de conceito, fracionamos um extrato de planta gymnema sylvestre, isolando uma família de pequenas moléculas terpenoides de sapono e um peptídeo. Também demonstramos uma separação eficaz de proteína microbiana usando o fungo Candida albicans como um sistema modelo.

Introdução

A purificação de biomoléculas a partir de amostras biológicas complexas é um passo essencial e muitas vezes difícil em experimentos biológicos¹. O foco isoelétrico (IEF) é adequado para a separação em alta resolução de biomoléculas complexas onde os amfolitos portadores viajam de acordo com sua carga e estabelecem o gradiente de pH em um campo elétrico³. O primeiro ampholyte de transportadora comercial para IEF foi desenvolvido por Olof Vesterberg em 1964 e patenteado^4,5. Os amfolitos portadores são moléculas de ácido oligo-carboxílico alifático de comprimento e ramificação⁶. Posteriormente, Vesterberg e outros melhoraram os amóglifos portadores para seu uso expandido na separação de biomoléculas^6,7.

Os métodos para separar as biomoléculas incluem eletroforese de gel de agarose e poliacrilamida, eletroforese de gel bidimensional (2-DE), foco isoelétrico, eletroforese capilar, isotacoforese e outras técnicas cromatográficas (por exemplo, TLC, FPLC, HPLC)². O IEF de fase líquida realizado em um instrumento chamado "Rotofor" foi inventado por Milan Bier⁸. Ele foi pioneiro no conceito e design deste instrumento e contribuiu extensivamente para a teoria da migração eletroforética. Sua equipe também desenvolveu um modelo matemático de processo de separação eletroforética para simulações computacional⁹.

O aparelho IEF de fase líquida é uma célula cilíndrica rotativa horizontal, consistindo de um núcleo de nylon dividido em 20 compartimentos porosos e uma haste de cerâmica de resfriamento de água circulante. As câmaras porosas permitem que as moléculas migrem através da fase aquosa entre os eletrodos e permitem a coleta de amostras purificadas sob vácuo em frações. Este sistema de purificação pode fornecer até 1000 vezes a purificação de uma molécula específica em <4 horas. Uma característica valiosa deste instrumento é que ele pode ser aplicado como um primeiro passo para purificação a partir de uma mistura complexa ou como um passo final para alcançar a pureza¹⁰. Se a molécula de interesse é uma proteína, outra vantagem é que sua conformação nativa será mantida durante a separação.

O uso de IEF de fase líquida tem sido amplamente relatado para proteínas, enzimas e purificação de anticorpos^{6,10,11,12,13,14}. Aqui descrevemos o uso dessa abordagem para separar e purificar pequenas moléculas e peptídeos da planta medicinal Gymnema sylvestre. Este protocolo ajudará os pesquisadores a concentrar e purificar pequenas moléculas ativas de um extrato vegetal para aplicações a jusante a baixo custo. Além disso, também demonstramos que o enriquecimento de proteínas de um complexo extrato de proteína do fungo Candida albicans ¹⁵ neste sistema baseado em IEF como segundo exemplo.

Protocolo

1. Configuração e pré-ressarificação da unidade IEF de fase líquida padrão

1. Monte os eletrodos IEF de fase líquida (botão vermelho-ânodo e botão cathode-preto) com suas respectivas membranas de troca de acordo com o manual de instruções (ver Tabela de Materiais). Equilibre as membranas de troca de ânion com 0,1 M NaOH e as membranas de troca de cáção com 0,1 M H₃PO₄ pelo menos por 16 h quando novas membranas são usadas.
   1. Armazene as membranas em eletrólitos (0,1 M NaOH ou 0,1 M H₃PO₄) entre as corridas e não deixe secar.
2. Monte a porção interna e externa do eletrodo alinhando três orifícios oblongos nas juntas de troca de íons. Encha os eletrodos com os respectivos eletrólitos (~25-30 mL) para evitar que suas membranas sequem.
   1. Não adicione excesso (mais de 1/3^de volume de câmara de eletrodos) eletrólitos que possam aumentar a pressão dentro do eletrodo e causar vazamento.
3. Cubra as portas de coleta de amostras com fita de vedação que vem com as peças de montagem do instrumento (ver Tabela de Materiais). O lado das portas de coleta de amostras pode ser identificado pelos dois pinos de alinhamento metálico vertical. Alternativamente, use fita de vedação padrão para selar as portas.
4. Monte todas as partes do conjunto da câmara focal em sequência (eletrodo de ânodo, núcleo de membrana de nylon, câmara de foco e eletrodo de cátodo) sobre o dedo de resfriamento cerâmico.
5. Encha a câmara de foco com água destilada pré-identificada (volume total de 60 mL para a célula IEF padrão) usando uma seringa de 50 mL.
6. Conecte o instrumento IEF de fase líquida a uma água de resfriamento circulante a 4 ºC e pré-run a unidade a 15 W e 3.000 V por 3-5 min ou até que a tensão estabilize.
   NOTA: Geralmente, dentro de um minuto, a tensão atingirá os valores máximos definidos. A pré-corrida com água destilada ajuda a remover os íons residuais da câmara de foco e do núcleo da membrana de nylon.
7. Desligue a fonte de energia e remova a água da célula usando o coletor de frações. Selar as portas de coleta com fita de vedação.
   NOTA: Agora o instrumento está pronto para uso na etapa 2.4.

2. Separação e purificação de pequenas moléculas e peptídeos do extrato de Gymnema sylvestre

1. Meça 0,6 g de extrato vegetal e dissolva em água destilada (60 mL) misturando-se em um tubo de rolo por 5 min.
   NOTA: Qualquer amostra biológica solúvel e livre de sal pode ser usada para separação e purificação usando este instrumento IEF. Podem ser utilizadas amostras com concentração de sal tampão de até 10 mM com resolução ligeiramente reduzida. Estamos interessados na família saponina de compostos triterpenóides, os ácidos gymnémicos, da planta G. sylvestre para suas propriedades antifúngicas únicas¹⁶.
2. Centrifugar o extrato da planta solubilizada a 10.000 x g por 5 minutos para remover partículas insolúveis.
3. Transfira o supernatante (~60 mL) para um tubo de centrífuga de 80 mL e misture-o com 0,6 mL de amfolito (pH 3-10) a 1% (v/v).
4. Siga as etapas 1.1 – 1.7 para preparar a unidade IEF de fase líquida. A câmara está pronta para carregar a amostra.
5. Use uma seringa de 50 mL com uma agulha final de 1-1/2 polegada 19 G (vem com o instrumento) e carregue a amostra preparada com amfolito (total de 60 mL) na célula através de portas de coleta.
6. Remova bolhas de ar da célula amostra, removendo a célula focal do suporte e tocando na câmara de eletrodos para desalojar as bolhas. A presença de bolhas de ar causará flutuações de tensão e corrente e afetará a corrida.
7. Conecte a unidade ao refrigerante de água (4 °C) e inicie o fracionamento com a fonte de alimentação a uma constante de 15 W.
8. Execute o aparelho por 3h ou até que a tensão atinja um valor constante.
   NOTA: À medida que a amostra começa a se concentrar, a tensão começará a subir gradualmente até atingir um valor constante.
9. Após a execução, prepare-se para coletar as frações na caixa de colheita (contendo 20 tubos plásticos, 12 mm x 75 mm, 5-6 mL de volume) conectados à bomba de vácuo pressionando o botão de colheita ON na unidade IEF.
10. Alinhe os pinos de 20 coleções com as portas de 20 coleções da célula focal que está lacrada com a fita.
11. Empurre os pinos de coleta através da fita de vedação e gire a bomba de vácuo ON simultaneamente (ver Figura 2B, 2C & 2D).
    NOTA: Cerca de 3 mL frações de cada câmara serão coletadas nos tubos para cada vez. Frações podem ser usadas para aplicações a jusante subsequentes (SDS-PAGE para quantificação de peptídeos, TLC e bioensaio para pequenas moléculas).

3. Separação e purificação de proteínas de C. albicans

1. Cresça colônia única de C. albicans em levedura-peptone-dextrose (YPD) caldo¹⁶ a 30 °C com agitação (200 rpm) durante a noite.
2. Coletar as células de levedura por centrifugação (10.000 x g por 5 min).
3. Suspender as células de levedura C. albicans em carbonato de amônio (1,89 g/L) tampão contendo 1% (v/v) beta-mercaptoethanol (β-ME) (1/10º do volume cultural) e girar em um tubo de rolo por 1 h a 5 °C¹⁵.
4. Remova as células de levedura por centrifugação (10.000 x g por 5 min) e filtre o extrato de proteína através de um filtro de 0,45 μm.
   NOTA: Amostras de proteínas de C. albicans cytosol, membrana ou parede celular podem ser preparadas e usadas para fracionamento de IEF. Da mesma forma, proteínas de bactérias ou outras amostras biológicas (extrato de tecido animal) podem ser usadas após a remoção de qualquer sal por métodos apropriados ( porexemplo,por diálise ou usando colunas de desalização).
5. Dique o extrato de proteína em um tubo de diálise (3.500 MWCO) contra a água por 15 h a 4 °C. Estime a concentração proteica pelo método de ligação de corante de Bradford usando globulina gama como padrão¹⁷.
6. Use 500 mg de proteína total em 60 mL de água contendo 1% (v/v) ampholyto (pH 5-8) para o fracionamento.
   NOTA: Uma vez que um amfolito de larga alcance (pH 3-10) não enriquece certas proteínas de parede celular não-glucanas de C. albicans bem, use um amfolito de alcance estreito (pH 5-8). Uma concentração de amfolitos de até 2% pode ser usada se a concentração de proteínas amostrais for superior a 2 mg/mL; isso minimiza a agregação de proteínas durante o foco. Mantenha sempre as amostras, amólitos e água pré-cozido no gelo.
7. Repita os passos 1.1- 1.7 para preparar a unidade IEF e use a solução proteica da etapa 3.6 para carregar na célula IEF.
8. Após 4h de foco em 15 W constantes, colher frações de proteína (1-20) conforme descrito acima (etapas 2,9-2,11) e analisar em 12,5% SDS-PAGE após reduzir e ferver as amostras de proteína¹⁸.
9. Manche as proteínas resolvidas manchando o gel SDS-PAGE com o corante azul Coomassie (0,01%) solução para 2-3 h à temperatura ambiente em um roqueiro. Destain o gel e gravar a imagem em gel usando um imager gel.
   NOTA: Corante azul coomassie (0,01%) pode ser preparado misturando 0,01 g de pó azul Coomassie em uma solução desestabilizadora contendo 40% de metanol e 10% ácido acético.

4. Bioatividade de pequenas moléculas purificadas do extrato vegetal Gymnema sylvestre

1. Cresça C. albicans em células de levedura como na etapa 3.1.
2. Para preparar a suspensão celular, diluir a cultura noturna das células de levedura de C. albicans (diluição de 1/1000) em um meio de cultura celular RPMI fresco complementado com 50 mM de glicose.
   NOTA: C. albicans converte do crescimento da levedura em hifa sob condições de indução de hifa (RPMI a 37 °C). Pequenas moléculas de ácido gymnêmico são mostradas para inibir a conversão de células de levedura em hifas sob condições indutoras de higiais¹⁶. Nosso objetivo era determinar se o extrato G. sylvestre separado por fase líquida-IEF contém essas moléculas bioativas.
3. Da suspensão celular preparada, adicione 90 μL a cada poço da placa de 96 poços.
4. A partir de cada fração (1-20 frações colhidas de extrato g. sylvestre obtidos a partir de IEF de fase líquida, Figura 4), adicione 10 μL nos poços com 90 μL da suspensão celular acima (etapa 4.2). Realize o ensaio em triplicado.
5. Adicione 10 μL de água que contenha amfolito (1%) em poços separados com 90 μL de suspensão de células de levedura C. albicans como um controle negativo.
   NOTA: Os ampholytes têm potencial de bioatividade e, por isso, é essencial incluir um controle de amólise durante a realização de qualquer bioensaio¹⁹.
6. Incubar a placa de 96-well a 37 °C por 12 h e observar a inibição da conversão de leveduras de C. albicans sob o microscópio¹⁶. Além disso, determine a porcentagem de inibição da conversão de levedura para hifa.

Resultados

Separação e purificação de pequenas moléculas e peptídeos do extrato vegetal de Gymnema sylvestre
Usando o método de IEF de fase líquida preparatória, fracionamos extratos de plantas medicinais e proteínas da superfície celular de um fungo patogênico humano, C. albicans. Um esquema desses protocolos de fracionamento é mostrado na Figura 1.

A partir de 20 frações de extrato g. sylvestre obtidos a partir ...

Discussão

Pequenas moléculas de fontes de produtos naturais (por exemplo, plantas) incluem metabólitos secundários complexos que são altamente diversos em estrutura química. Acredita-se que estejam envolvidos em mecanismos de defesa de plantas. Além disso, os polipeptídeos também estão presentes nos tecidos vegetais²². Essas pequenas moléculas de produtos naturais são fontes ricas de moléculas de teste para descoberta e desenvolvimento de drogas. No entanto, os métodos difíceis e tediosos nece...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Fisher scientfic	09-720-004
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	207861-500
Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	Bio-Rad	163-1113
Bio-Lyte 5/8 Ampholyte	Bio-Rad	163-1192
Compact low temperature thermostat	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B7920
Dialysis tubing (3,500 MWCO)	Spectrum Spectra/Por	132112T
Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids)	Suan Farma, NJ USA
Incubator	Lab companion	SI 300R
Microscope	Leica	DM 6B
Mini protean electrophoresis	Bio-Rad
pH meter	Mettler Toledo	S20	Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions
Rotofor	Bio-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)
RPMI-1640 Medium	HyClone	DH30255.01
Sealing tape	Bio-Rad	170-2960	Scotch tape may also be used.
Sorvall legend micro 17 centrifuge	Thermo scientific	75002432
TPP tissue culture plate -96 well flat bottom	TPP	TP92696