Непрерывная видеоэлектроэнцефалограмма при гипоксии-ишемии у неонатальных мышей

Резюме

В данной рукописи описан метод непрерывной видеозаписи ЭЭГ с использованием многоглубочных электродов у неонатальных мышей, перенесших гипоксию-ишемию.

Аннотация

Гипоксия ишемия является наиболее распространенной причиной неонатальных судорог. Животные модели имеют решающее значение для понимания механизмов и физиологии, лежащих в основе неонатальных судорог и гипоксии ишемии. В данной рукописи описан метод непрерывного мониторинга видеоэлектроэнцефалограммы (ЭЭГ) у неонатальных мышей для выявления судорог и анализа фона ЭЭГ при гипоксии ишемии. Использование видео и ЭЭГ в сочетании позволяет описать семиологию судорог и подтвердить судороги. Этот метод также позволяет анализировать силовые спектрограммы и фоновые тренды ЭЭГ за экспериментальный период времени. В этой модели гипоксии ишемии метод позволяет регистрировать ЭЭГ до травмы для получения нормативного исходного уровня, а также во время травмы и восстановления. Общее время наблюдения ограничено невозможностью отделить детенышей от матери дольше четырех часов. Хотя мы использовали модель гипоксически-ишемических припадков в этой рукописи, этот метод для неонатального видеомониторинга ЭЭГ может быть применен к различным моделям заболеваний и судорог у грызунов.

Введение

Гипоксическая ишемическая энцефалопатия (HIE) является состоянием, которое поражает 1,5 из 1000 новорожденных ежегодно и является наиболее распространенной причиной неонатальных ^{судорог1,2}. Младенцы, которые выживают, подвергаются риску различных неврологических нарушений, таких как церебральный паралич, умственная отсталость и эпилепсия3,4,5.

Животные модели играют решающую роль в понимании и исследовании патофизиологии гипоксии ишемии и неонатальных ^{судорог6,7}. Модифицированная модель Ваннуччи используется для индуцирования гипоксии ишемии (HI) на постнатальный день 10 (p10)^7,8. Мышиные детеныши этого возраста переводят неврологически примерно на полный срок новорожденного ^{человека9}.

Непрерывный видеомониторинг электроэнцефалографии (ЭЭГ), используемый в сочетании с этой моделью травмы, позволяет лучше понять и охарактеризовать гипоксические ишемические судороги новорожденных. В предыдущих исследованиях использовались различные методы анализа неонатальных судорог у грызунов, включая видеозаписи, ограниченные записи ЭЭГ и телеметрические записи ЭЭГ10,11,12,13,14,15,16. В следующей рукописи мы подробно обсудим процесс записи непрерывной видеоЭГ у детенышей мышей во время гипоксии-ишемии. Этот метод непрерывного видеомониторинга ЭЭГ у новорожденных детенышей мышей может быть применен к различным моделям заболеваний и судорог.

протокол

Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Вирджинии.

1. Строительство электродов/кабелей

1. Используйте однополярную изолированную проволоку из нержавеющей стали (голый диаметр 0,005 дюйма, покрытие 0,008 дюйма) для изготовления электрода, соединенного с разъемом гнезда (разъем гнезда 0,079).
2. Используйте специальный кабель, изготовленный на заказ, чтобы подключить животных к усилителю.
   1. Подключите штекерный 4-контактный разъем (разъем Male 0.079") к 4-канальному импедансному усилителю (операционному усилителю). Подключите резистор 10K к проводам, которые подключаются к аккумулятору 9 В. Провод заземления, не подключенный к операционному усилителю, действует как средняя точка батареи.
   2. Подключите один конец кабеля (AWG, 0,012" OD) к операционному усилителю и подключите другой конец кабеля к усилителю.

2. Операция по имплантации электродов

1. Обезболить щенка (9-й послеродовой день) 4-5% изофлураном в вытяжке нисходящего потока. Перед началом процедуры детям вводят бупивакаин (0,02-0,05 мл, 0,25% подкожной местной инфильтрации).
2. Как только животное станет неподвижным, переведите в стереотаксическую стадию с носовым конусом. Используйте обратную сторону ушной перекладины, так как она мягкая, чтобы удерживать голову устойчиво. В этом возрасте у щенков нет полностью развитого уха, чтобы использовать заостренный конец ушной балки.
3. Уменьшите расход изофлурана и поддерживайте его на уровне 2,5-3%. Следите за устойчивым дыханием щенка на протяжении всей процедуры операции. Зажмите хвост, чтобы проверить болевую реакцию, а затем приступайте к разрезу.
4. Стерилизуют область разреза на черепе бетадином и спиртом (3 цикла чередования йода и 70% этанола). Задрапируйте окружающую часть тела так, чтобы была видна область разреза.
5. Откройте передне-заднюю часть головы слегка над глазами и втяните примерно 0,5 см кожи. Переместите голову мыши на стереотаксическую стадию так, чтобы кожа вытягивала наружу обнажающий череп.
6. Нанесите перекись водорода на череп с помощью ватного тампона и очистите череп с помощью лезвия скальпеля. Череп очень мягкий; соблюдайте осторожность во время выскабливания.
7. Нанесите одну каплю (примерно 50 мкл) клея и распределите ее по открытой области черепа с помощью аппликатора. Подвергайте воздействию ультрафиолетового излучения в течение 40 с, чтобы установить клей.
8. Измерьте координаты, используя открытую брегму в качестве эталона. Имплантируют электроды двусторонне в область CA1 гиппокампа [-3,5 мм дорсально-вентральный (DV), ±2 мм медиально-латеральный (ML), -1,75 мм глубиной (D)] и двусторонне в теменную кору [-1,22 мм DV, ±0,5 мм ML, -1 мм D] и опорный электрод в ^{мозжечок17}. Используйте иглу 32 G, чтобы создать отверстие в отмеченной области.
9. Очистите кровь от поверхности черепа. Нижние электроды крепятся к женскому разъему гнезда в мозг с помощью стереотаксической руки и фиксируются на месте зубным акрилом. Имплантируйте электрод в мозг. Гнездо разъема гарнитуры находится поверх черепа, склеенного зубным акрилом.
10. Вводят кетопрофен (5 мг/кг) подкожно в межлопастную область после фиксации электрода. Поместите щенков обратно к матери.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Представьте половину помета с гарнитурой сразу матери, а не вводите их по одному. Это предотвратит повреждение матерью гарнитуры щенка.

3. Настройка и запись ЭЭГ (исходный/до травмы)

1. После 24 ч восстановления после имплантации электрода поместите каждое животное в нагретую (37 °C) изготовленную на заказ камеру из оргстекла для записи ЭЭГ. Эта камера также будет служить камерой гипоксии.
2. Подключите щенков в камере к системе мониторинга видео-ЭЭГ с помощью гибкого кабеля (изготовленный на заказ кабель операционного усилителя).
   ПРИМЕЧАНИЕ: С гарнитурой на месте мыши свободно мобильны и не проявляют никаких различий в поведении. После прикрепления к электродным проводам провода должны быть отрегулированы внутри троса камеры, чтобы обеспечить нужное количество слабины, чтобы щенок мог свободно перемещаться по всей камере.
3. Оцифруйте данные ЭЭГ при частоте 1000 Гц с коэффициентом усиления 1K с помощью травяного усилителя. Просмотрите сигнал ЭЭГ (полосовой фильтр между 3-70 Гц) позже с помощью программного обеспечения (например, LabChart Pro).
4. Запишите исходную ЭЭГ до травмы за 30 минут до отключения животных для процедуры перевязки сонной артерии.

4. Перевязка левой сонной артерии

1. Обезболить щенка (10-й послеродовой день) 4-5% изофлураном в капюшоне с нисходящим потоком и поместить его на специально организованную установку на прокладке для водяной бани. Расположите животное лежа на спине и закрепите передние конечности бумажной лентой.
   1. Снижают расход изофлурана до 2-3%. Зажмите хвост для болевой реакции и контролируйте дыхание на протяжении всей процедуры.
2. Стерилизуют область разреза (между нижней челюстью и ключицей) на левой стороне шеи бетадином и спиртом (3 цикла чередования йода и 70% этанола).
3. Сделайте разрез длиной примерно 1 см на левой стороне шеи с помощью микросублиц. Используя рассекающий микроскоп, осторожно втягивайте подкожную клетчатку и кожу, чтобы обнажить сонную артерию. Позаботьтесь о том, чтобы идентифицировать блуждающий нерв (идущий латерально к артерии) и деликатно отделить и втянуть его из артерии.
4. Нанизывайте стерильный шелковый шов длиной 5 см под артерию с помощью микрофорсов. Завяжите двойной узелковый шов вокруг артерии, чтобы перекрыть поток.
5. Отрежьте лишний шов и закройте открытую артерию, оттянув назад подкожную клетчатку и кожу. Используйте ветеринарную связь для герметизации разреза.
6. Поместите животное обратно на непрерывный ЭЭГ-мониторинг в камеру комнатной температуры, которая помещается на согревающий матрас. Проведите точечные инфракрасные проверки температуры ядра щенка, чтобы избежать открытия камеры. Дайте животному восстановиться за 1 ч до гипоксии.

5. ЭЭГ и гипоксия

1. Непрерывный мониторинг _FiO2 (фракция вдыхаемого кислорода) в камере с помощью кислородного монитора.
2. Промывайте камеру 60 л/мин 100% _N2 и 0,415 л/мин для 100% _O2. Как только насыщение кислородом в камере достигнет 12%, уменьшите поток N2 до 10 л/мин, сохраняя при этом поток _O2 неизменным. С небольшими корректировками поддерживайте _FiO2 на уровне 8% в течение 45 минут.
3. После 45 мин воздействия гипоксии возвращают _FiO2 до 21%.
4. Пусть детеныши выздоравливают в камере и контролируют на ЭЭГ в течение 2 ч после гипоксии.
5. После завершения периода записи отключите мышей от записи ЭЭГ и вернитесь к матери.

6. Анализ ЭЭГ

1. Проанализируйте файл ЭЭГ с помощью видео в LabChart Pro. Попросите ослепленного исследователя отметить ЭЭГ для судорог и фоновых ^{паттернов17}. Судороги определяются как электрографическое событие продолжительностью более 10 секунд с высокочастотными ритмическими резкими волновыми разрядами (≥3x базовой линии) с четкой ^{эволюцией17}.
2. Пусть второй ослепленный исследователь рассмотрит отмеченные события случайным образом для согласия.
3. Просмотрите связанное видео для каждого отмеченного электрографического события и проанализируйте в соответствии с оценкой поведенческих судорог новорожденных грызунов16. Вкратце, этот балл колеблется от 0-6 (неподвижность до тяжелого тонико-клонического поведения). Чтобы дополнительно охарактеризовать семиологию судорог, проанализируйте поведение на предмет латеральности (мультифокальные/двусторонние движения против фокальных/односторонних против смешанных).
4. Создайте степенную спектрограмму. Используйте быстрое преобразование Фурье с окном данных Cosine-Bell размером 1024 точки данных. Создайте гладкую ось X в спектрограмме с помощью перекрытия окна на 87,5%. Выражайте мощность как ^μV218.

Результаты

Судорожная семиология

Воздействие неонатальной гипоксии-ишемии приводит как к генерализованным, так и к фокальным судорогам у мышей (рисунок 1A-C). Видеозаписи ЭЭГ позволяют соотносить электрографические результаты с поведением на видео. Эт...

Обсуждение

Представлена модель непрерывного видео-ЭЭГ мониторинга у неонатальных мышей во время гипоксически-ишемических припадков. Видеоанализ в сочетании с ЭЭГ позволяет охарактеризовать семиологию судорог. Анализ ЭЭГ позволяет извлекать силовые спектрограммы и фоновый амплитудный анализ.<...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SURGERY
Ball Point Applicator	Metrex Research	8300-F	i-bond applicator
Cranioplast (Powder/Resin)	Coltene	H00383	Perm Reline/Power
I-Bond	Kulzer GmbH, Germany
LOOK Silk Suture	Surgical Specialities Corporation	SP115	LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture
RS-5168 Botvin Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5168	Forcep for surgery/ligation
RS-5138 Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5138	Forcep for surgery/ligation
UV light for I-Bond	Blast Lite By First Media	BL778	UV ligth for I-bond
Vannas Microdissecting Scissor	Roboz Surgical Instrument	RS5618	Scissor for ligation
Vet Bond	3M Vetbond	1469SB	Vet Glue
HYPOXIA
Hypoxidial	Starr Life Science
Oxygen sensor	Medical Products		MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig
EEG RECORDING
Female receptacle connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	832-10-024-10-001000	Ordered from Digikey
Grass Amplifier	Natus Neurology Incorporated		Grass Product
LabChart Pro	ADI Instruments		Software to run the system
Male Socket Connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	833-43-024-20-001000	Ordered from Digikey
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2274CD	TLC2274 Quad Low‐Noise Rail‐to Rail Operational Amplifier
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2272ACDR	TLC2274 Quad Low‐Noise Rail‐to Rail Operational Amplifier
Stainless Steel wire	A-M Systems	791400	0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft
Ultra-Flexible Wire	McMaster-Carr	9564T1	36 Gauze wire of various color