신생아 쥐의 저산소증-허혈 중 연속 비디오 뇌전도

요약

본 원고는 저산소증-허혈을 앓고 있는 신생아 마우스의 다중 깊이 전극을 이용한 연속 비디오 EEG 레코딩방법을 설명합니다.

초록

저산소증 허혈은 신생아 발작의 가장 흔한 원인입니다. 동물 모델은 신생아 발작과 저산소증 허혈의 기전과 생리학을 이해하는 데 중요합니다. 이 원고는 신생아 마우스에서 지속적인 비디오 뇌전도(EEG) 모니터링을 위한 방법을 설명하여 저산소증 허혈 중 발작을 감지하고 EEG 배경을 분석합니다. 비디오 및 EEG를 함께 사용하면 발작 반학에 대한 설명과 발작 확인이 가능합니다. 이 방법은 또한 실험 기간 동안 전력 분광 및 EEG 배경 패턴 동향을 분석할 수 있습니다. 이 저산소증 허혈 모델에서, 방법은 EEG 가 손상 전 과 부상 및 회복 중에 규범적 기준을 얻을 수 있도록 허용한다. 총 모니터링 시간은 새끼를 어머니와 4 시간 이상 분리할 수 없다는 데 의해 제한됩니다. 비록, 우리는이 원고에서 저산소 허혈성 발작의 모델을 사용 했지만, 신생아 비디오 EEG 모니터링을 위한 이 방법은 설치류에 있는 다양한 질병 및 포착 모형에 적용될 수 있었습니다.

서문

저산소 허혈성 뇌병증 (HIE)은 매년 신생아 1000명 중 1.5명에 영향을 미치는 상태이며 신생아 발작의 가장 흔한 원인입니다^1,2. 살아남은 유아는 뇌성 마비, 지적 장애 및 간질^3,4,5와 같은 다양한 신경 장애의 위험이 ^있습니다.

동물 모델은 저산소증 허혈및 신생아 발작의 병리생리학을 이해하고 조사하는 데 중요한 역할을합니다^6,7. 변형된 반누치 모델은 산후 10일째(p10)^7,8에서 저산소증 허혈(HI)을 유도하는 데 사용된다. 이 시대의 마우스 새끼는 신경학적으로 대략 전체 용어 인간 ^neonate9로 번역합니다.

이 상해 모형과 함께 이용된 연속적인 비디오 뇌파학 (EEG) 감시는 신생아 저혈성 허혈성 발작의 추가 이해 그리고 특성화를 허용합니다. 이전 연구는 비디오 녹화, 제한된 EEG 녹음 및 원격 측정 EEG 기록 ^{10,11,12,13,14,15,16}을 포함하여 설치류의 신생아 발작을 분석하기 위한 다양한 방법을 사용^했습니다. 다음 원고에서는 저산소증-허혈 중에 마우스 새끼로 연속 비디오 EEG를 기록하는 과정에 대해 자세히 설명합니다. 신생아 마우스 새끼에서 연속 비디오 EEG 모니터링을위한이 기술은 다양한 질병 및 발작 모델에 적용 될 수있다.

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프로토콜

모든 동물 연구는 버지니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 전극 건물 / 케이블 건물

1. 단극성 절연 스테인리스 스틸 와이어(0.005" 베어 직경, 0.008"코팅)를 사용하여 여성 소켓 커넥터(여성 리셉터클 커넥터 0.079)와 연결된 전극을 만듭니다.
2. 특수 맞춤형 케이블을 사용하여 동물을 앰프에 연결합니다.
   1. 남성 4핀 커넥터(Male 커넥터 0.079")를 4채널 유니티 게인 어피던스 매칭 운영 앰프(op-amp)에 부착합니다. 9V 배터리에 연결되는 와이어에 10K 저항기를 부착합니다. op-amp에 연결되지 않은 접지 와이어는 배터리의 중간점 역할을 합니다.
   2. 케이블의 한쪽 끝(AWG, 0.012" OD)을 op-amp에 연결하고 케이블의 다른 쪽 끝을 증폭기에 연결합니다.

2. 전극 이식 수술

1. 새끼 (산후 9 일)를 4-5 %의 이소플루란으로 마취하여 하향 흐름 후드에 있습니다. 시술시작 전에 부피바카인(0.02-0.05mL, 0.25% 피하국인 침전)으로 새끼를 주입한다.
2. 동물이 움직이지 않는 후 코 콘이있는 스테레오 전술 단계로 옮습니다. 머리를 안정적으로 유지하는 것이 부드럽기 때문에 이어 바의 역쪽을 사용합니다. 이 나이에 새끼는 이어 바의 뾰족한 끝을 사용하기 위해 완전히 발달 된 귀가 없습니다.
3. 이소플루란의 흐름을 거절하고 2.5-3 %로 유지합니다. 수술 시술 내내 강아지의 꾸준한 호흡을 주시하십시오. 꼬리를 꼬집어 통증 반응을 확인한 다음 절개를 진행합니다.
4. 베타딘과 알코올 (3 번갈아 요오드의 3 주기와 70 % 에탄올)와 두개골에 절개 영역을 살균. 절개 부위가 보이면 주변 신체 부위를 드레이프합니다.
5. 눈 위에서 두피 앞쪽 후방을 약간 열고 약 0.5cm의 피부를 후퇴시킵니다. 마우스 머리를 스테레오탁 스테이지에 재배치하여 피부가 두개골을 노출하는 바깥쪽으로 당겨지게 합니다.
6. 면봉을 사용하여 두개골에 과산화수소를 바르고 메스 블레이드를 사용하여 두개골을 깨끗하게 긁어냅니다. 두개골은 매우 부드럽습니다. 긁는 동안주의하십시오.
7. 접착제 1방울(약 50μL)을 적용하여 노출된 두개골 부위 주위에 퍼뜨려 어플리케이터를 사용합니다. 40s의 UV 광에 노출하여 접착제를 설정합니다.
8. 노출된 bregma를 참조로 사용하여 좌표를 측정합니다. 임플란트 전극은 해마의 CA1 영역에서 양자간 [-3.5 mm 도르살-벤탈(DV), ±2mm 내측-측면(ML), -1.75mm 딥(D)] 및 정수리 피질에서 양자간 [-1.22 mm DV, ±0.5mm ML, -1mm D] 및 전기전극7의 전기전^극. 32 G 바늘을 사용하여 표시된 영역에 구멍을 만듭니다.
9. 두개골 표면에서 혈액을 청소합니다. 여성 소켓 커넥터에 부착된 낮은 전극은 스테레오탁스 암의 도움으로 뇌에 부착되어 치과 아크릴로 고정합니다. 뇌의 전극을 이식합니다. 소켓 커넥터 헤드셋은 치과 아크릴에 의해 함께 붙어 두개골 의 상단에 앉아있다.
10. 전극이 고정되면 케토프로펜(5 mg/kg)을 교차 부위에 피하한다. 새끼를 어머니와 함께 다시 놓습니다.
    참고: 한 번에 하나씩 소개하는 대신 헤드셋이 있는 쓰레기의 절반을 어머니에게 한 번에 하나씩 소개합니다. 이렇게 하면 어머니가 강아지의 헤드셋을 손상시키는 것을 방지할 수 있습니다.

3. EEG 설정 및 기록 (기준 / 사전 부상)

1. 전극 이식 후 24 시간 의 회복 후, EEG 레코딩을위한 가열 (37 °C) 주문 제작 플렉시 글라스 챔버에 각 동물을 배치합니다. 이 챔버는 저산소챔버역할을 할 것이다.
2. 유연한 케이블(사용자 지정 제작 op-amp 케이블)을 통해 챔버의 새끼를 비디오-EEG 모니터링 시스템에 연결합니다.
   참고: 헤드셋을 제자리에 두고 마우스는 자유롭게 이동하며 행동에 차이가 없습니다. 전극 전선에 부착되면, 새끼가 자유롭게 챔버 를 통해 이동할 수 있도록 여유의 적당한 양을 제공하기 위해 챔버 밧줄 내에서 와이어를 조정해야합니다.
3. 잔디 증폭기사용으로 1K 게인으로 1000Hz에서 EEG 데이터를 디지털화합니다. 나중에 소프트웨어(예: LabChart Pro)를 사용하여 EEG 신호(3-70Hz 사이의 대역 패스 필터)를 검토합니다.
4. 경동맥 결찰 절차에 대한 동물을 분리하기 전에 30 분 동안 부상 전 기준선 EEG를 기록합니다.

4. 왼쪽 경동맥 결찰

1. 새끼 (산후 10 일)를 아래쪽 흐름 후드에 4-5 %의 이소플루란으로 마취하고 수유 패드에 특별히 배치 된 설정에 배치합니다. 동물 척추를 배치하고 종이 테이프로 앞다리를 고정합니다.
   1. 이소플루란의 흐름을 2-3%로 낮춥습니다. 통증 반응을 위해 꼬리를 꼬집고 시술 내내 호흡을 모니터링합니다.
2. 베타딘과 알코올 (3 번의 요오드 및 70 % 에탄올)으로 목 왼쪽에 절개 영역 (하악과 쇄골 사이)을 살균합니다.
3. 미세 시저를 사용하여 목 의 왼쪽에 약 1cm 길이의 절개를합니다. 해부 현미경을 사용하여 피하 조직과 피부를 조심스럽게 철회하여 경동맥을 노출시킵니다. 미주 신경을 식별하기 위해주의 (동맥에 측면 실행) 섬세하게 분리하고 동맥에서 철회.
4. 마이크로포스를 사용하여 동맥 아래에 5cm 길이의 멸균 실크 봉합사를 실어 두어 보실. 이중 매듭봉합사를 동맥 주위에 묶어 흐름을 바칩니다.
5. 피하 조직과 피부를 다시 당겨 여분의 봉합사를 잘라 노출 된 동맥을 닫습니다. 수의사 결합을 사용하여 절개를 밀봉하십시오.
6. 온난화 매트리스에 놓인 실온챔버에 동물을 연속 EEG 모니터링에 다시 배치합니다. 챔버를 열지 않도록 강아지 코어 온도의 스팟 적외선 온도 검사를 받아. 저산소증 에 앞서 동물이 1 시간 동안 회복되도록 허용하십시오.

5. EEG 및 저산소증

1. 산소 모니터를 통해 챔버 내에서 _FiO2 (영감받은 산소의 일부)를 지속적으로 모니터링합니다.
2. 챔버를 100% _N2 의 60 L/min, 0.415 L/min으로 100% _O2로 플러시합니다. 챔버의 산소 포화도가 12%에 _{도달하면 O2} 흐름을 변경하지 않고 N2 흐름을 10L/min으로 줄입니다. 작은 조정으로 _FiO2 를 8%에서 45분 동안 유지합니다.
3. 저산소증 노출 45분 후 _FiO2 를 21%로 되돌리보시면 됩니다.
4. 새끼가 챔버에서 회복하고 2 시간 후 저산소증에 대한 EEG에 모니터링해야합니다.
5. 기록 기간이 완료된 후, EEG 레코딩에서 마우스를 분리하고 어머니에게 돌아갑니다.

6. EEG 분석

1. LabChart Pro에서 비디오로 EEG 파일을 분석합니다. 눈을 멀게 한 연구원이 발작과 배경 패턴에 대한 EEG를 표시해야합니다¹⁷. 발작은 명확한 진화¹⁷을 가진 고주파 리듬 날카로운 파도 배출 (≥3x 기준선)으로 10 초 이상 지속되는 전기 전극 이벤트로 정의됩니다.
2. 두 번째 맹목적인 연구원이 합의를 위해 무작위로 표시된 이벤트를 검토하십시오.
3. 각 표시된 전극 이벤트에 대한 관련 비디오를 검토하고 신생아 설치류 행동 발작 점수¹⁶에 따라 분석합니다. 간단히 말해서, 이 점수는 0-6(심각한 강장제-클로닉 동작에 부동성)에 이르기까지 다양합니다. 발작 반학을 더 특성화하려면 측면(다초점/양자 운동 대 초점/일방적 대 혼합)에 대한 동작을 분석합니다.
4. 전원 분광기를 만듭니다. 1024개의 데이터 포인트 크기의 코신 벨 데이터 창으로 빠른 푸리에 변환을 사용합니다. 87.5%의 창 중첩을 통해 분광기에 부드러운 x축을 만듭니다. ^μV218로 전원을 표현합니다.

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결과

발작 세미로지

신생아 저산소증 -허혈 노출은 마우스에서 일반화 및 초점 발작 모두에서 초래 (도 1A-C). 비디오 EEG 녹화를 통해 전극 결과는 비디오의 동작과 상관관계가 있습니다. 이러한 행동은 이전에 발표된 신생아 설치류 행동 발작 점수(BSS)¹⁶을 사용하여 득점되었다. BSS 외에도 동작이 초점/일방적, 양자 또는 혼...

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토론

우리는 저산소 허혈성 발작 도중 신생아 마우스에 있는 지속적인 비디오 EEG 감시를 위한 모형을 제시했습니다. EEG와 함께 비디오 분석을 통해 발작 반학의 특성화를 허용합니다. EEG의 분석은 전력 분광 및 배경 진폭 분석의 추출을 허용합니다.

전극 배치 또는 부정확한 배치 중 부상이 결과에 크게 영향을 줄 수 있기 때문에 이 프로토콜에서는 전극의 정확하고 신중한 배치가 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SURGERY
Ball Point Applicator	Metrex Research	8300-F	i-bond applicator
Cranioplast (Powder/Resin)	Coltene	H00383	Perm Reline/Power
I-Bond	Kulzer GmbH, Germany
LOOK Silk Suture	Surgical Specialities Corporation	SP115	LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture
RS-5168 Botvin Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5168	Forcep for surgery/ligation
RS-5138 Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5138	Forcep for surgery/ligation
UV light for I-Bond	Blast Lite By First Media	BL778	UV ligth for I-bond
Vannas Microdissecting Scissor	Roboz Surgical Instrument	RS5618	Scissor for ligation
Vet Bond	3M Vetbond	1469SB	Vet Glue
HYPOXIA
Hypoxidial	Starr Life Science
Oxygen sensor	Medical Products		MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig
EEG RECORDING
Female receptacle connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	832-10-024-10-001000	Ordered from Digikey
Grass Amplifier	Natus Neurology Incorporated		Grass Product
LabChart Pro	ADI Instruments		Software to run the system
Male Socket Connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	833-43-024-20-001000	Ordered from Digikey
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2274CD	TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2272ACDR	TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier
Stainless Steel wire	A-M Systems	791400	0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft
Ultra-Flexible Wire	McMaster-Carr	9564T1	36 Gauze wire of various color