Electroencefalograma de video continuo durante la hipoxia-isquemia en ratones neonatales

Resumen

Este manuscrito describe un método para grabaciones continuas de video EEG utilizando electrodos de profundidad múltiple en ratones neonatales sometidos a hipoxia-isquemia.

Resumen

La isquemia por hipoxia es la causa más común de convulsiones neonatales. Los modelos animales son cruciales para comprender los mecanismos y la fisiología subyacentes a las convulsiones neonatales y la isquemia por hipoxia. Este manuscrito describe un método para el monitoreo continuo de video electroencefalograma (EEG) en ratones neonatales para detectar convulsiones y analizar el fondo de EEG durante la isquemia por hipoxia. El uso de video y EEG en conjunto permite la descripción de la semiología de convulsiones y la confirmación de convulsiones. Este método también permite el análisis de espectrogramas de potencia y tendencias de patrones de fondo de EEG durante el período de tiempo experimental. En este modelo de isquemia por hipoxia, el método permite el registro de EEG antes de la lesión para obtener una línea de base normativa y durante la lesión y la recuperación. El tiempo total de monitoreo está limitado por la incapacidad de separar a los cachorros de la madre durante más de cuatro horas. Aunque, hemos utilizado un modelo de convulsiones hipóxico-isquémicas en este manuscrito, este método para el monitoreo de EEG de video neonatal podría aplicarse a diversos modelos de enfermedades y convulsiones en roedores.

Introducción

La encefalopatía isquémica hipóxica (HIE) es una afección que afecta a 1,5 de cada 1000 recién nacidos anualmente y es la causa más frecuente de convulsiones ^{neonatales1,2}. Los bebés que sobreviven están en riesgo de diversas discapacidades neurológicas como parálisis cerebral, discapacidad intelectual y ^{epilepsia3,4,5}.

Los modelos animales juegan un papel crítico en la comprensión e investigación de la fisiopatología de la isquemia por hipoxia y las convulsiones ^{neonatales6,7}. Se utiliza un modelo de Vannucci modificado para inducir isquemia por hipoxia (HI) en el día 10 postnatal (p10)^7,8. Los cachorros de ratón de esta edad se traducen neurológicamente aproximadamente al término completo neonato ^humano9.

La monitorización continua por video electroencefalografía (EEG) utilizada junto con este modelo de lesión permite una mayor comprensión y caracterización de las convulsiones isquémicas hipóxicas neonatales. Estudios previos han utilizado diversos métodos para analizar las convulsiones neonatales en roedores, incluidas grabaciones de video, grabaciones limitadas de EEG y grabaciones de EEG de telemetría10,11,12,13,14,15,16. En el siguiente manuscrito, discutimos en profundidad el proceso de grabación de video continuo EEG en cachorros de ratón durante la hipoxia-isquemia. Esta técnica para el monitoreo continuo de video EEG en cachorros de ratón neonatales podría aplicarse a una variedad de modelos de enfermedades y convulsiones.

Protocolo

Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia.

1. Edificio de electrodos / edificio de cables

1. Utilice un cable de acero inoxidable con aislamiento unipolar (diámetro desnudo de 0,005", recubierto de 0,008") para hacer un electrodo que esté conectado con un conector de enchufe hembra (conector de receptáculo hembra 0.079).
2. Utilice un cable especial hecho a medida para conectar animales al amplificador.
   1. Conecte un conector macho de 4 pines (conector macho 0.079") a un amplificador operacional (amplificador operacional) de impedancia de ganancia de unidad de 4 canales. Conecte una resistencia de 10K a los cables que se conectan a la batería de 9 V. Un cable de tierra no conectado al amplificador operacional actúa como el punto medio de la batería.
   2. Conecte un extremo del cable (AWG, 0.012" OD) al amplificador operacional y conecte el otro extremo del cable al amplificador.

2. Cirugía de implantación de electrodos

1. Anestesiar al cachorro (día postnatal 9) con 4-5% de isoflurano en una capucha de flujo descendente. Antes del inicio del procedimiento, inyecte a los cachorros con bupivacaína (0.02-0.05 mL, infiltración local subcutánea al 0.25%).
2. Una vez que el animal está inmóvil, transfiéralo a una etapa estereotáctica con un cono nasal. Use el reverso de la barra de la oreja, ya que es suave para mantener la cabeza firme. A esta edad, los cachorros no tienen una oreja completamente desarrollada para usar el extremo puntiagudo de la barra de la oreja.
3. Reduzca el flujo de isoflurano y manténgalo en 2.5-3%. Vigile la respiración constante del cachorro durante todo el procedimiento quirúrgico. Pellizque la cola para verificar la respuesta al dolor y luego proceda a la incisión.
4. Esterilizar el área de incisión en el cráneo con betadina y alcohol (3 ciclos de yodo alterno y etanol al 70%). Cubra la parte circundante del cuerpo de tal manera que la región de la incisión sea visible.
5. Abra el cuero cabelludo anterior-posterior desde ligeramente por encima de los ojos y retraiga aproximadamente 0,5 cm de piel. Reposicione la cabeza del ratón en la etapa estereotáxica para que la piel tire hacia afuera exponiendo el cráneo.
6. Aplique peróxido de hidrógeno en el cráneo con un hisopo de algodón y raspe el cráneo limpio con una cuchilla de bisturí. El cráneo es muy suave; tenga cuidado al raspar.
7. Aplique una gota (aproximadamente 50 μL) de adhesivo y extiéndalo alrededor del área expuesta del cráneo usando su aplicador. Exponer a la luz UV durante 40 s para fijar el adhesivo.
8. Mida las coordenadas utilizando el bregma expuesto como referencia. Implantar electrodos bilateralmente en la región CA1 del hipocampo [-3,5 mm Dorsal-Ventral (DV), ±2 mm Medial-Lateral (ML), -1,75 mm Profundo (D)] y bilateralmente en la corteza parietal [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] y un electrodo de referencia en el ^cerebelo17. Use una aguja de 32 G para crear un agujero en la región marcada.
9. Limpie la sangre de la superficie del cráneo. Electrodos inferiores unidos al conector de la cavidad femenina en el cerebro con la ayuda del brazo estereotáxico y fijarlos en su lugar con acrílico dental. Implantar el electrodo en el cerebro. El auricular conector de enchufe se encuentra en la parte superior del cráneo pegado por acrílico dental.
10. Inyecte ketoprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea en la región interescapular una vez fijado el electrodo. Coloque a los cachorros de nuevo con la madre.
    NOTA: Presente la mitad de la camada con los auriculares a la vez a la madre en lugar de presentarlos uno a la vez. Esto evitará que la madre dañe los auriculares del cachorro.

3. Configuración y registro del EEG (línea de base/pre-lesión)

1. Después de 24 h de recuperación después de la implantación del electrodo, coloque a cada animal en una cámara de plexiglás calentada (37 ° C) hecha a medida para el registro de EEG. Esta cámara también servirá como una cámara de hipoxia.
2. Conecte a los cachorros en la cámara a un sistema de monitoreo de video-EEG a través de un cable flexible (cable op-amp hecho a medida).
   NOTA: Con los auriculares en su lugar, los ratones son libremente móviles y no exhiben ninguna diferencia en el comportamiento. Una vez conectados a los cables de los electrodos, los cables deben ajustarse dentro de la correa de la cámara para proporcionar la cantidad correcta de holgura para que el cachorro pueda moverse libremente por toda la cámara.
3. Digitalice los datos de EEG a 1000 Hz con ganancia de 1K utilizando un amplificador de hierba. Revise la señal EEG (filtro de paso de banda entre 3-70 Hz) más tarde utilizando software (por ejemplo, LabChart Pro).
4. Registre un EEG basal previo a la lesión durante 30 minutos antes de desconectar a los animales para el procedimiento de ligadura de la arteria carótida.

4. Ligadura de la arteria carótida izquierda

1. Anestesiar al cachorro (día postnatal 10) con 4-5% de isoflurano en una capucha de flujo descendente y colocarlos en una configuración especialmente dispuesta en una almohadilla de baño de agua. Coloque el animal en decúbito supino y asegure las extremidades anteriores con cinta de papel.
   1. Reducir el flujo de isoflurano a 2-3%. Pellizque la cola para la respuesta al dolor y controle la respiración durante todo el procedimiento.
2. Esterilizar el área de incisión (entre la mandíbula y la clavícula) en el lado izquierdo del cuello con betadina y alcohol (3 ciclos de yodo alterno y etanol al 70%).
3. Haga una incisión de aproximadamente 1 cm de largo en el lado izquierdo del cuello usando microescisores. Usando un microscopio de disección, retraiga cuidadosamente el tejido subcutáneo y la piel para exponer la arteria carótida. Tenga cuidado de identificar el nervio vago (que corre lateral a la arteria) y sepárelo y retraiga delicadamente de la arteria.
4. Enhebrar una sutura de seda estéril de 5 cm de largo debajo de la arteria usando microfuerzas. Ata una sutura de doble anudado alrededor de la arteria para ocluir el flujo.
5. Corte el exceso de sutura y cierre la arteria expuesta tirando hacia atrás del tejido subcutáneo y la piel. Use la unión veterinaria para sellar la incisión.
6. Coloque al animal de nuevo en monitoreo continuo de EEG en una cámara a temperatura ambiente, que se coloca en un colchón que se calienta. Realice controles de temperatura infrarrojos puntuales de la temperatura del núcleo del cachorro para evitar abrir la cámara. Permita que el animal se recupere durante 1 h antes de la hipoxia.

5. EEG e hipoxia

1. Monitoree continuamente _FiO2 (fracción de oxígeno inspirado) dentro de la cámara a través de un monitor de oxígeno.
2. Enjuague la cámara con 60 L/min de 100% _N2 y 0.415 L/min para 100% de _O2. Una vez que la saturación de oxígeno en la cámara alcanza el 12%, disminuya el flujo de N2 a 10 L / min mientras mantiene el flujo de _O2 sin cambios. Con pequeños ajustes, mantenga el _FiO2 al 8% durante 45 min.
3. Después de 45 min de exposición a la hipoxia, devuelva la _FiO2 al 21%.
4. Haga que los cachorros se recuperen en la cámara y monitoree el EEG durante 2 h después de la hipoxia.
5. Después de completar el período de grabación, desconecte los ratones de la grabación de EEG y regrese a la madre.

6. Análisis EEG

1. Analice el archivo EEG con video en LabChart Pro. Haga que un investigador ciego marque el EEG para detectar convulsiones y patrones de ^fondo17. Las convulsiones se definen como un evento electrográfico de duración superior a 10 segundos con descargas rítmicas de onda aguda de alta frecuencia (≥3x basal) con clara ^evolución17.
2. Haga que un segundo investigador ciego revise los eventos marcados al azar para el acuerdo.
3. Revisar el video asociado para cada evento electrográfico marcado y analizar de acuerdo con la puntuación de convulsión conductual del roedor ^neonatal16. Brevemente, esta puntuación oscila entre 0-6 (inmovilidad a comportamiento tónico-clónico severo). Para caracterizar aún más la semiología convulsiva, analice el comportamiento para la lateralidad (movimientos multifocales / bilaterales vs. focales / unilaterales vs. mixtos).
4. Cree un espectrograma de potencia. Utilice una transformada rápida de Fourier con una ventana de datos de Cosine-Bell con un tamaño de 1024 puntos de datos. Cree un eje X suave en el espectrograma con la ayuda de una superposición de ventanas del 87,5%. Exprese la potencia como ^μV218.

Resultados

Semiología de convulsiones

La exposición a hipoxia-isquemia neonatal da lugar a convulsiones generalizadas y focales en ratones (Figura 1A-C). Las grabaciones de video EEG permiten que los hallazgos electrográficos se correlacionen con el comportamiento en video. Estos comportamientos se puntuaron utilizando una puntuación de convulsiones conductuales de roedores neonatales (BSS) publicada ^{anteriormente16}. Adem...

Discusión

Hemos presentado un modelo para la monitorización continua de video-EEG en ratones neonatales durante las convulsiones hipóxico-isquémicas. El análisis de video en conjunto con EEG permite la caracterización de la semiología de convulsiones. El análisis de EEG permite la extracción de espectrogramas de potencia y el análisis de amplitud de fondo.

La colocación correcta y cuidadosa de los electrodos es crucial en este protocolo, ya que las lesiones durante la colocación de los electr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SURGERY
Ball Point Applicator	Metrex Research	8300-F	i-bond applicator
Cranioplast (Powder/Resin)	Coltene	H00383	Perm Reline/Power
I-Bond	Kulzer GmbH, Germany
LOOK Silk Suture	Surgical Specialities Corporation	SP115	LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture
RS-5168 Botvin Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5168	Forcep for surgery/ligation
RS-5138 Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5138	Forcep for surgery/ligation
UV light for I-Bond	Blast Lite By First Media	BL778	UV ligth for I-bond
Vannas Microdissecting Scissor	Roboz Surgical Instrument	RS5618	Scissor for ligation
Vet Bond	3M Vetbond	1469SB	Vet Glue
HYPOXIA
Hypoxidial	Starr Life Science
Oxygen sensor	Medical Products		MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig
EEG RECORDING
Female receptacle connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	832-10-024-10-001000	Ordered from Digikey
Grass Amplifier	Natus Neurology Incorporated		Grass Product
LabChart Pro	ADI Instruments		Software to run the system
Male Socket Connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	833-43-024-20-001000	Ordered from Digikey
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2274CD	TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2272ACDR	TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier
Stainless Steel wire	A-M Systems	791400	0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft
Ultra-Flexible Wire	McMaster-Carr	9564T1	36 Gauze wire of various color