Séparation des petites molécules bioactives, peptides des sources naturelles et des protéines des microbes par la méthode de mise au point isoélectrique préparative (IEF)

Résumé

L’objectif est de fractionner et d’isoler les petites molécules bioactives, les peptides d’un extrait de plante complexe et les protéines de microbes pathogènes en utilisant la méthode de mise au point isoélectrique (IEF) en phase liquide. En outre, les molécules séparées ont été identifiées et leur bioactivité confirmée.

Résumé

Les produits naturels dérivés des plantes et des microbes sont une riche source de molécules bioactives. Avant leur utilisation, les molécules actives provenant d’extraits complexes doivent être purifiées pour des applications en aval. Il existe diverses méthodes chromatographiques disponibles à cette fin, mais tous les laboratoires ne peuvent pas se permettre des méthodes de haute performance et l’isolement des échantillons biologiques complexes peut être difficile. Nous démontrons ici que la mise au point isoélectrique en phase liquide préparative (IEF) peut séparer les molécules, y compris les petites molécules et les peptides à partir d’extraits de plantes complexes, en fonction de leurs points isoélectriques (pI). Nous avons utilisé la méthode pour la fractionnement et la caractérisation des échantillons biologiques complexes. Comme preuve de concept, nous avons fractionné un extrait de plante gymnema sylvestre, isolant une famille de petites molécules de saponine terpénoïde et un peptide. Nous avons également démontré une séparation efficace des protéines microbiennes en utilisant le champignon Candida albicans comme système modèle.

Introduction

La purification des biomolécules à partir d’échantillons biologiques complexes est une étape essentielle et souvent difficile dans les expériences biologiques¹. La mise au point isoélectrique (IEF) convient bien à la séparation à haute résolution des biomolécules complexes où les ampholytes de transport voyagent selon leur charge et établissent le gradient de pH dans un champ électrique³. Le premier amphlyte de transporteur commercial pour IEF a été développé par Olof Vesterberg en 1964 et breveté^4,5. Les amplyantes porteuses sont des molécules d’acide oligo-carboxylique oligo-amino aliphatique de longueur variable et de branchement⁶. Par la suite, Vesterberg et d’autres ont amélioré les ampholytes de support pour leur utilisation accrue dans la séparation des biomolécules^6,7.

Les méthodes de séparation des biomolécules comprennent l’électrophorèse de gel d’agarose et de polyacrylamide, l’électrophorèse bidimensionnelle de gel (2-DE), la mise au point isoélectrique, l’électrophorèse capillaire, l’énoachhoresis et d’autres techniques chromatographiques (par exemple, TLC, FPLC, HPLC)². La phase liquide IEF réalisée dans un instrument appelé « Rotofor » a été inventé par Milan Bier⁸. Il a été le pionnier du concept et de la conception de cet instrument et a largement contribué à la théorie de la migration électrophorétique. Son équipe a également développé un modèle mathématique de processus de séparation électrophorétique pour les simulations informatiques⁹.

L’appareil IEF de phase liquide est une cellule cylindrique à rotation horizontale composée d’un noyau de nylon divisé en 20 compartiments poreux et d’une tige en céramique de refroidissement de l’eau circulante. Les chambres poreuses permettent aux molécules de migrer à travers la phase aqueuse entre les électrodes et permettent la collecte d’échantillons purifiés sous vide en fractions. Ce système de purification peut fournir jusqu’à 1000 fois la purification d’une molécule spécifique en <4 heures. Une caractéristique précieuse de cet instrument est qu’il peut être appliqué comme une première étape pour la purification à partir d’un mélange complexe ou comme une dernière étape pour atteindre la pureté¹⁰. Si la molécule d’intérêt est une protéine, un autre avantage est que sa conformation native sera maintenue pendant la séparation.

L’utilisation de la phase liquide IEF a été largement rapportée pour les protéines, les enzymes et la purification des anticorps^{6,10,11,12,13,14}. Ici, nous décrivons l’utilisation de cette approche pour séparer et purifier les petites molécules et peptides de la plante médicinale Gymnema sylvestre. Ce protocole aidera les chercheurs à concentrer et à purifier les petites molécules actives à partir d’un extrait de plante pour des applications en aval à faible coût. En outre, nous démontrons également que l’enrichissement des protéines à partir d’un extrait de protéine complexe de Candida albicans champignon¹⁵ dans ce système basé sur l’IEF comme un deuxième exemple.

Protocole

1. Installation et prérunning de l’unité IEF standard de phase liquide

1. Assemblez les électrodes IEF en phase liquide (bouton anode-rouge et bouton cathode-noir) avec leurs membranes d’échange respectives selon le manuel d’instructions (voir Tableau des matériaux). Équilibrez les membranes d’échange d’anions avec 0,1 M De NaOH et les membranes d’échange de cations avec 0,1 M H₃PO₄ au moins pendant 16 h lorsque de nouvelles membranes sont utilisées.
   1. Rangez les membranes dans des électrolytes (0,1 M De NaOH ou 0,1 M H₃PO₄) entre les pistes et ne laissez pas sécher.
2. Assemblez la partie intérieure et externe de l’électrode en alignant trois trous oblongues dans les joints d’échange d’ions. Remplissez les électrodes d’électrolytes respectifs (~25-30 mL) pour éviter que leurs membranes ne se dessèchent.
   1. N’ajoutez pas d’électrolyte excédentaire (plus d’un 1/3^rd de volume de chambre électrode) qui peut augmenter la pression à l’intérieur de l’électrode et provoquer des fuites.
3. Couvrez les ports de collecte d’échantillons avec du ruban adhésif qui est livré avec les pièces d’assemblage d’instruments(voir tableau des matériaux). Le côté des ports de collecte d’échantillons peut être identifié par les deux broches verticales d’alignement en métal. Vous pouvez également utiliser du ruban d’étanchéité standard pour sceller les ports.
4. Assemblez toutes les parties de l’assemblage de la chambre de mise au point en séquence (électrode anode, noyau de membrane de nylon, chambre de mise au point et électrode cathodique) sur le doigt de refroidissement en céramique.
5. Remplissez la chambre de mise au point d’eau distillée précoolée (volume total de 60 mL pour la cellule IEF standard) à l’aide d’une seringue de 50 mL.
6. Connectez l’instrument IEF de phase liquide à une eau de refroidissement circulante à 4 ºC et prérunez l’appareil à 15 W et 3 000 V pendant 3 à 5 min ou jusqu’à ce que la tension se stabilise.
   REMARQUE : En général, en moins d’une minute, la tension atteindra les valeurs maximales définies. Le prérunning avec de l’eau distillée aide à enlever les ions résiduels de la chambre de mise au point et du noyau de la membrane de nylon.
7. Éteignez la source d’alimentation et retirez l’eau de la cellule à l’aide du collecteur de fractions. Resceller les ports de collecte avec du ruban adhésif.
   REMARQUE : Maintenant, l’instrument est prêt à être utilisé à l’étape 2.4.

2. Séparation et purification de petites molécules et peptides de l’extrait de gymnema sylvestre

1. Mesurer 0,6 g d’extrait de plante et se dissoudre dans de l’eau distillée (60 ml) en mélangeant dans un tube à rouleaux pendant 5 min.
   REMARQUE : Tout échantillon biologique soluble et exempt de sel peut être utilisé pour la séparation et la purification à l’aide de cet instrument IEF. Les échantillons dont la concentration de sel tamponnant jusqu’à 10 mM peuvent être utilisés avec une résolution légèrement diminuée. Nous sommes intéressés par la famille de saponine de composés triterpénoïdes, les acides gymnémiques, de la plante G. sylvestre pour leurs propriétés antifongiques^{uniques 16}.
2. Centrifuge l’extrait de plante solubilisé à 10 000 x g pendant 5 min pour éliminer les particules insolubles.
3. Transférer le supernatant (~60 mL) à un tube de centrifugeuse de 80 mL, et mélanger avec 0,6 mL d’ampholyte (pH 3-10) à 1% (v/v).
4. Suivez les étapes 1.1 – 1.7 pour préparer l’unité IEF de phase liquide. La chambre est maintenant prête à charger l’échantillon.
5. Utilisez une seringue de 50 mL avec une aiguille d’extrémité émoussée de 1-1/2 pouce 19 G (est livré avec l’instrument) et chargez l’échantillon préparé avec de l’ampholyte (60 mL au total) dans la cellule par l’intermédiaire des ports de collecte d’échantillons.
6. Retirez les bulles d’air de la cellule d’échantillon en enlevant la cellule de mise au point du support et en tapant sur la chambre de l’électrode pour déloger les bulles. La présence de bulles d’air provoquera des fluctuations de tension et de courant et affectera la course.
7. Connectez l’appareil au liquide de refroidissement de l’eau (4 °C) et commencez la fractionnement avec l’alimentation à une constante de 15 W.
8. Exécutez l’appareil pendant 3 h ou jusqu’à ce que la tension atteigne une valeur constante.
   REMARQUE : Lorsque l’échantillon commence à se concentrer, la tension commencera à grimper progressivement jusqu’à ce qu’elle atteigne une valeur constante.
9. Après la course, préparez-vous à recueillir les fractions de la boîte de récolte (contenant 20 tubes en plastique, 12 mm x 75 mm, 5-6 mL) reliées à la pompe à vide en appuyant sur le bouton de récolte ON dans l’unité IEF.
10. Alignez les broches de 20 collections avec les ports de 20 collections de la cellule de mise au point qui est scellée avec le ruban adhésif.
11. Poussez les broches de collecte à travers le ruban d’étanchéité et tournez la pompe à vide en même temps (voir la figure 2B, 2C et 2D).
    REMARQUE : Environ 3 fractions mL de chaque chambre seront recueillies dans les tubes à chaque fois. Les fractions peuvent être utilisées pour des applications ultérieures en aval (SDS-PAGE pour la quantification des peptides, le TLC et le biotest pour les petites molécules).

3. Séparation et purification des protéines de C. albicans

1. Cultiver une seule colonie de C. albicans dans le bouillon de levure-peptone-dextrose (YPD)¹⁶ à 30 °C avec secousse (200 tr/min) pour la nuit.
2. Recueillir les cellules de levure par centrifugation (10 000 x g pendant 5 min).
3. Suspendre les cellules de levure C. albicans dans le tampon de carbonate d’ammonium (1,89 g/L) contenant 1% (v/v) bêta-mercaptoéthanol (β-ME) (1/10ème du volume de culture) et tourner dans un tube à rouleaux pendant 1 h à 5 °C¹⁵.
4. Retirer les cellules de levure par centrifugation (10 000 x g pendant 5 min) et filtrer l’extrait de protéine à travers un filtre de 0,45 μm.
   REMARQUE : Des échantillons de protéines provenant du cytosol, de la membrane ou de la paroi cellulaire de C. albicans peuvent être préparés et utilisés pour la fractionnement de l’IEF. De même, les protéines provenant de bactéries ou d’autres échantillons biologiques (extrait de tissu animal) peuvent être utilisées après avoir enlevé tout sel par des méthodes appropriées(p. ex.,par dialyse ou en utilisant des colonnes de dessalte).
5. Dialyze l’extrait de protéine dans un tube de dialyse (3 500 MWCO) contre l’eau pendant 15 h à 4 °C. Estimer la concentration de protéines par la méthode de liaison de colorants Bradford en utilisant la globuline gamma comme norme¹⁷.
6. Utiliser 500 mg de protéines totales dans 60 mL d’eau contenant 1% (v/v) ampholyte (pH 5-8) pour la fractionnement.
   REMARQUE : Comme un ampholyte à large gamme (pH 3-10) n’enrichit pas certaines protéines de la paroi cellulaire non glucanes attachées de C. albicans bien, utilisez une gamme étroite (pH 5-8) amphyte. Une concentration d’ampholyte pouvant atteindre 2 % peut être utilisée si la concentration de protéines de l’échantillon est supérieure à 2 mg/mL; cela minimise l’agrégation des protéines pendant la mise au point. Gardez toujours les échantillons, les ampholytes et l’eau précoolées sur la glace.
7. Répétez les étapes 1.1- 1.7 pour préparer l’unité IEF et utilisez la solution protéique de l’étape 3.6 pour charger dans la cellule IEF.
8. Après 4 h de concentration à une constante de 15 W, récolter les fractions de protéines (1-20) comme décrit ci-dessus (étapes 2.9-2.11) et analyser sur 12,5% SDS-PAGE après la réduction et l’ébullition des échantillons de protéines¹⁸.
9. Tacher les protéines résolues en tachant le gel SDS-PAGE avec le colorant bleu Coomassie (0,01%) solution pour 2-3 h à température ambiante sur un rocker. Destain le gel et enregistrer l’image de gel à l’aide d’un imageur de gel.
   NOTE: Colorant bleu Coomassie (0.01%) peut être préparé en mélangeant 0,01 g de poudre bleue Coomassie dans une solution de désantrage contenant 40% de méthanol et 10% d’acide acétique.

4. Bioactivité des petites molécules purifiées à partir de l’extrait de plante Gymnema sylvestre

1. Cultiver des C. albicans dans les cellules de levure comme à l’étape 3.1.
2. Pour préparer la suspension cellulaire, diluer la culture du jour au lendemain des cellules de levure de C. albicans (1/1000 dilution) dans un milieu frais de culture cellulaire RPMI complété par 50 mM de glucose.
   NOTE : C. albicans se convertit de la croissance de levure en hyphe dans des conditions d’induction d’hyphane (RPMI à 37 °C). Il est démontré que les petites molécules d’acide gymnémique inhibent la conversion des cellules de levure en hyphes dans des conditions d’induction d’hyphas¹⁶. Nous avons cherché à déterminer si l’extrait de G. sylvestre séparé en phase liquide-IEF contient ces molécules bioactives.
3. À partir de la suspension de cellules préparée, ajouter 90 μL à chaque puits de la plaque de 96 puits.
4. De chaque fraction (1 à 20 fractions récoltées d’extrait de G. sylvestre obtenue à partir de la phase liquide IEF, figure 4),ajouter 10 μL dans les puits avec 90 μL de la suspension cellulaire ci-dessus (étape 4.2). Effectuez l’analyse en triple.
5. Ajouter 10 μL d’eau contenant de l’ampholyte (1%) dans des puits séparés avec 90 μL de suspension de cellules de levure C. albicans comme un contrôle négatif.
   REMARQUE : Les ampholytes ont un potentiel de bioactivité et il est donc essentiel d’inclure un contrôle ampholyte tout en effectuant n’importe quel bioassay¹⁹.
6. Incuber la plaque de 96 puits à 37 °C pendant 12 h et observer l’inhibition de la conversion de levure-hypha de C. albicans sous le microscope¹⁶. En outre, déterminer le pourcentage d’inhibition de la conversion de levure à hypha.

Résultats

Séparation et purification de petites molécules et peptides de l’extrait de plante de Gymnema sylvestre
En utilisant la méthode préparateur de phase liquide IEF, nous avons fractionné des extraits de plantes médicinales et des protéines de surface cellulaire d’un champignon pathogène humain, C. albicans. Un schéma de ces protocoles de fractionnement est illustré à la figure 1.

À partir de 20 fractions d’extra...

Discussion

Les petites molécules provenant de sources naturelles de produits (p. ex., les plantes) comprennent des métabolites secondaires complexes qui sont très divers dans la structure chimique. On pense qu’ils sont impliqués dans les mécanismes de défense des plantes. En outre, les polypeptides sont également présents dans les tissus végétaux²². Ces petites molécules naturelles sont de riches sources de molécules d’essai pour la découverte et le développement de médicaments. Cependant,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Fisher scientfic	09-720-004
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	207861-500
Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	Bio-Rad	163-1113
Bio-Lyte 5/8 Ampholyte	Bio-Rad	163-1192
Compact low temperature thermostat	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B7920
Dialysis tubing (3,500 MWCO)	Spectrum Spectra/Por	132112T
Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids)	Suan Farma, NJ USA
Incubator	Lab companion	SI 300R
Microscope	Leica	DM 6B
Mini protean electrophoresis	Bio-Rad
pH meter	Mettler Toledo	S20	Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions
Rotofor	Bio-Rad	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)
RPMI-1640 Medium	HyClone	DH30255.01
Sealing tape	Bio-Rad	170-2960	Scotch tape may also be used.
Sorvall legend micro 17 centrifuge	Thermo scientific	75002432
TPP tissue culture plate -96 well flat bottom	TPP	TP92696