Kontinuierliches Video-Elektroenzephalogramm während Hypoxie-Ischämie bei neonatalen Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur kontinuierlichen Video-EEG-Aufzeichnung mit mehreren Tiefenelektroden bei neugeborenen Mäusen, die eine Hypoxie-Ischämie erleiden.

Zusammenfassung

Hypoxie-Ischämie ist die häufigste Ursache für neonatale Anfälle. Tiermodelle sind entscheidend für das Verständnis der Mechanismen und der Physiologie, die neonatale Anfälle und Hypoxie-Ischämie zugrunde liegen. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur kontinuierlichen Überwachung des Videoelektroenzephalogramms (EEG) bei neugeborenen Mäusen, um Anfälle zu erkennen und den EEG-Hintergrund während einer Hypoxie-Ischämie zu analysieren. Die Verwendung von Video und EEG in Verbindung ermöglicht die Beschreibung der Anfallssemilologie und die Bestätigung von Anfällen. Diese Methode ermöglicht auch die Analyse von Leistungsspektrogrammen und EEG-Hintergrundmustertrends über den experimentellen Zeitraum. In diesem Hypoxie-Ischämie-Modell ermöglicht die Methode die EEG-Aufzeichnung vor der Verletzung, um eine normative Baseline und während der Verletzung und Genesung zu erhalten. Die Gesamtüberwachungszeit ist durch die Unfähigkeit begrenzt, Die Welpen länger als vier Stunden von der Mutter zu trennen. Obwohl wir in diesem Manuskript ein Modell hypoxisch-ischämischer Anfälle verwendet haben, könnte diese Methode zur neonatalen Video-EEG-Überwachung auf verschiedene Krankheits- und Anfallsmodelle bei Nagetieren angewendet werden.

Einleitung

Hypoxische ischämische Enzephalopathie (HIE) ist eine Erkrankung, die jährlich 1,5 von 1000 Neugeborenen betrifft und die häufigste Ursache für neonatale Anfälle ^ist1,2. Säuglinge, die überleben, haben ein Risiko für verschiedene neurologische Behinderungen wie Zerebralparese, geistige Behinderung und Epilepsie3,4,5.

Tiermodelle spielen eine entscheidende Rolle beim Verständnis und der Untersuchung der Pathophysiologie von Hypoxie-Ischämie und neonatalen ^Anfällen6,7. Ein modifiziertes Vannucci-Modell wird verwendet, um eine Hypoxie-Ischämie (HI) am postnatalen Tag 10 (p10)^7,8 zu induzieren. Mauswelpen dieses Alters übersetzen neurologisch grob auf den vollen Begriff menschliches ^{Neugeborenes9}.

Die kontinuierliche Überwachung der Videoelektroenzephalographie (EEG), die in Verbindung mit diesem Verletzungsmodell verwendet wird, ermöglicht ein weiteres Verständnis und eine Charakterisierung neonataler hypoxischer ischämischer Anfälle. Frühere Studien haben verschiedene Methoden zur Analyse neonataler Anfälle bei Nagetieren verwendet, einschließlich Videoaufnahmen, begrenzter EEG-Aufzeichnungen und Telemetrie-EEG-Aufzeichnungen10,11,12,13,14,15,16. Im folgenden Manuskript diskutieren wir ausführlich den Prozess der Aufzeichnung des kontinuierlichen Video-EEG bei Mauswelpen während einer Hypoxie-Ischämie. Diese Technik zur kontinuierlichen Video-EEG-Überwachung bei neonatalen Mauswelpen könnte auf eine Vielzahl von Krankheits- und Anfallsmodellen angewendet werden.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Virginia genehmigt.

1. Elektrodenbau/Kabelaufbau

1. Verwenden Sie einen unipolar isolierten Edelstahldraht (0,005 "nackter Durchmesser, 0,008" beschichtet), um eine Elektrode herzustellen, die mit einem buchsenförmigen Steckverbinder (Buchsenanschluss 0,079) verbunden ist.
2. Verwenden Sie ein spezielles, maßgefertigtes Kabel, um Tiere an den Verstärker anzuschließen.
   1. Schließen Sie einen 4-poligen Stecker (Stecker 0,079") an den 4-Kanal-Einheitsverstärkungsimpedanzanpassungs-Operationsverstärker (Operationsverstärker) an. Schließen Sie einen 10K-Widerstand an die Drähte an, die mit der 9-V-Batterie verbunden sind. Ein Massekabel, das nicht mit dem Operationsverstärker verbunden ist, fungiert als Mittelpunkt der Batterie.
   2. Verbinden Sie ein Ende des Kabels (AWG, 0,012" OD) mit dem Operationsverstärker und verbinden Sie das andere Ende des Kabels mit dem Verstärker.

2. Elektrodenimplantationschirurgie

1. Betäuben Sie den Welpen (postnataler Tag 9) mit 4-5% Isofluran in einer nach unten fließenden Haube. Vor Beginn des Eingriffs wird den Welpen Bupivacain injiziert (0,02-0,05 ml, 0,25% subkutane lokale Infiltration).
2. Sobald das Tier unbeweglich ist, in ein stereotaktisches Stadium mit einem Nasenkegel überführen. Verwenden Sie die Rückseite der Ohrstange, da sie weich ist, um den Kopf ruhig zu halten. In diesem Alter haben Welpen kein voll entwickeltes Ohr, um das spitze Ende der Ohrstange zu benutzen.
3. Drehen Sie den Isofluranfluss herunter und halten Sie ihn bei 2,5-3%. Behalten Sie die stetige Atmung des Welpen während des gesamten chirurgischen Eingriffs im Auge. Kneifen Sie den Schwanz, um die Schmerzreaktion zu überprüfen, und fahren Sie dann mit dem Einschnitt fort.
4. Sterilisieren Sie den Einschnittbereich am Schädel mit Betadin und Alkohol (3 Zyklen alternierendes Jod und 70% Ethanol). Drapieren Sie den umgebenden Körperteil so, dass die Inzisionsregion sichtbar ist.
5. Öffnen Sie die Kopfhaut anterior-posterior von leicht über den Augen und ziehen Sie etwa 0,5 cm Haut zurück. Positionieren Sie den Mauskopf auf der stereotaktischen Stufe, so dass die Haut nach außen zieht und den Schädel freilegt.
6. Tragen Sie Wasserstoffperoxid mit einem Wattestäbchen auf den Schädel auf und kratzen Sie den Schädel mit einer Skalpellklinge sauber. Der Schädel ist sehr weich; Seien Sie beim Schaben vorsichtig.
7. Tragen Sie einen Tropfen (ca. 50 μL) Klebstoff auf und verteilen Sie ihn mit seinem Applikator im freiliegenden Schädelbereich. 40 s lang UV-Licht aussetzen, um den Klebstoff einzustellen.
8. Messen Sie die Koordinaten mit dem freiliegenden Bregma als Referenz. Implantatelektroden bilateral in der CA1-Region des Hippocampus [-3,5 mm dorsal-ventral (DV), ±2 mm medial-lateral (ML), -1,75 mm tief (D)] und bilateral im parietalen Kortex [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] und einer Referenzelektrode im ^Kleinhirn17. Verwenden Sie eine 32 G Nadel, um ein Loch an der markierten Stelle zu erzeugen.
9. Reinigen Sie das Blut von der Oberfläche des Schädels. Untere Elektroden, die an der Buchse befestigt sind, verbinden sich mit Hilfe des stereotaktischen Arms mit dem Gehirn und fixieren sie mit dentalem Acryl. Implantieren Sie die Elektrode in das Gehirn. Das Headset mit Buchsenanschluss sitzt auf dem Schädel, der mit dentalem Acryl zusammengeklebt ist.
10. Injizieren Sie Ketoprofen (5 mg/kg) subkutan in den interskapulären Bereich, sobald die Elektrode fixiert ist. Legen Sie die Welpen zurück zur Mutter.
    HINWEIS: Bringen Sie die Hälfte des Wurfes mit dem Headset sofort der Mutter vor, anstatt sie einzeln vorzustellen. Dies verhindert, dass die Mutter das Headset des Welpen beschädigt.

3. EEG-Einrichtung und -Aufzeichnung (Baseline/Pre-Injury)

1. Nach 24 Stunden Erholung nach der Elektrodenimplantation legen Sie jedes Tier in eine beheizte (37 °C) maßgefertigte Plexiglaskammer für die EEG-Aufzeichnung. Diese Kammer wird auch als Hypoxiekammer dienen.
2. Schließen Sie die Welpen in der Kammer über ein flexibles Kabel (maßgefertigtes Operationsverstärkerkabel) an ein Video-EEG-Überwachungssystem an.
   HINWEIS: Mit dem Headset sind die Mäuse frei beweglich und zeigen keine Unterschiede im Verhalten. Einmal an den Elektrodendrähten befestigt, müssen die Drähte innerhalb des Kammerstrangs eingestellt werden, um die richtige Menge an Durchhang zu gewährleisten, damit sich der Welpe frei in der Kammer bewegen kann.
3. Digitalisieren Sie die EEG-Daten bei 1000 Hz mit 1K-Verstärkung mit einem Grasverstärker. Überprüfen Sie das EEG-Signal (Bandpassfilter zwischen 3-70 Hz) später mit der Software (z. B. LabChart Pro).
4. Zeichnen Sie ein Basis-EEG vor der Verletzung für 30 Minuten auf, bevor Sie die Tiere für das Ligaturverfahren der Halsschlagader trennen.

4. Ligatur der linken Halsschlagader

1. Betäuben Sie den Welpen (postnataler Tag 10) mit 4-5% Isofluran in einer nach unten fließenden Haube und legen Sie ihn auf ein speziell angeordnetes Setup auf einem Wasserbadpolster. Positionieren Sie die Tierlage und sichern Sie die Vorderbeine mit Papierklebeband.
   1. Senken Sie den Isofluranfluss auf 2-3%. Kneifen Sie den Schwanz für die Schmerzreaktion und überwachen Sie die Atmung während des gesamten Eingriffs.
2. Sterilisieren Sie den Inzisionsbereich (zwischen Unterkiefer und Schlüsselbein) auf der linken Halsseite mit Betadin und Alkohol (3 Zyklen alternierend Jod und 70% Ethanol).
3. Machen Sie einen ca. 1 cm langen Schnitt auf der linken Seite des Halses mit Mikroscheren. Ziehen Sie mit einem Seziermikroskop das Unterhautgewebe und die Haut vorsichtig zurück, um die Halsschlagader freizulegen. Achten Sie darauf, den Vagusnerv (der seitlich zur Arterie verläuft) zu identifizieren und ihn vorsichtig von der Arterie zu trennen und zurückzuziehen.
4. Fädeln Sie eine 5 cm lange sterile Seidennaht unter der Arterie mit Mikroforcepen ein. Binden Sie eine doppelt verknotete Naht um die Arterie, um den Fluss zu verschließen.
5. Schneiden Sie die überschüssige Naht ab und schließen Sie die freiliegende Arterie, indem Sie das Unterhautgewebe und die Haut zurückziehen. Verwenden Sie Tierarztbindung, um den Schnitt zu versiegeln.
6. Setzen Sie das Tier wieder auf eine kontinuierliche EEG-Überwachung in einer Kammer bei Raumtemperatur, die auf eine wärmende Matratze gelegt wird. Führen Sie stichprobenartige Infrarot-Temperaturüberprüfungen der Kerntemperatur des Welpen durch, um ein Öffnen der Kammer zu vermeiden. Lassen Sie das Tier sich 1 h vor der Hypoxie erholen.

5. EEG und Hypoxie

1. Überwachen Sie kontinuierlich _FiO2 (Anteil des inspirierten Sauerstoffs) in der Kammer über einen Sauerstoffmonitor.
2. Spülen Sie die Kammer mit 60 L/min 100% _N2 und 0,415 L/min für 100% _O2. Sobald die Sauerstoffsättigung in der Kammer 12% erreicht, verringern Sie den N2-Durchfluss auf 10 l / min, während der _O2-Fluss unverändert bleibt. Mit kleinen Anpassungen halten Sie den _FiO2 45 Minuten lang bei 8%.
3. Nach 45 Minuten Hypoxie-Exposition kehren Sie _FiO2 auf 21% zurück.
4. Lassen Sie die Welpen sich in der Kammer erholen und überwachen Sie das EEG für 2 h nach Hypoxie.
5. Trennen Sie nach Abschluss der Aufzeichnungszeit die Mäuse von der EEG-Aufzeichnung und kehren Sie zur Mutter zurück.

6. EEG-Analyse

1. Analysieren Sie die EEG-Datei mit Video in LabChart Pro. Lassen Sie einen verblindeten Forscher das EEG für Anfälle und Hintergrundmuster ^markieren17. Anfälle sind definiert als ein elektrographisches Ereignis, das länger als 10 Sekunden dauert, mit hochfrequenten rhythmischen Scharfwellenentladungen (≥3x Baseline) mit klarer ^Evolution17.
2. Lassen Sie einen zweiten verblindeten Forscher markierte Ereignisse nach dem Zufallsprinzip überprüfen, um eine Einigung zu erzielen.
3. Überprüfen Sie das zugehörige Video für jedes markierte elektrographische Ereignis und analysieren Sie es gemäß dem Neonaten-Verhaltensanfalls-Score16. Kurz gesagt, diese Punktzahl reicht von 0-6 (Unbeweglichkeit bis schweres tonisch-klonisches Verhalten). Um die Anfallssemilologie weiter zu charakterisieren, analysieren Sie das Verhalten auf Lateralität (multifokale / bilaterale Bewegungen vs. fokale / unilaterale vs. gemischte).
4. Erstellen Sie ein Leistungsspektrogramm. Verwenden Sie eine Fast-Fourier-Transformation mit einem Cosine-Bell-Datenfenster mit einer Größe von 1024 Datenpunkten. Erstellen Sie eine glatte x-Achse im Spektrogramm mit Hilfe einer Fensterüberlappung von 87,5%. Drücken Sie die Leistung als ^{μV218 aus}.

Ergebnisse

Anfallssemilologie

Die Neonatale Hypoxie-Ischämie-Exposition führt bei Mäusen sowohl zu generalisierten als auch zu fokalen Anfällen (Abbildung 1A-C). Video-EEG-Aufzeichnungen ermöglichen es, elektrographische Befunde mit dem Verhalten auf Video zu korrelieren. Diese Verhaltensweisen wurden mit einem zuvor veröffentlichten neonatalen Nagetier-Verhaltenskrampf-Score (BSS) ^bewertet16. Zusätzlich zu BSS kategor...

Diskussion

Wir haben ein Modell für die kontinuierliche Video-EEG-Überwachung bei neonatalen Mäusen während hypoxisch-ischämischer Anfälle vorgestellt. Die Videoanalyse in Verbindung mit dem EEG ermöglicht die Charakterisierung der Anfallssemilologie. Die Analyse des EEG ermöglicht die Extraktion von Leistungsspektrogrammen und die Hintergrundamplitudenanalyse.

Die korrekte und sorgfältige Platzierung der Elektroden ist in diesem Protokoll von entscheidender Bedeutung, da Verletzungen während d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SURGERY
Ball Point Applicator	Metrex Research	8300-F	i-bond applicator
Cranioplast (Powder/Resin)	Coltene	H00383	Perm Reline/Power
I-Bond	Kulzer GmbH, Germany
LOOK Silk Suture	Surgical Specialities Corporation	SP115	LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture
RS-5168 Botvin Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5168	Forcep for surgery/ligation
RS-5138 Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5138	Forcep for surgery/ligation
UV light for I-Bond	Blast Lite By First Media	BL778	UV ligth for I-bond
Vannas Microdissecting Scissor	Roboz Surgical Instrument	RS5618	Scissor for ligation
Vet Bond	3M Vetbond	1469SB	Vet Glue
HYPOXIA
Hypoxidial	Starr Life Science
Oxygen sensor	Medical Products		MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig
EEG RECORDING
Female receptacle connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	832-10-024-10-001000	Ordered from Digikey
Grass Amplifier	Natus Neurology Incorporated		Grass Product
LabChart Pro	ADI Instruments		Software to run the system
Male Socket Connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	833-43-024-20-001000	Ordered from Digikey
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2274CD	TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2272ACDR	TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier
Stainless Steel wire	A-M Systems	791400	0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft
Ultra-Flexible Wire	McMaster-Carr	9564T1	36 Gauze wire of various color