RT-PCR cuantitativo de alto rendimiento en muestras de C. elegans individuales y a granel utilizando tecnología nanofluídica

Resumen

En este artículo se describe un protocolo de alto rendimiento para una determinación rápida y confiable de los niveles de expresión génica en muestras de C. elegans simples o masivas. Este protocolo no requiere aislamiento de ARN y produce cDNA directamente a partir de muestras. Se puede utilizar junto con plataformas qPCR nanofluídicas nanofluídicas multiplexadas de alto rendimiento en tiempo real.

Resumen

Este artículo presenta un ensayo de PCR cuantitativa de transcripción inversa de alto rendimiento (RT-qPCR) para Caenorhabditis elegans que es rápido, robusto y altamente sensible. Este protocolo obtiene mediciones precisas de la expresión génica de gusanos individuales o de muestras a granel. El protocolo presentado aquí proporciona una nueva adaptación de los métodos existentes para la preparación complementaria del ADN (CDNA) acoplado a una plataforma rt-qPCR nanofluídica. La primera parte de este protocolo, denominado 'Worm-to-CT', permite la producción de cDNA directamente a partir de nematodos sin necesidad de aislamiento previo de ARNm. Aumenta el rendimiento experimental al permitir la preparación de cDNA a partir de 96 gusanos en 3,5 h. La segunda parte del protocolo utiliza la tecnología nanofluídica existente para ejecutar RT-qPCR de alto rendimiento en el cDNA. Este trabajo evalúa dos chips nanofluídicos diferentes: el primero ejecuta 96 muestras y 96 objetivos, lo que resulta en 9.216 reacciones en aproximadamente 1,5 días de trabajo en el banco. El segundo tipo de chip consta de seis matrices de 12 x 12, lo que resulta en 864 reacciones. Aquí, el método de gusano a TC se demuestra cuantificando los niveles de ARNm de genes que codifican proteínas de choque térmico de gusanos individuales y de muestras a granel. Se proporciona una extensa lista de imprimaciones diseñadas para amplificar el ARN procesado para la mayoría de los genes de codificación dentro del genoma de C. elegans.

Introducción

La optimización de la secuenciación de ARN unicelular y qPCR reveló que los pulsos o ráfagas transcripcionales pueden conducir a una variación masiva en el número de moléculas de ARN por célula^1. Además, estas tecnologías descubrieron una heterogeneidad celular sustancial que antes no se perdía por las mediciones transcriptómicas a granel estándar. Dependiendo del contexto, cierta variabilidad transcripcional unicelular es causada por la composición celular mixta de los tejidos. Sin embargo, incluso en las poblaciones celulares isogénicas cultivadas bajo el mismo entorno hay heterogeneidad transcripcional generalizada^2,3. Esta "variabilidad biológica" se identifica cada vez más como una propiedad omnipresente de las redes celulares, desde bacterias hasta el hombre. En algunos casos, puede tener consecuencias fenotípicas en el desarrollo, progresión del cáncer, latencia del VIH, y respuesta a la quimioterapia^4,5.

El nematodo Caenorhabditis elegans es un organismo modelo único con características ideales para estudiar las causas y consecuencias de la variabilidad biológica entre individuos. Estos nematodos son un organismo modelo simple compuesto por 959 células, y su cutícula transparente las hace aptos para estudios de imágenes in vivo^6. C. elegans es una especie hermafrodita que se reproduce predominantemente a través de la auto fertilización; esto dio lugar a cepas de laboratorio isogénicas. A pesar de la isogenicidad y las condiciones de cultivo controladas, muchos fenotipos y transcripciones son variables entre los individuos, lo que sugiere que las diferencias estocásticas o microambientales contribuyen a la heterogeneidad entre los individuos^7,8. Tal variabilidad en la expresión génica tiene múltiples consecuencias de aptitud, incluyendo variabilidad en la penetrancia de mutaciones, supervivencia, tiempo de desarrollo, y fecundidad^7,8,9. Debido a estas características, los estudios de un solo gusano proporcionan la oportunidad sin precedentes de estudiar la variabilidad biológica en todo un organismo.

Hay una necesidad fundamental en el campo para desarrollar y optimizar tecnologías para la detección precisa de transcripciones a un nivel de un solo gusano. Las nuevas tecnologías, como la secuenciación de ARN de un solo gusano^10,la secuenciación de ARN de tejidos aislados¹¹y la secuenciación de una sola célula¹² ya están disponibles para C. elegans. Sin embargo, sigue existiendo un desafío principal: al monitorear la interindividualidad, los genes débilmente expresados a menudo caen por debajo de los niveles detectables^13. Esto es particularmente relevante para las transcripciones raras aisladas de pequeñas cantidades de material de partida, ya que existe una relación inversa y bien establecida entre la expresión media y la varianza técnica, lo que a menudo hace que las transcripciones raras caigan por debajo de los recortes estadísticos¹³. La optimización de las tecnologías qPCR multiplexadas de alto rendimiento ha demostrado ser útil para estudios monocelulares de mamíferos, en particular cuando se estudia la expresión de transcripciones raras^14,15. Esta tecnología también se puede utilizar para fines de benchmarking y validación de otras tecnologías de un solo gusano.

Worm-to-CT es un método rápido y robusto adaptado de un kit utilizado en estudios de biología celular, para la preparación de cDNA de un solo gusano. cDNA obtenido por este método junto con la tecnología qPCR nanofluídica multiplexada fue elegido porque proporciona un mayor rendimiento experimental, un rango dinámico más amplio de detección y ha sido validado para propósitos de una sola célula^14,15. La preparación de cDNA descrita también es aplicable para su uso con tecnologías PCR estándar. El rendimiento se incrementa de dos maneras: En primer lugar, la preparación de cDNA es más rápida y fiable que la extracción tradicional de guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo, porque los gusanos se agregan directamente al búfer de lisis, omitiendo el aislamiento directo del ARN fácilmente degradable. En segundo lugar, la utilización de tecnologías nanofluídicas aumenta significativamente el número de muestras y objetivos que se pueden ejecutar simultáneamente. En este papel, se comparan dos chips: un chip de una sola matriz y un chip multi-array. Un chip de una sola matriz puede ejecutar 96 gusanos individuales y 96 conjuntos de imprimación, lo que resulta en 9.216 reacciones por experimento. Para lograr un rendimiento similar utilizando tecnologías qPCR estándar requeriría 96 experimentos qPCR separados, utilizando 96 placas de pozo. El chip multi-array más pequeño y flexible consta de seis matrices de 12 x 12 que dan como resultado 864 reacciones. La fiabilidad y sensibilidad superiores del método se ven impulsadas por la tecnología nanofluídica y por la introducción de un paso de preamplificación. El método presentado en este artículo está destinado a ser utilizado junto con un algoritmo estadístico de última generación para extraer varianza biológica. Este artículo presenta el protocolo para la preparación rápida de cDNA y qPCR de alto rendimiento para muestras de gusanos de un solo gusano y por lotes; el algoritmo se publicará en otro lugar. Para este protocolo, la organización de cada chip debe prepararse antes del experimento. La Tabla 1 y la Tabla 2 muestran ejemplos de estos planes para un chip multi-matriz y de una sola matriz, respectivamente. También hay información general del protocolo Worm-to-CT detallada en la Figura 1 y la ejecución de los chips multi-matriz y de matriz única en la Figura 2.

Protocolo

NOTA: A lo largo de este protocolo Caenorhabditis elegans se conoce como "gusano" o "gusanos". Una variedad de cepas C. elegans se pueden pedir a través de bases de datos en línea o poniéndose en contacto directamente con laboratorios que utilizan el organismo modelo. La parte I de este protocolo (secciones 1-3) describe la preparación cDNA a través del protocolo worm-to-CT. La parte II de este protocolo (secciones 4-13) describe la ejecución de RT-qPCR de alto rendimiento utilizando nanofluídicos, adaptados de un protocolo desarrollado por Fluidigm^16. Este protocolo se aplica al uso de los dos tipos de chips nanofluídicos definidos anteriormente, el chip de matriz única, que puede monitorear 96 objetivos en 96 muestras (9.216 reacciones RT-qPCR en total), o el chip multi-matriz, que funciona como subunidades de 12 muestras de destino x 12. Cada chip de varias matrices contiene seis matrices independientes que se pueden ejecutar juntas o por separado. Por ejemplo, el uso de todo un chip multi-matriz puede monitorear 72 destinos x 12 muestras (o viceversa), o 36 destinos x 24 muestras (o viceversa). Para obtener más información sobre cualquiera de los materiales utilizados en este protocolo, consulte la Tabla de materiales.

1. Validación de imprimación RT-qPCR

NOTA: Las imprimaciones en tiempo real se diseñaron en función de las propiedades recomendadas emitidas originalmente por las directrices¹⁷de MIQUE. Para que las imprimaciones fueran específicas para el ARN procesado, se diseñaron productos de tal forma que las dos imprimaciones se enlazaron a ambos lados de al menos una unión de empalme. Los requisitos para imprimaciones adecuadas incluían un contenido de guanina y citosina del 20%-80%, una temperatura de fusión de 58-60 °C, una diferencia en la temperatura de fusión entre los pares de imprimación de ≤0,5 °C y una longitud del producto de 70-120 bp. La secuencia de las imprimaciones generadas se puede encontrar en la Tabla suplementaria 1. El código fuente abierto para los scripts utilizados para generar las imprimaciones se puede encontrar en https://github.com/s-andrews/wormrtpcr. Los pares de imprimación para transcripciones con sitios de empalme fueron diseñados para que se encuentran en dos exones flanqueando un intron, pero no fueron diseñados para ser específicos de la variante de empalme, utilizando el software NCBI Primer Blast^18. Para este estudio, los conjuntos de imprimación fueron volados contra el genoma de C. elegans para probar cualquier complementariedad fuera del objetivo.

1. Recuperar imprimaciones de la base de datos de imprimaciones RT-qPCR (Tabla suplementaria 1). Como alternativa, diseñe pares de imprimación qPCR utilizando herramientas en línea como NCBI Primer Blast¹⁸.
2. Realice una curva estándar qPCR para supervisar la especificidad y la eficiencia de la PCR para cada par de imprimaciones utilizando técnicas qPCR a granel estándar¹⁹ y siguiendo las directrices MIQUE^17,20.
   NOTA: Solo se deben utilizar pares de imprimación con R² > 0,98 y eficiencia de PCR entre el 85% y el 115%. La secuencia, la eficiencia del PCR y el R² para las imprimaciones utilizadas en este estudio se detallan en el cuadro 3.

2. Lisis de gusano a través de Gusano a TC

1. Elige los gusanos de su césped bacteriano en una placa NGM fresca y sin semilla y permite que los gusanos se muevan alrededor de la placa durante 5 minutos para eliminar la mayoría de las bacterias del gusano a través de su movimiento.
   NOTA: El césped bacteriano y las condiciones de cultivo variarán dependiendo del diseño experimental. Los experimentos presentados aquí requieren placas NGM de 6 cm sembradas con OP50 Escherichia coli con gusanos de interés cultivados a la etapa L4.9 en una incubadora de 20 °C.
2. En una capucha libre de RNase, prepare una mezcla maestra que consista en 12,5 μL de 2x buffer RT, 1,25 μL de 20x RT buffer enzimático y 0,25 μL de agua libre de nucleasa por muestra. Añadir 14 μL de mezcla maestra a 11 μL de cada muestra desde el paso 2.8.
3. Coloque la tapa de una tira pcr boca abajo en la plataforma del alcance de disección y agregue 10 μL de la mezcla de lisis a las tapas de tubo PCR abovedadas bajo un microscopio compuesto.
   NOTA: Con sólo una o dos muestras, es mejor utilizar una tira PCR que contenga al menos cuatro tubos, ya que esto reduce el riesgo de que las tapas se abran en los pasos posteriores de congelación-deshielo. Alternativamente, las bandas de goma se pueden utilizar para mantener las tapas en su lugar. En ese caso, asegúrese de que las tapas estén correctamente cerradas cada vez que se transfieren los tubos.
4. Recoge los gusanos de la placa en cada ranura de la tapa que contenga la mezcla de lisis "recogiéndolos" (es decir, atrapando los gusanos debajo con la selección) para evitar la contaminación bacteriana. Cierre los tubos y escríbalos durante 5 s usando una microcentrífuga de mesa(Tabla de Materiales)antes de colocarlos en un matraz de Dewar lleno de nitrógeno líquido.
   NOTA: Entre 15 y 30 gusanos deben utilizarse para experimentos a granel y 1 gusano para mediciones de un solo gusano.
   PRECAUCIÓN: Al manipular el desgaste líquido de nitrógeno Cryo-Gloves, así como gafas protectoras y cumplir con las regulaciones de ropa estándar, ya que el contacto con la piel u ojos puede causar lesiones graves por congelación.
5. Congelar-descongelar los tubos PCR 10x transfiriéndolos entre nitrógeno líquido y un baño de agua ~ 40 ° C. Deje los tubos en el nitrógeno líquido durante un mínimo de 5 s para asegurarse de que las muestras estén completamente congeladas. Deje los tubos en el baño de agua hasta que las muestras se descongelen. No deje entrar por un período más largo, ya que esto conduce a la degradación del ARN.
   NOTA: Los tubos se pueden dejar en nitrógeno líquido durante un período prolongado de tiempo, ya que las muestras se congelan a aproximadamente -200 °C, reduciendo la degradación del ARN. Sin embargo, esto no debería ser un punto de parada de protocolo, porque el nitrógeno líquido se evapora rápidamente.
6. Mezcle las muestras en un mezclador térmico(Tabla de Materiales)establecido a 4 °C durante 20-30 minutos girando a ~1,800 rpm.
7. Mientras se mezclan las muestras, descongele la solución stop en hielo.
8. Gire las muestras hacia abajo utilizando una microcentrífuga de mesa(Tabla de Materiales)y agregue 1 μL de solución de parada a cada tubo.
   NOTA: Las muestras se pueden dejar a -80 °C hasta 1 semana antes de transcribir inversamente el ARN (sección 3).

3. Transcripción inversa

NOTA: Para la transcripción inversa de gusanos individuales, los resultados mostrados aquí se generaron utilizando los reactivos proporcionados con los chips nanofluídicos (opción 2 en la Figura 1). Los reactivos resaltados en la opción 2 de la Figura 1 también se utilizaron para la transcripción inversa de muestras agrupadas. Cualquiera de los métodos funciona indistintamente para los diferentes tipos de ejemplo.

1. Transcripción inversa de gusanos individuales
   1. En una capucha sin RNase, agregue 1,25 μL de mezcla de transcripción inversa(Tabla de Materiales)a un tubo PCR fresco.
      NOTA: Se puede utilizar una placa PCR de 96 pozos y una pipeta automática si hay muchas muestras. El protocolo del fabricante establece que se pueden utilizar 1 μL por muestra.
   2. Tome 5 μL de la solución de lisis y detenga la mezcla de soluciones del paso 2.8 y agréguela al tubo PCR fresco que contiene la mezcla de transcripción inversa.
      NOTA: El protocolo del fabricante establece que se pueden utilizar 1 μL de ARN (2,5 pg/μL–250 ng/μL) por reacción. Se puede añadir un control RT negativo por placa reemplazando la mezcla de transcripción inversa por 5 μL de muestra lysed y 1,25 μL de agua libre de RNAse.
   3. Ejecute las muestras utilizando el siguiente programa de transcripción inversa en un termociclo: 25 °C durante 5 min, 42 °C durante 30 min, 85 °C durante 5 min y 4 °C para ∞.
      NOTA: El cDNA producido se puede almacenar a -20 °C antes de proceder a la amplificación y la recopilación de datos utilizando qPCR de alto rendimiento.
2. Transcripción inversa para muestras a granel (15-30 gusanos)
   1. En una capucha libre de RNase, prepare una mezcla maestra que consista en 12,5 μL de 2x buffer RT, 1,25 μL de 20x RT buffer enzimático y 0,25 μL de agua libre de nucleasa por muestra. Añadir 14 μL de mezcla maestra a 11 μL de solución de lisis y detener la mezcla de solución desde el paso 2.8.
      NOTA: Cuando se trata de un gran número de muestras, esto se puede realizar en 96 placas de pozo.
   2. Ejecute las muestras a través de un termociclo utilizando el siguiente programa de transcripción inversa: 37 °C durante 60 min, 95 °C durante 5 min y 4 °C para ∞.
   3. Diluir el cDNA producido 1:4 en agua libre de nucleasa.
      NOTA: Generalmente, los productos llegan a un volumen final de 25 μL, en cuyo caso se deben añadir 75 μL. Sin embargo, debido a la condensación el volumen final puede variar. Por lo tanto, ajuste en consecuencia para hacer una relación 1:4 en la solución final. Este paso de dilución no se aplica si se realiza qPCR en gusanos individuales. El cDNA producido se puede almacenar a -20 °C antes de proceder a la amplificación y la recopilación de datos utilizando qPCR de alto rendimiento.

4. Preparación de la mezcla de imprimación multiplex

1. Prepare un caldo de imprimación hacia delante/hacia atrás (F/R) para cada par de imprimaciones a una concentración final de 50 μM. Mezcle el mismo volumen de imprimaciones delanteras e inversas a 100 μM cada una.
2. Combine 1 μL de 50 μM de primer material de imprimación F/R para cada par de imprimación que se va a probar. Añada el búfer de suspensión de ADN hasta un volumen total de 100 μL.
   NOTA: Las concentraciones de imprimación de stock aquí difieren de las descritas en el protocolo¹⁶ del fabricante, pero conservan la misma concentración final de 500 nM.

5. Preamplificación específica

1. Preparar una mezcla maestra que contenga 1 μL de mastermix de preamplificación(Tabla de Materiales),0,5 μL de la mezcla de imprimación agrupada (paso 4.2) y 2,25 μL de agua libre de nucleasa por reacción con un volumen excedente global del 10%.
2. En una placa de pozo 96, aliquot 3.75 μL de la mezcla maestra en tantos pozos como sea necesario para el número de muestras a ejecutar.
3. Añada 1,25 μL de las soluciones de interés cDNA generadas en los pasos 3.1.3 o 3.2.3 a cada pozo.
4. Cubra la placa con cinta de sellado de 96 pozos, vórtice breve y centrífuga con una hilandera de placa de mesa. Transfiéralo a un termociclo y ejecuta el siguiente programa: 95 °C durante 2 min, 15 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, recocido/extensión a 60 °C durante 4 min y 4 °C para ∞.
   NOTA: El fabricante recomienda entre 10 y 20 ciclos para la reacción de preamplificación¹⁶. Este protocolo recomienda 10 o 15 ciclos dependiendo de los niveles de expresión de los genes objetivo.

6. Tratamiento exonuclease I

NOTA: Esto es para eliminar imprimaciones no incorporadas de la preamplificación.

1. Preparar una mezcla de exonuclease I que contenga 0,2 μL de amortiguador de reacción exonucleasa I(Tabla de materiales),0,4 μL de exonuclease I a 20 U/μL(Tabla de Materiales)y 1,4 μL de agua libre de nucleasa por muestra. Mantenga todos los reactivos en hielo, especialmente la exonuclease I.
2. Retire la placa de 96 pozos (paso 5.4) del termociclo, centrífuga con el spinner de la placa de mesa, y retire cuidadosamente el sello. Añadir 2 μL de la mezcla de exonucleasa I a cada reacción de preamplificación. Vuelva a colocar, centrífuga y vuelva a colocar la placa de 96 pozos en el termociclo utilizando el siguiente programa: 37 °C durante 30 min, 80 °C durante 15 min y 4 °C para ∞.
3. Saque las muestras del termociclo y diluya las 1:5 añadiendo 18 μL de 1x tampón Tris EDTA(Tabla de Materiales).
   NOTA: Es posible mantener las muestras de cDNA a -20 °C para su uso posterior. El protocolo del fabricante sugiere posibles diluciones de 5x, 10x o 20x en esta etapa^16,dependiendo del nivel de expresión de los objetivos de interés.

7. Preparar las mezclas de ensayo

NOTA: Las mezclas de ensayo se pueden preparar en 384 placas de pozo, ya que los pozos tienen el mismo espaciado que los chips nanofluídicos, lo que facilita la carga.

1. Preparación de mezclas de ensayo para un chip multi-array
   1. Preparar una mezcla maestra que consista en 2 μL de reactivo de carga de ensayo 2x(Tabla de Materiales)y 1,6 μL de amortiguador de suspensión de ADN(Tabla de Materiales)para cada pozo de acuerdo con el plan preparado. Aliquot 3,6 μL de esta mezcla maestra por pozo en una placa de pozo 384.
   2. Añadir 0,4 μL del caldo de imprimación F/R de 50 μM preparado en el paso 4.1 a los pozos adecuados según el plan preparado.
      NOTA: Esto proporciona un total de 4 μL de mezcla de ensayo por pozo, con un excedente de 1 μL.
2. Preparación de mezclas de ensayo para un chip de una sola matriz
   1. Preparar una mezcla maestra que consiste en 3 μL de reactivo de carga de ensayo 2x y 2,4 μL de amortiguador de suspensión de ADN para cada pozo de acuerdo con el plan preparado. Aliquot 5,4 μL de esta mezcla maestra por pozo en una placa marcada de 384 pozos.
   2. Añadir 0,6 μL del caldo de imprimación F/R de 50 μM a los pozos adecuados según el plan preparado.
      NOTA: Esto proporciona un total de 6 μL de mezcla de ensayo por pozo, con un excedente de 1 μL.

8. Preparación de las mezclas de muestra

NOTA: Las mezclas de muestra se pueden preparar con hasta 1 día de antelación y almacenarse a 4 °C.

1. Preparación de muestras para un chip multi-array
   1. Preparar una mezcla maestra de muestra que consta de 2 μL de supermezcla de sonda fluorescente 2x con BAJA ROX(Tabla de Materiales)y 0,2 μL de reactivo de muestra(Tabla de Materiales)por muestra. Dispense 2,2 μL de esta mezcla en la placa de pozo 384 marcada.
      NOTA: El fabricante recomienda no vórtice el reactivo de muestra¹⁶.
   2. Pipeta 1,8 μL de cada muestra preamplificada y exonuclease tratada desde el paso 3.2.3 hasta los pozos apropiados según el plan preparado.
      NOTA: Esto da un total de 4 μL, con un excedente de 1 μL.
2. Preparación de muestras para un chip de una sola matriz
   1. Prepare una mezcla maestra de muestra que consista en 3 μL de supermezcla de sonda fluorescente 2x con BAJA ROX(Tabla de Materiales)y 0,3 μL de reactivo de carga de muestras de tinte de unión al ADN de 20x(Tabla de Materiales)por muestra. Dispense 3,3 μL de esta mezcla en la placa marcada de 384 pozos.
   2. Pipeta 2,7 μL de cada muestra preamplificada y exonuclease I tratada desde el paso 6.3 hasta los pozos apropiados de acuerdo con el plan preparado.
      NOTA: Esto da un total de 6 μL, con un excedente de 1 μL. Si hay pozos que ejecutar sin una muestra, estos deben cargarse con mezcla maestra de muestra y 2,7 μL de agua en lugar de cDNA. Esto se recomienda para ambos tipos de chip. La máquina necesita rox bajo en cada entrada con el fin de detectar la rejilla del chip.

9. Cebado del chip nanofluídico

NOTA: Un chip multi-array sólo necesita ser preparado en la primera ejecución. Si hay ejecuciones posteriores del mismo chip, esta etapa se puede omitir. Estos pasos son los mismos para ambos tipos de chip.

1. Lenta y cuidadosamente, inyecte los 150 μL completos del fluido de la línea de control de las jeringas incluidas en los acumuladores del chip. Asegúrese de que ningún líquido de control toque el chip sosteniendo el chip en un ángulo de 45° y manteniendo la punta de la jeringa lejos para evitar derrames.
2. Retire la película protectora azul de la parte inferior del chip.
3. Coloque el chip en la máquina de cebado PCR nanofluídica(Tabla de materiales),con el código de barras mirando hacia afuera. Ejecute el script 'Prime (153x)', que toma ~15–20 min.
   NOTA: Encienda el termociclo de nanofluídicos(Tabla de Materiales)en esta etapa, ya que la cámara tarda unos 10 minutos en enfriarse a menos de 0 °C.

10. Carga del chip nanofluídico

1. Retire los tapones de barrera secuencialmente a medida que se lleva a cabo la carga. Esto reduce la posibilidad de descargar mal los pozos.
2. Transfiera 3 μL para un chip multi-matriz o 5 μL para un chip de una sola matriz de cada mezcla de ensayo de imprimación y mezclas de muestra a las entradas correspondientes del chip nanofluídico de acuerdo con el plan preparado. Asegúrese de no introducir burbujas, lo que puede hacer que el volumen total transferido sea menor de lo deseado.
   NOTA: Si hay pozos que se ejecutarán sin una imprimación, es importante que se carguen con mezcla maestra, sustituyendo el volumen de imprimación por agua. Esto se aplica a ambos tipos de chip. En esta etapa, puede ser más fácil colocar el chip en una superficie oscura, lo que permitirá que los pozos se vean más fácilmente.

11. Ejecutar el chip nanofluídico

NOTA: La primera vez que se ejecuta un chip de varias matrices, configure el archivo de seguimiento seleccionando Herramientas | Flex Six Usage Tracking, haga clic en Nuevo, escriba un nombre de archivo y seleccione una ubicación antes de hacer clic en Listo.

1. Abra el software de recopilación de datos. Haga clic en Iniciar nueva ejecución. Coloque el chip cargado en el termociclo nanofluídico con el código de barras orientado hacia afuera.
2. Elija la configuración del proyecto si procede y, a continuación, haga clic en Siguiente | Cargar. Si carga un chip de varias matrices, seleccione las particiones (matrices) que se van a ejecutar.
3. Seleccione los sondeos de referencia dela aplicación y, a continuación, cambie el tipo de aplicación a Expresión génicay cambie la referencia pasiva a ROX. Seleccione el ensayo de sondeo único,cambie el tipo de sondeo a Eva Greeny haga clic en Siguiente.
4. Seleccione el protocolo de ciclo térmico GE FLEX seis Fast PCR+Melt v1 para ejecutar un chip multi-array, o el protocolo GE 96.96 Fast PCR+Melt v2 para ejecutar un chip de una sola matriz.
5. Confirme que la exposición automática está seleccionada y haga clic en Iniciar ejecución.

12. Publique la carrera del chip

NOTA: Esta sección solo es necesaria para chips multi-matriz cuando no se utiliza todo el chip.

1. Saque el chip del termociclo nanofluídico y cargue en la máquina de cebado PCR nanofluídica y ejecute el script Post Run (153x), que dura 5 minutos.
2. Etiquete los enchufes utilizados como referencia personal.
   NOTA: El chip ahora se puede almacenar a temperatura ambiente y las matrices restantes en el chip se pueden ejecutar dentro de 2 meses.

13. Limpieza y análisis de datos

1. Abra los datos en el software 'Análisis PCRen tiempo real ' (Tabla de materiales). Compruebe la temperatura máxima de fusión para cada primer par probado. Elimine los resultados que exhiben más de un pico de temperatura de fusión, para un par de imprimación dado.
   NOTA: Varios picos solo aparecen ocasionalmente, presumiblemente cuando los pares de imprimación forman atenuadores, o de interacciones de imprimaciones de destino con otras imprimaciones en la mezcla de imprimación agrupada.
2. Exporte los datos como un archivo de hoja de cálculo 'heatmap' y elimine muestras o imprimaciones con errores.
3. Analice los datos utilizando el método Delta-Ct^{estándar 21}. Para la evaluación estadística realizar ANOVA unidireccional en niveles de expresión relativa.

Resultados

Validación de Worm-to-CT como método de preparación de cDNA

Para probar si el protocolo worm-to-CT es un método de extracción cDNA válido, se comparó con los métodos estándar de extracción de guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo. Los resultados se muestran en la Figura 3, donde cDNA se preparó a partir de un promedio de ~ 1,000 gusanos utilizando técnicas estándar de extracción de guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo²² y de 30 gusanos utilizando el método worm-to-CT. Las muestras fueron impactadas por calor simultáneamente (30 min a 34 °C). A nivel mundial, los niveles de expresión de hsp-70 mRNA por cada 100 ng de ARN total eran comparables utilizando ambos métodos. Sin embargo, en el caso de la expresión hsp-70 más alta (es decir, en N2 después de un choque térmico) los niveles de expresión eran más altos con el método de gusano a TC, lo que indica una sensibilidad mejorada.

Para determinar si se podía reproducir una disminución esperada de la expresión hsp en hsf-1(sy441)²³, se pudo reproducir una mutación en el regulador transcripcional principal de los chaperones moleculares^23,24, , se pudo reproducir la inducción de chaperona transcripcional después de un breve choque térmico. Con ambos métodos se detectó una disminución de la inducción hsp-70 en animales hsf-1(sy441). Esto era esperado, porque los animales mutantes hsf-1(sy441) exhiben una disminución de la capacidad de inducir chaperones debido a un truncamiento en el dominio de transactivación de HSF-1. En el for guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo extracción hsp70 disminuyó en un 82,7% en comparación con los controles y 92,3% para gusano a TC en comparación con animales de tipo salvaje (Figura 3). Los resultados fueron comparables entre ambos métodos y comparables a los informes anteriores^23. Estos resultados indican que el método worm-to-CT es una alternativa válida a las técnicas estándar de síntesis de cDNA.

Validación de la plataforma PCR nanofluídica utilizada para amplificar los objetivos de ARNm

Para probar la consistencia de los resultados utilizando qPCR nanofluídico para la amplificación de transcripción, los resultados de PCR obtenidos del método a granel worm-to-CT se compararon tanto en un sistema qPCR estándar(Tabla de Materiales)como en un sistema qPCR nanofluídico utilizando un chip multi-matriz. El cambio de pliegue en la expresión de tres genes diferentes, sma-3 (Figura 4A), sma-10 (Figura 4B), y dnj-26, fue monitoreado (Figura 4C) en animales que llevan un alelo nulo en dbl-1 (dbl-1(nk3))²⁵ en comparación con contrapartes de tiposalvaje. Dbl-1 codifica el único ligando de la vía de señalización de proteína morfogenética ósea (BMP). sma-3 y sma-10 son genes que codifican ortoólogos SMAD, componentes clave de la cascada de señalización BMP. Dnj-26 codifica una chaperona molecular, un objetivo de la señalización BMP. Estos resultados muestran poca o ninguna diferencia en el cambio de pliegue comparando los resultados de los dos métodos, lo que resulta en valores P no significativos en 0.3113, 0.2635 y 0.3481 para sma-3, sma-10y dnj-26,respectivamente. En conjunto, estos resultados muestran que el método worm-to-CT aplicado a las muestras a granel es una manera eficiente y rápida de extraer ARN de pocos gusanos y proporciona datos confiables cuando se combina con sistemas PCR estándar o plataformas qPCR basadas en nanofluidics de alto rendimiento.

Comparación entre los niveles de expresión obtenidos por muestras a granel con promedios obtenidos de gusanos individuales

Los niveles de expresión relativa se calcularon utilizando cDNA obtenido a partir de muestras masivas (25 gusanos) o a partir de un promedio de 36 muestras de gusano único (Figura 5). Ambos CDA se obtuvieron utilizando el método Worm-to-CT y se amplificaron utilizando la tecnología PCR nanofluídica. Como se observa en la Figura 5A–C, para todos los acompañantes probados (es decir, hsp16.1, F44E5.4, hsp-70),los métodos detectaron niveles de expresión comparables. Estos resultados indican que los parámetros obtenidos de gusanos individuales son fiables.

Aplicación de worm-to-CT acoplada a la tecnología de nanofluídica para estimar los parámetros de expresión génica de un solo gusano

Debido a que el chip de matriz única permite la supervisión de hasta 96 transcripciones de destino en 96 muestras individuales, por lo tanto, es adecuado para monitorear la variabilidad individual en la expresión de transcripción entre gusanos individuales. La Figura 6A presenta un resultado representativo que muestra la expresión media de múltiples transcripciones hsp de gusanos individuales después de un choque térmico corto. Como se observa en la figura, la variabilidad en la expresión de transcripciones difirió dramáticamente entre diferentes genes (Figura 6A). Para obtener más información, el coeficiente de variación (CV) se calculó dividiendo la desviación estándar por la media de los niveles de expresión²⁶ (Figura 6B). Se supervisaron tres genes cuyos valores de CV han sido previamente estimados por métodos alternativos (datos inéditos). Dos transcripciones estables(ife-1 y Y45F10D.4)y una variable(nlp-29²⁷⁾mostraron su variabilidad esperada. El gráfico también muestra claramente la conocida relación inversa entre los valores de variabilidad y los niveles de expresión²⁶ (Figura 6B).

Las réplicas técnicas son de suma importancia para garantizar la reproducibilidad al utilizar muestras a granel. Sin embargo, este no es necesariamente el caso de los experimentos de una sola célula^14,15,28. Para determinar si el uso de réplicas técnicas es necesario para la estimación de parámetros al utilizar muestras de un solo gusano, se cosecharon 28 gusanos individuales, tras un breve choque térmico, y se procesaron utilizando triplicados técnicos. Se compararon los valores cv calculados a partir de datos de un solo gusano obtenidos en triplicato (puntos azules en la Figura 7,CV técnico) en comparación con los de cada transcripción obtenida de gusanos individuales (puntos rojos en la Figura 7,variabilidad biológica). Por cada transcripción probada, los CV técnicos eran inferiores a los CV biológicos, lo que indica que no se requerían triplicatos técnicos para la estimación de parámetros. El hecho de que no se requieran réplicas técnicas aumenta el rendimiento del experimento sin comprometer la calidad.

Figura 1: Descripción general del Protocolo de gusano a TC.
Esta figura muestra una breve descripción general de los diferentes pasos necesarios para ejecutar gusanos a través del protocolo worm-to-CT. Se muestran dos métodos opcionales para el paso de transcripción inversa; estos son métodos intercambiables para cualquier tipo de chip. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Visión general de la preparación y funcionamiento del qPCR nanofluídico.
Esta figura representa los preparativos para ejecutar el sistema qPCR nanofluídico utilizando un chip multi-matriz y un chip de una sola matriz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El protocolo de gusano a TC en muestras masivas proporcionó resultados fiables.
Comparación del protocolo de gusano a TC con la extracción regular de guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo²² en muestras a granel. En consonancia con los hallazgos anteriores, en hsf-1(sy441)mutantes²³, los niveles de transcripciones hsp en respuesta a choque de calor disminuyeron. Los histogramas anteriores representan la inducción de hsp-70 en ausencia de (-), o después (+) un choque térmico corto de 30 min a 34 °C. El cDNA se obtuvo utilizando la extracción de guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo aplicada a 1.000 gusanos (izquierda) o utilizando el método de gusano a TC aplicado a 30 gusanos agrupados (derecha). Se compararon los niveles de expresión de hsp-70 por 100 ng de ARN total obtenido por cada método. Como era de esperar, en hsf-1(sy441) la inducción transcripcional de hsp-70 en respuesta al choque térmico disminuyó significativamente en un 82,7% utilizando guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo y en un 92,3% utilizando el método worm-to-CT. Los niveles de ARNM de los genes objetivo se normalizaron contra el promedio de los tres genes de limpieza cdc-42, pmp-3y ire-1. Cada punto representa una réplica biológica. Los datos se transformaron para su análisis estadístico, ya que no cumplían los convenios necesarios para el análisis paramétrico. El análisis estadístico se realizó utilizando un ANOVA unidireccional RM utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Tipo salvaje = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Las barras denotan el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los patrones de expresión eran consistentes entre los sistemas qPCR estándar y qPCR nanofluídicos.
(A) El nivel de expresión de ARNm-3 (A), sma-10 (B) o dnj-26 (C) se determinó a través de qPCR regular y qPCR nanofluídico (chip multi-matriz) a partir de tres réplicas biológicas de cDNA generadas a través de Gusano a TC de la cepa de tipo salvaje (N2) y la cepa knockout dbl-1(nk3) ^25. Se determinaron niveles relativos de expresión de ARNm para cada cepa utilizando el método Delta-Ct²¹. El cambio de pliegue se determinó dividiendo los niveles de expresión obtenidos en gusanos dbl-1(nk3) por los niveles de ARNM correspondientes en la cepa N2. Como se muestra en el panel A,los patrones eran consistentes para ambos métodos en cada réplica biológica individual. (B) y (C) son los mismos que (A) para los niveles de sma-10 y dnj-26 mRNA, respectivamente. Los niveles objetivo de ARNm se normalizaron con los genes de limpieza cdc-42 y pmp-3. Se calculó un análisis estadístico para cada gen utilizando una prueba en T emparejada comparando los resultados de las tres réplicas biológicas producidas a través de qPCR estándar y las generadas a través de qPCR nanofluídico. Los valores P de estas comparaciones fueron 0,3113, 0,2635 y 0,3481 para sma-3, sma-10y dnj-26,respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: El uso del método de gusano a TC en muestras masivas o en gusanos individuales proporcionó niveles de expresión similares cuando se normalizó por gusano.
Los niveles de expresión de (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4, y (C) hsp-70 (C12C8.1) fueron analizados en animales adultos jóvenes en ausencia de choque térmico ya sea mediante la realización de gusano a TC en una mayor parte de 25 animales, o en 36 individuos individuales. Cuando los datos se normalizaron por gusano, no hubo ninguna diferencia significativa entre los niveles obtenidos por gusano para cada transcripción utilizando ambos métodos. Los niveles de ARNM de los genes objetivo se normalizaron con respecto a la media de los tres genes de limpieza cdc-42, pmp-3y ire-1. Las barras representan el error estándar de la media. Estadísticas = t-test emparejado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Rt-qPCR de alto rendimiento en gusanos individuales que utilizan el método worm-to-CT podría monitorear la variabilidad inter-individual en la expresión génica.
(A) Los niveles medios de expresión de 53 transcripciones obtenidas tras la exposición a un choque térmico corto (30 min a 34 °C). Las cajas representan la distribución de la expresión media de ARNm de gusanos individuales (se utilizó un promedio de tres réplicas técnicas por gusano individual). Los puntos representan niveles de expresión en 28 gusanos individuales. Los niveles de ARNM de los genes objetivo se normalizaron con respecto a la media de los tres genes de limpieza cdc-42, pmp-3y ire-1. (B) El coeficiente de variación²⁶ (CV) en función de la expresión media de ARNm para 53 transcripciones después de la exposición a un choque térmico corto se calculó a partir de 28 animales individuales (datos sin procesar que se muestran en el panel B). El conjunto de transcripciones incluye la transcripción variable nlp-29 ²⁷ y dos transcripciones estables(ife-1 y Y45F10D.4; datos inéditos). El CV es la relación de la desviación estándar con la media. Este CV se utilizó para estimar la variabilidad inter-individual en la expresión de transcripción entre gusanos individuales. Como era de esperar, la variabilidad inter-individual se escaló con niveles de expresión media disminuidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Las réplicas técnicas no eran necesarias al analizar la variabilidad inter-individual en la expresión génica utilizando un chip nanofluídico.
Los datos presentados en este gráfico se obtuvieron en 28 gusanos individuales después de un choque térmico corto (30 min a 34 °C). Cada punto rojo representa el coeficiente de variación (CV) de los niveles medios de expresión de transcripción para una transcripción tal como se indica entre 28 gusanos individuales (bio CV). Cada punto azul representa el CV de los niveles de expresión entre tres réplicas técnicas obtenidas de un solo gusano, según la transcripción a la que se dice (CV técnico). Este gráfico muestra que la variabilidad técnica (entre las réplicas técnicas) era mucho menor que la variabilidad biológica (entre gusanos individuales), lo que sugiere que no es necesario realizar réplicas técnicas en una matriz de expresión génica nanofluídica al ensayo de la expresión génica en gusanos individuales, de forma similar a los estudios unicelulares^14,15,28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Planifique el diseño de un chip de varias matrices. La tabla anterior muestra un diseño simple que se puede utilizar al planear una ejecución de chip de varias matrices. A la izquierda están los espacios que deben llenarse con los objetivos de primer de interés y a la derecha son espacios que deben llenarse con las muestras de interés. Cada ensayo y matriz de muestras se empareja en cuanto a números a través del chip. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Planifique el diseño de un chip de matriz única. La tabla anterior muestra un diseño simple que se puede utilizar al planear una ejecución de chip de una sola matriz. A la izquierda hay espacios que deben llenarse de objetivos de interés y a la derecha son espacios que deben llenarse con las muestras de interés. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Lista de imprimaciones RT-qPCR utilizadas en este estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Cuadro suplementario 1: Imprimaciones de la base de datos de imprimaciones RT-qPCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

En este artículo, se muestra que el protocolo worm-to-CT es un método rápido y eficiente para extraer ARN de gusanos individuales o un pequeño grupo de gusanos. El alto rendimiento ofrecido por el sistema nanofluídico lo hace ideal para la cuantificación de mediciones de variabilidad inter-individuales. Además, la alta sensibilidad de este método permite la detección de genes expresados a niveles bajos que caen por debajo de la detección cuando se utilizan tecnologías de ARN-seq de un solo gusano⁹.

Al considerar la elección del método para preparar cDNA a partir de gusanos individuales. Ly et al.²⁹ optimizó un protocolo que se basa en la proteinasa K para la digestión de cutículas. La cutícula es un obstáculo importante para el aislamiento de moléculas de gusanos y proteinasa K proporciona un método eficaz para romperlo. Sin embargo, la proteína K tiene que estar inactivada por calor para poder utilizar enzimas para la transcripción inversa. Mientras que Ly et al. utilizaron una exposición de 10 minutos a 96 °C, este paso se evitó en este protocolo porque el ARN es fácilmente degradable. En lugar de usar la proteína K, se utilizaron ciclos repetidos de congelación y descongelación para romper la cutícula. El congelamiento-deshielo es un método eficaz para romper la cutícula porque más ARN se puede aislar por gusano. Ly et al. informan que el ARN total extraído por gusano es de 35 ng usando proteinasa K, mientras que este protocolo obtiene 51,75 ng ± 6,74 SEM de ARN total por gusano. La evitación de la exposición al calor junto con los pasos de preamplificación aparentemente amplía el rango dinámico de detección de Worm-to-CT en comparación con los protocolos estándar. Informe de valores absolutos de Ct de 21,1 ± 0,15 para hsp-16,2 y 22,8 ± 0,17 para hsp-70 después del choque térmico. Utilizando las mismas condiciones de choque térmico (1 h a 30 °C), este protocolo obtiene valores absolutos de Ct de 17,93 ± 0,57 para hsp-16,2 y 21,13 ±0,33 para hsp-70. Esto indica que el método de lisis congelación-deshielo proporciona mayores rendimientos de ARN y es más apropiado para transcripciones de baja expresada.

Los sistemas nanofluídicos son ideales cuando se investiga un conjunto determinado de transcripciones de objetivos y el uso de muestras más pequeñas (chip multi-matriz) o más grandes (chip de una sola matriz) que permiten la adaptación a la escala del experimento. Para obtener una imagen imparcial de todas las transcripciones expresadas en un solo gusano, la elección obvia es utilizar la secuenciación de ARN. Sin embargo, si el enfoque del experimento es un conjunto más pequeño pero todavía relativamente grande de genes objetivo, es más rentable utilizar este protocolo, siempre que el investigador tenga acceso a una máquina PCR de nanofluídica. El costo de los reactivos del sistema nanofluídico y un chip de una sola matriz se estima en aproximadamente £ 13 por gusano, mientras que los costos de los reactivos para la secuenciación de un solo gusano serían de aproximadamente £ 60 por gusano, sin incluir los costos de secuenciación.

Al considerar qué plataforma PCR utilizar, el método Worm-to-CT acoplado a qPCR nanofluídico ofrece ventajas con respecto al tiempo y el rendimiento. Es posible obtener 9.216 resultados rt-qPCR en aproximadamente 2 días de trabajo, mientras que la amplificación del mismo número de objetivos utilizando una plataforma qPCR estándar tomaría aproximadamente 5 semanas de trabajo utilizando 96 ensayos de placa de pozo, ejecutando cuatro placas al día. Sin embargo, si el número de objetivos a probar es menor, entonces es más rentable usar Worm-to-CT junto con una máquina qPCR estándar. Los chips de matriz única no se pueden volver a ejecutar, por lo que ejecutar pozos vacíos disminuye la rentabilidad.

Una limitación del método es la formación potencial de atenuadores de imprimación durante el paso multiplexante, pero esto ocurre en menos del 1% de los casos. Aunque el protocolo de gusano a TC es eficiente y proporciona resultados fiables cuando se aplica a gusanos individuales, hay una tasa de fallos de aproximadamente el 5%, que probablemente corresponde a casos en los que el gusano permanece atrapado en la tapa o en la parte superior del tubo durante el paso de recolección.

Juntos, este método versátil y confiable ofrece un mayor rendimiento y sensibilidad en comparación con técnicas más estándar. Este método puede ser muy útil para la validación de pantallas de alto rendimiento y es una excelente opción para monitorear o validar los niveles de expresión génica de un solo gusano. Este método se puede aplicar a otras técnicas desafiantes, como la cuantificación de la expresión génica de tejidos aislados. Por ejemplo, el aislamiento de tejidos completos, como el intestino, las gónadas o las células aisladas por los FACs, proporciona suficiente material para realizar experimentos de secuenciación de ARN. Sin embargo, cantidades limitadas de material a menudo conducen a lecturas duplicadas, lo que impide la cuantificación de transcripciones raras. En este escenario, el uso de tecnología basada en nanofluídica debe proporcionar una mayor sensibilidad a los experimentos y aumentar la rentabilidad si los investigadores necesitan monitorear sólo un subconjunto de todas las transcripciones en esos tejidos o células.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100µM stock primers for genes of interest.
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	for 96.96 chip (Single-Array Chip)
2X Assay Loading Reagent	Fluidigm	100-7611
384 well plates
8-strip PCR tubes
96 well ice block
96 well plates
96.96 Dynamic Array IFC	Fluidigm	BMK-M-96.96	Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip"
96-well sealing tape
BioMark & EP1 Software	Fluidigm	101-6793	Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software
BioMark or BioMark HD system	Fluidigm	100-2451 K1	Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler"
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs	Fluidigm	89000021	Referenced throughout manuscript as "control line fluid"
DNA Suspension buffer	TEKnova	T0021
domed PCR caps
Exonuclease I	New England BioLabs	M0293L
Exonuclease I reaction buffer	New England BioLabs	B0293S
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent	Fluidigm	100-7673	referenced throughout manuscript as "sample reagent"
FLEXsix Gene Expression IFC	Fluidigm	100-6308	referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide	Fluidigm	68000088	This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.
IFC Controller MX	Fluidigm	68000112 I1	Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine"
IFC Controllers SOFTWEAR	Fluidigm	100-2297	Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX
liquid nitrogen in dewar
Microcentrifuge	StarLab	C1301B-230V	Used to spin down PCR tube strips in the protocol.
Nuclease Free Water
plate spinner	Labnet	K4050725	mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit	invitrogen	4402955	This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.
PreAmp Master Mix	Fluidigm	100-5580, 100-5581
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions	Fluidigm	100-6299	One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX	Bio-Rad Laboratories	172-5211	referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix"
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA	TEKnova	T0224	Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000031	Referenced throughout the text as "thermal mixer"
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform"
Warm water bath