הפרדת מולקולות ביו-אקטיביות קטנות, פפטידים ממקורות טבעיים וחלבונים מחיידקים על ידי שיטת התמקדות איזואלקטריים

Summary

המטרה היא לאנגיופלסטיקה ולבודד אקטיביים מולקולות קטנות, פפטידים מתוך תמצית צמח מורכב, חלבונים של חיידקים פתוגניים על ידי שימוש בשיטת מיקוד בשלב נוזלי (הארה ב) שיטה. יתרה מזאת, המולקולות המופרדות זוהו ופעילותם הביוביולוגית אושרה.

Abstract

מוצרים טבעיים הנגזרים מצמחים ומחיידקים הם מקור עשיר של מולקולות אקטיביים. לפני השימוש שלהם, המולקולות הפעילים מתמציות מורכבות חייבים להיות מטוהרים עבור יישומים במורד הזרם. יש שיטות כרומטוגרפיות שונות זמין למטרה זו עדיין לא כל המעבדות יכול להרשות לעצמם שיטות ביצועים גבוהים בידוד מדגימות ביולוגיות מורכבות יכול להיות קשה. כאן אנו מדגימים כי הסדר שלב נוזלי איזואלקטרי התמקדות (הפנים) יכול להפריד מולקולות, כולל מולקולות קטנות פפטידים מפני תמציות צמחים מורכבים, מבוסס על נקודות איזואלקטריים שלהם (pI). השתמשנו בשיטה לקבלת משבר ואפיון ביולוגיים מורכבים. כהוכחה של המושג, אנחנו מצאנו את הצמח מתחת לתמצית צמחים בבידוד, בידוד משפחה של טרפנאיד סאפונין מולקולות קטנות פפטיד. כמו כן הדגמנו הפרדת חלבון מחיידקים יעילים באמצעות פטרייה אלביקנס פטריה כמערכת מודל.

Introduction

טיהור הbiomolecules מדגימות ביולוגיות מורכבות הוא צעד חיוני וקשה לעתים קרובות בניסויים ביולוגיים¹. איזואלקטריים התמקדות (הארה ב) הוא מתאים הפרדה ברזולוציה גבוהה של biomolecules מורכבים שבו המוביל ampholytes לנסוע לפי הטעינה שלהם ולהקים את הדרגתי pH בשדה חשמלי³. המוביל המסחרי הראשון של חברת הקולנוע הארצי פותח על ידי אושל וסטברג בשנת 1964 וכפטנט^4,5. אמולוציטים המוביל הם אליפטיות oligo-אמינו oligo-carboxylic חומצה מולקולות באורך משתנה ומסעף⁶. לאחר מכן, בוסטברג ואחרים שיפרו את המוביל אמולוציטים לשימוש המורחב שלהם בהפרדת biomolecules^6,7.

שיטות להפרדת הbiomolecules כוללות אגקם ו פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה, אלקטרופורזה דו מימדית ג'ל (2-DE), איזואלקטריים התמקדות, אלקטרופורזה קפילר, isotaקוזוהורזיס וטכניקות כרומטוגרפיים אחרים (למשל, ועוד, FPLC, כרומטוגרפיה)². במהלך האירוע הומצא הארגון הבינלאומי של מילאנו ביר⁸בכלי שנקרא "Rotofor". הוא ייסד את הקונספט והעיצוב של המכשיר הזה ותרם רבות לתיאוריית ההגירה האלקטרופיניטית. הצוות שלו פיתח גם מודל מתמטי של תהליך הפרדה אלקטרופלסטי לסימולציות מחשב⁹.

המנגנון הנוזלי הינו מנגנון מסתובב אופקית המורכב מליבת ניילון מחולק ל -20 תאים נקבובי ומים מחזורי קירור המים מוט קרמיקה. התאים הנקבובי מאפשרים למולקולות להגר דרך השלב המים בין האלקטרודות וההיתר לאיסוף דגימות מטוהרים תחת ואקום בשברים. מערכת טיהור זו יכולה לספק עד 1000 לטיהור מתקפל של מולקולה מסוימת ב-< 4 שעות. תכונה רבת ערך של מכשיר זה היא שניתן להחילם כצעד ראשון לטיהור מתערובת מורכבת או כצעד אחרון להשגת הטוהר¹⁰. אם מולקולת העניין היא חלבון, יתרון נוסף הוא שהמערך הטבעי שלו יישמר במהלך ההפרדה.

השימוש בשלב הנוזלי הינו דיווח נרחב עבור חלבונים, אנזימים וטיהור נוגדנים^{6,10,11,12,13,14}. כאן נתאר את השימוש בגישה זו להפרדת וטיהור מולקולות קטנות ופפטידים מצמח המרפא ג'ימנמה. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים להתרכז ולטהר מולקולות קטנות פעילות מתוך תמצית צמחים עבור יישומים במטה בעלות נמוכה. בנוסף, אנו גם להדגים כי העשרה של חלבונים מתמצית חלבון מורכב מפטרייה אלביקנס פטריה¹⁵ במערכת זו מבוססת-החוץ כדוגמה השנייה.

Protocol

1. התקנה והקמה מראש של היחידה הסטנדרטית של התוכנית הראשונה.

1. הכנס את ה-gmp בשלב הנוזלי (כפתור הכפתור האדום וכפתור שחור-קתודה) עם ממברנות החליפין המתאימים שלהם לפי הוראות ההדרכה (ראה טבלת חומרים). באמצעות שימוש בממברנות ממברנות עם 0.1 M NaOH ו ממברנות הקטיון עם 0.1 M H₃פו₄ לפחות 16 H כאשר ממברנות חדשים משמשים.
   1. לאחסן את הממברנות אלקטרוליטים (0.1 M NaOH או 0.1 M H₃PO₄) בין רץ ואל תאפשר להתייבש.
2. הכנס את החלק הפנימי והחיצוני של האלקטרודה על ידי יישור שלושה חורים מלבני ב אטמים להחלפת יונים. למלא את האלקטרודות עם אלקטרוליטים בהתאמה (~ 25-30 mL) כדי למנוע את הקרומים שלהם מייבוש.
   1. אין להוסיף עודף (יותר מ 1/3^rd של נפח התא אלקטרודה) אלקטרוליט שעשוי לבנות לחץ בתוך האלקטרודה ולגרום דליפה.
3. כסה את יציאות אוסף הדגימות עם סרט איטום המגיע עם חלקי ההרכבה של המכשיר (ראה טבלת חומרים). בצד יציאות האוסף לדוגמה ניתן לזהות על ידי שני מתכת אנכית יישור פינים. לחלופין, השתמש בסרט איטום רגיל כדי לאטום את היציאות.
4. להרכיב את כל החלקים של ההרכבה קאמרית התמקדות ברצף (אלקטרודה אנאודה, ליבת קרום ניילון, התמקדות החדר והאלקטרודה הקתודה) על האצבע קירור קרמי.
5. ממלאים את החדר המתמקד עם מים מזוקקים מראש (נפח כולל של 60 mL עבור תא ה-it רגיל) באמצעות מזרק 50 mL.
6. חברו את המכשיר הנוזלי למים מצוננים ב -4 º C וה, המוקלטות את היחידה בשעה 15 ואט ו-3,000 V עבור 3-5 דקות או עד למייצאת המתח.
   הערה: בדרך כלל, בתוך דקה אחת, המתח יגיע לערכי הערכה המרביים. מוקלטות עם מים מזוקקים מסייע להסיר את היונים שיורית מן התא התמקדות ליבת קרום ניילון.
7. כבה את מקור החשמל והסר את המים מתא באמצעות אספן השברים. חתום מחדש את יציאות האוסף באמצעות נייר איטום.
   הערה: כעת המכשיר מוכן לשימוש בשלב 2.4.

2. הפרדה וטיהור של מולקולות קטנות ופפטידים מ- ג'ימנמה לחלץ

1. מדידת 0.6 g של תמצית צמח ולפזר מים מזוקקים (60 mL) על ידי ערבוב בצינור רולר עבור 5 דקות.
   הערה: ניתן להשתמש בכל דוגמה ביולוגית שהיא מסיסה ונטולת מלח, לצורך הפרדה וטיהור באמצעות כלי זה. דגימות עם אגירה הריכוז מלח עד 10 מ"מ יכול לשמש עם רזולוציה מעט ירד. אנו מעוניינים סאפונין משפחה של תרכובות triterpenoid, חומצות ג'ימנמיק, מ -G. סילברה צמח עבור שלהם תכונות פטריות ייחודי¹⁶.
2. צנטריפוגה את תמצית צמח מסיסות ב 10,000 x g עבור 5 דקות כדי להסיר חלקיקים מסיסים.
3. העבר את סופרנטנט (~ 60 mL) לצינור צנטריפוגה של 80 mL, ותערבב אותו עם 0.6 mL של ampholyte ייט (pH 3-10) עד 1% (v/v).
4. בצע את השלבים 1.1 – 1.7 להכנת יחידת האנטי-ובפאזה הנוזלית. . החדר מוכן כעת לטעון את הדגימה
5. השתמש מזרק 50 mL עם 1-1/2 אינץ ' בעובי 19 G בוטה המחט (מגיע עם המכשיר) ולטעון את המדגם מוכן עם ampholyte ייט (60 mL סך) בתא באמצעות יציאות אוסף לדוגמה.
6. להסיר בועות אוויר מתא לדוגמה על ידי הסרת תא מיקוד ממעמד והקשה על תא אלקטרודה לסלק את הבועות. הנוכחות של בועות אוויר יגרום תנודות מתח הנוכחי ולהשפיע על הריצה.
7. חבר את היחידה למערכת קירור המים (4 ° c) והתחל במהומה עם ספק הכוח בקבוע של 15 ואט.
8. הפעל את המנגנון במשך 3 שעות או עד שהמתח יגיע לערך קבוע.
   הערה: כשהמדגם מתחיל להתמקד, המתח יתחיל לטפס בהדרגה עד שיגיע לערך קבוע.
9. לאחר הריצה, להכין לאסוף את השברים בתיבת הקציר (המכיל 20 שפופרות פלסטיק, 12 מ"מ x 75 מ"מ, 5-6 mL נפח) מחובר משאבת ואקום על ידי לחיצה על כפתור הקציר על היחידה הבין-משנית.
10. יישר את הפינים של 20 האוספים עם יציאות 20 הגבייה של התא המתמקד החתום באמצעות הקלטת.
11. דחפו את הפינים של האוסף דרך סרט האיטום והפוך את משאבת הוואקום בו (ראה איור 2ב', 2c & 2c).
    הערה: כ-3 שברים mL מכל חדר ייאספו לתוך הצינורות בכל פעם. שברים ניתן להשתמש ליישומים הבאים במורד הזרם (SDS-עמוד עבור כימות פפטיד, ו-וביולוגית עבור מולקולות קטנות).

3. הפרדה וטיהור של חלבונים מ -C. אלביקנס

1. לצמוח מושבה אחת של C. אלביקנס ב שמרים-peptone-דקסטרוז (YPD) ציר¹⁶ ב 30 ° צ' עם טלטול (200 rpm) עבור לילה.
2. לאסוף את התאים שמרים על ידי צנטריפוגה (10,000 x g עבור 5 דקות).
3. השעיה C. אלביקנס שמרים תאים אמוניום פחמתי (1.89 g/L) מאגר המכיל 1% (v/v) בטא-mercaptoethanol (β-ME) (1/10 של נפח התרבות) ולסובב צינור רולר עבור 1 h ב 5 ° c¹⁵.
4. להסיר את התאים שמרים על ידי צנטריפוגה (10,000 x g עבור 5 דקות) ולסנן את תמצית חלבון דרך מסנן 0.45 יקרומטר.
   הערה: דגימות חלבון מ -C. אלביקנס ציטוסול, ממברנה או קיר תא ניתן להכין ולהשתמש בהם עבור שבירה של האו. כמו-כן, ניתן להשתמש בחלבונים מחיידקים או בדגימות ביולוגיות אחרות (תמצית רקמת בעלי חיים) לאחר הסרת כל מלח בשיטות המתאימות (לדוגמה, באמצעות דיאליזה או שימוש בעמודות התפלה).
5. Dialyze תמצית חלבון בצינורות דיאליזה (3,500 MWCO) נגד מים עבור 15 h ב 4 ° c. מעריכים את ריכוז החלבון על ידי שיטת ברדפורד לצבוע באמצעות גמא גלובולין כסטנדרט¹⁷.
6. השתמש 500 mg של חלבון מוחלט ב 60 mL של מים המכילים 1% (v/v) ampholyte (pH 5-8) עבור המהומה.
   הערה: כיוון שהמפולציט רחב (pH 3-10) אינו מעשיר מסוימים שאינם ניתנים לשימוש בחלבונים בקיר התאים של C. אלביקנס ובכן, להשתמש בטווח הצר (pH 5-8) ampholyte. ניתן להשתמש בריכוז אמולוציט של עד 2% אם ריכוז החלבון לדוגמה הוא יותר מ-2 מ"ג/mL; זה ממזער את צבירת החלבון במהלך ההתמקדות. , תמיד שומרים את הדגימות, אמפיולוציטים. ומים מקורר בקרח
7. חזור על שלבים 1.1-1.7 כדי להכין את יחידת האנטי-ולהשתמש בפתרון החלבון משלב 3.6 כדי להיטען לתוך תא ה-הארה.
8. לאחר 4 h של התמקדות בקבוע 15 W, הקציר שברים חלבון (1-20) כמתואר לעיל (שלבים 2.9-2.11) ולנתח ב 12.5% SDS-עמוד לאחר הפחתת והרתיחה דגימות חלבון¹⁸.
9. להכתים את החלבונים שנפתרו על ידי צביעת ה-SDS-עמוד ג'ל עם הצבע הכחול של Coomassie (0.01%) פתרון עבור 2-3 h בטמפרטורת החדר על הנדנדה. להכתים את הג ולהקליט את התמונה ג'ל באמצעות ג'ל האנג'ר.
   הערה: צבע כחול Coomassie (0.01%) יכול להיות מוכן על ידי ערבוב 0.01 גרם של אבקת כחול Coomassie בפתרון מכתים המכיל 40% מתנול ו-10% חומצה אצטית.

4. ביואקטיביות של מולקולות קטנות מטוהרים מתמצית צמחים ג'ימנמה

1. לגדול C. אלביקנס בתאי שמרים כמו בשלב 3.1.
2. כדי להכין את ההשעיה התא, לדלל את התרבות הלילה של C. אלביקנס תאים שמרים (1/1000 דילול) לתוך מדיום טרי RPMI התרבות החדשה שיושלם עם 50 mM גלוקוז.
   הערה: C. אלביקנס ממיר מגידול שמרים ללקורבן בתנאים הגורם לגרימת מיקוף (RPMI בשעה 37 ° c). חומצה ג'ימנימיק מולקולות קטנות מוצגות כדי לעכב את ההמרה של תאים שמרים לתוך לקורבן תחת hypha גרימת תנאים¹⁶. כיוונו לקבוע אם לחלץ G. סילבסטרה מופרדים בשלב אחד, מכילים מולקולות ביואקטיביות אלה.
3. מתוך ההשעיה התא המוכן, להוסיף 90 μL לכל טוב של הצלחת 96-באר.
4. מכל שבריר (1-20 שברי שברים של G. סילבסטרה לחלץ התקבל מ-בשלב נוזלי, איור 4), להוסיף 10 μl לתוך בארות עם 90 μl של השעיית התא לעיל (שלב 4.2). בצע את השיטת הביצוע בטרילקאט.
5. הוסף 10 μL של מים המכילים אמפיולוציט (1%) לתוך בארות נפרדות עם 90 μl של C. אלביקנס השעיית תא שמרים כפקד שלילי.
   הערה: לאמפיולוציטים יש פוטנציאל לפעילות ביולוגית ולכן חיוני לכלול בקרת אמולוציט תוך ביצוע כל בקרה ביולוגית¹⁹.
6. מודקת את הצלחת 96-באר ב 37 ° צ' עבור 12 h ולהתבונן עיכוב של C. אלביקנס שמרים-to-hypha המרה מתחת למיקרוסקופ¹⁶. כמו כן, לקבוע את אחוז העיכוב של ההמרה שמרים ל-hypha.

תוצאות

הפרדה וטיהור של מולקולות קטנות פפטידים מ ג'ימנמה הצמח תמצית
באמצעות השיטה הביתטיבית לטיפול בשיטת האנטי-וולטאי, היינו משלבים תמציות של צמחי מרפא וחלבונים מפני השטח מפטרייה בתוך הגוף האנושי, C. אלביקנס. תרשים שרטוט של פרוטוקולי שבירה אלה מוצג באיור 1.

Discussion

מולקולות קטנות ממקורות המוצר הטבעי (למשל, צמחים) כוללים מטבוליטים מורכבים מאוד מגוונים מאוד במבנה כימי. הם מאמינים כי הם מעורבים במנגנוני ההגנה של הצמח. בנוסף, פוליפפטידים נמצאים גם ברקמות הצמח²². המוצר הטבעי הזה מולקולות קטנות הם מקורות עשירים של מולקולות בדיקה לגילוי סמים ופ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Fisher scientfic	09-720-004
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	207861-500
Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	Bio-Rad	163-1113
Bio-Lyte 5/8 Ampholyte	Bio-Rad	163-1192
Compact low temperature thermostat	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B7920
Dialysis tubing (3,500 MWCO)	Spectrum Spectra/Por	132112T
Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids)	Suan Farma, NJ USA
Incubator	Lab companion	SI 300R
Microscope	Leica	DM 6B
Mini protean electrophoresis	Bio-Rad
pH meter	Mettler Toledo	S20	Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions
Rotofor	Bio-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)
RPMI-1640 Medium	HyClone	DH30255.01
Sealing tape	Bio-Rad	170-2960	Scotch tape may also be used.
Sorvall legend micro 17 centrifuge	Thermo scientific	75002432
TPP tissue culture plate -96 well flat bottom	TPP	TP92696