Elettroencefalogramma video continuo durante l'ipossia-ischemia nei topi neonatali

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un metodo per registrazioni EEG video continue utilizzando elettrodi di profondità multipli in topi neonatali sottoposti a ipossia-ischemia.

Abstract

L'ischemia da ipossia è la causa più comune di convulsioni neonatali. I modelli animali sono cruciali per comprendere i meccanismi e la fisiologia alla base delle convulsioni neonatali e dell'ischemia da ipossia. Questo manoscritto descrive un metodo per il monitoraggio continuo dell'elettroencefalogramma video (EEG) nei topi neonatali per rilevare le convulsioni e analizzare lo sfondo EEG durante l'ischemia da ipossia. L'uso di video ed EEG in combinazione consente la descrizione della semiologia delle convulsioni e la conferma delle convulsioni. Questo metodo consente anche l'analisi degli spettrogrammi di potenza e delle tendenze del modello di sfondo EEG nel periodo di tempo sperimentale. In questo modello di ischemia ipossia, il metodo consente la registrazione EEG prima della lesione per ottenere una linea di base normativa e durante la lesione e il recupero. Il tempo totale di monitoraggio è limitato dall'incapacità di separare i cuccioli dalla madre per più di quattro ore. Sebbene in questo manoscritto abbiamo utilizzato un modello di convulsioni ipossico-ischemiche, questo metodo per il monitoraggio EEG video neonatale potrebbe essere applicato a diversi modelli di malattie e convulsioni nei roditori.

Introduzione

L'encefalopatia ischemica ipossica (HIE) è una condizione che colpisce 1,5 neonati su 1000 all'anno ed è la causa più comune di convulsioni ^neonatali1,2. I neonati che sopravvivono sono a rischio di varie disabilità neurologiche come paralisi cerebrale, disabilità intellettiva ed epilessia3,4,5.

I modelli animali svolgono un ruolo fondamentale nella comprensione e nello studio della fisiopatologia dell'ipossia ischemia e delle convulsioni ^neonatali6,7. Un modello di Vannucci modificato viene utilizzato per indurre l'ischemia da ipossia (HI) al giorno 10 postnatale (p10)^7,8. I cuccioli di topo di questa età si traducono neurologicamente approssimativamente nel termine completo neonato ^umano9.

Il monitoraggio video elettroencefalografico continuo (EEG) utilizzato in combinazione con questo modello di lesione consente un'ulteriore comprensione e caratterizzazione delle crisi ischemiche ipossiche neonatali. Studi precedenti hanno utilizzato vari metodi per analizzare le convulsioni neonatali nei roditori, tra cui registrazioni video, registrazioni EEG limitate e registrazioni EEG di telemetria10,11,12,13,14,15,16. Nel seguente manoscritto, discutiamo in profondità il processo di registrazione di video EEG continui nei cuccioli di topo durante l'ipossia-ischemia. Questa tecnica per il monitoraggio video continuo dell'EEG nei cuccioli di topo neonatale potrebbe essere applicata a una varietà di modelli di malattie e convulsioni.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Virginia.

1. Costruzione di elettrodi / costruzione di cavi

1. Utilizzare un filo di acciaio inossidabile isolato unipolare (diametro nudo di 0,005 ", 0,008") per creare un elettrodo collegato con un connettore a presa femmina (connettore presa femmina 0,079).
2. Utilizzare uno speciale cavo su misura per collegare gli animali all'amplificatore.
   1. Collegare un connettore maschio a 4 pin (connettore maschio 0,079") all'amplificatore operazionale (op-amp) a 4 canali di unità di guadagno corrispondente all'impedenza. Collegare un resistore da 10K ai fili che si collegano alla batteria da 9 V. Un filo di terra non collegato all'amplificatore operazionale funge da punto medio della batteria.
   2. Collegare un'estremità del cavo (AWG, 0,012" OD) all'amplificatore operazionale e collegare l'altra estremità del cavo all'amplificatore.

2. Chirurgia di impianto di elettrodi

1. Anestetizzare il cucciolo (giorno 9 postnatale) con il 4-5% di isoflurano in una cappa a flusso verso il basso. Prima dell'inizio della procedura, iniettare i cuccioli con bupivacaina (0,02-0,05 ml, 0,25% di infiltrazione locale sottocutanea).
2. Una volta che l'animale è immobile, trasferirlo in uno stadio stereotassico con un cono nasale. Usa il retro della barra dell'orecchio in quanto è morbido per tenere la testa ferma. A questa età, i cuccioli non hanno un orecchio completamente sviluppato per utilizzare l'estremità appuntita della barra dell'orecchio.
3. Abbassare il flusso di isoflurano e mantenerlo al 2,5-3%. Tieni d'occhio la respirazione costante del cucciolo durante la procedura chirurgica. Pizzicare la coda per controllare la risposta al dolore e quindi procedere all'incisione.
4. Sterilizzare l'area di incisione sul cranio con betadina e alcool (3 cicli di alternanza di iodio ed etanolo al 70%). Drappeggiare la parte del corpo circostante in modo tale che la regione dell'incisione sia visibile.
5. Aprire il cuoio capelluto anteriormente-posteriore da leggermente sopra gli occhi e ritrarre circa 0,5 cm di pelle. Riposizionare la testa del mouse sullo stadio stereotassico in modo che la pelle tiri verso l'esterno esponendo il cranio.
6. Applicare il perossido di idrogeno sul cranio usando un batuffolo di cotone e raschiare il cranio pulito usando una lama di bisturi. Il cranio è molto morbido; prestare attenzione durante il raschiamento.
7. Applicare una goccia (circa 50 μL) di adesivo e stenderlo intorno all'area del cranio esposta utilizzando il suo applicatore. Esporre alla luce UV per 40 s per impostare l'adesivo.
8. Misurate le coordinate utilizzando il bregma esposto come riferimento. Impiantare elettrodi bilateralmente nella regione CA1 dell'ippocampo [-3,5 mm Dorsale-Ventrale (DV), ±2 mm Mediale-Laterale (ML), -1,75 mm Profondità (D)] e bilateralmente nella corteccia parietale [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] e un elettrodo di riferimento nel ^{cervelletto17}. Utilizzare un ago da 32 G per creare un foro nella regione contrassegnata.
9. Pulire il sangue dalla superficie del cranio. Elettrodi inferiori attaccati al connettore della presa femmina nel cervello con l'aiuto del braccio stereotassico e fissati in posizione con acrilico dentale. Impiantare l'elettrodo nel cervello. L'auricolare con connettore a presa si trova sulla parte superiore del cranio incollato insieme da acrilico dentale.
10. Iniettare ketoprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea nella regione interscapolare una volta fissato l'elettrodo. Rimetti i cuccioli con la madre.
    NOTA: introdurre metà della lettiera con l'auricolare in una sola volta alla madre piuttosto che introdurli uno alla volta. Ciò impedirà alla madre di danneggiare l'auricolare del cucciolo.

3. Configurazione e registrazione EEG (baseline/pre-infortunio)

1. Dopo 24 ore di recupero dopo l'impianto dell'elettrodo, posizionare ogni animale in una camera di plexiglas riscaldata (37 °C) su misura per la registrazione EEG. Questa camera servirà anche come camera per l'ipossia.
2. Collegare i cuccioli nella camera a un sistema di monitoraggio video-EEG tramite un cavo flessibile (cavo op-amp personalizzato).
   NOTA: con l'auricolare in posizione, i mouse sono liberamente mobili e non presentano differenze di comportamento. Una volta attaccati ai fili dell'elettrodo, i fili devono essere regolati all'interno del cavo della camera in modo da fornire la giusta quantità di allentamento in modo che il cucciolo possa muoversi liberamente in tutta la camera.
3. Digitalizza i dati EEG a 1000 Hz con guadagno 1K utilizzando un amplificatore erba. Rivedere il segnale EEG (filtro passa banda tra 3-70 Hz) in un secondo momento utilizzando un software (ad esempio, LabChart Pro).
4. Registrare un EEG al basale pre-lesione per 30 minuti prima di disconnettere gli animali per la procedura di legatura dell'arteria carotidea.

4. Legatura dell'arteria carotide sinistra

1. Anestetizzare il cucciolo (giorno 10 postnatale) con il 4-5% di isoflurano in un cappuccio a flusso verso il basso e posizionarlo su una configurazione appositamente disposta su un waterbath pad. Posizionare l'animale supino e fissare gli arti anteriori con del nastro adesivo.
   1. Abbassare il flusso di isoflurano al 2-3%. Pizzicare la coda per la risposta al dolore e monitorare la respirazione durante la procedura.
2. Sterilizzare l'area di incisione (tra mandibola e clavicola) sul lato sinistro del collo con betadina e alcool (3 cicli di iodio alternato ed etanolo al 70%).
3. Fai un'incisione lunga circa 1 cm sul lato sinistro del collo usando microscissori. Utilizzando un microscopio di dissezione, ritrarre con cura il tessuto sottocutaneo e la pelle per esporre l'arteria carotide. Fare attenzione a identificare il nervo vago (che corre lateralmente all'arteria) e separarlo delicatamente e ritrarlo dall'arteria.
4. Infilare una sutura di seta sterile lunga 5 cm sotto l'arteria usando microforze. Legare una sutura a doppio nodo attorno all'arteria al flusso occluso.
5. Tagliare la sutura in eccesso e chiudere l'arteria esposta tirando indietro il tessuto sottocutaneo e la pelle. Utilizzare il legame veterinario per sigillare l'incisione.
6. Riposizionare l'animale su un monitoraggio EEG continuo in una camera a temperatura ambiente, che viene posizionata su un materasso riscaldante. Effettuare controlli della temperatura a infrarossi della temperatura interna del cucciolo per evitare di aprire la camera. Lasciare che l'animale si riprenda per 1 ora prima dell'ipossia.

5. EEG e ipossia

1. Monitorare continuamente _FiO2 (frazione di ossigeno inspirato) all'interno della camera tramite un monitor di ossigeno.
2. Lavare la camera con 60 L/min di 100% _N2 e 0,415 L/min per 100% _O2. Una volta che la saturazione di ossigeno nella camera raggiunge il 12%, ridurre il flusso di N2 a 10 L / min mantenendo invariato il flusso di _O2 . Con piccole regolazioni, mantenere il _FiO2 all'8% per 45 minuti.
3. Dopo 45 minuti di esposizione all'ipossia, riportare la _FiO2 al 21%.
4. Chiedi ai cuccioli di recuperare in camera e monitorare l'EEG per 2 ore post-ipossia.
5. Dopo il completamento del periodo di registrazione, scollegare i topi dalla registrazione EEG e tornare alla madre.

6. Analisi EEG

1. Analizza il file EEG con il video in LabChart Pro. Chiedi a un ricercatore in cieco di contrassegnare l'EEG per convulsioni e modelli di ^sfondo17. Le convulsioni sono definite come un evento elettrografico della durata superiore a 10 secondi con scariche d'onda acuta ritmiche ad alta frequenza (≥3x basale) con chiara ^evoluzione17.
2. Chiedi a un secondo ricercatore in cieco di rivedere gli eventi contrassegnati a caso per l'accordo.
3. Rivedere il video associato per ogni evento elettrografico marcato e analizzare in base al punteggio di crisi comportamentale del roditore ^neonatale16. In breve, questo punteggio varia da 0-6 (immobilità a grave comportamento tonico-clonico). Per caratterizzare ulteriormente la semiologia convulsiva, analizzare il comportamento per la lateralità (movimenti multifocali / bilaterali vs. focali / unilaterali vs. misti).
4. Creare uno spettrogramma di potenza. Utilizzare una trasformazione di Fourier veloce con una finestra dati Coseno-Campana con una dimensione di 1024 punti dati. Crea un asse x liscio nello spettrogramma con l'aiuto di una sovrapposizione di finestre dell'87,5%. Esprimere la potenza come ^μV218.

Risultati

Semiologia convulsiva

L'esposizione neonatale all'ipossia-ischemia provoca convulsioni sia generalizzate che focali nei topi (Figura 1A-C). Le registrazioni video EEG consentono di correlare i risultati elettrografici al comportamento sul video. Questi comportamenti sono stati valutati utilizzando un punteggio comportamentale per roditori neonatali (BSS⁾ precedentemente pubblicato. Oltre alla BSS, abbiamo classific...

Discussione

Abbiamo presentato un modello per il monitoraggio video-EEG continuo nei topi neonatali durante le crisi ipossico-ischemiche. L'analisi video in combinazione con l'EEG consente la caratterizzazione della semiologia convulsiva. L'analisi dell'EEG consente l'estrazione di spettrogrammi di potenza e l'analisi dell'ampiezza di fondo.

Il posizionamento corretto e attento degli elettrodi è fondamentale in questo protocollo, poiché lesioni durante il posizionamento dell'elettrodo o un posizionament...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SURGERY
Ball Point Applicator	Metrex Research	8300-F	i-bond applicator
Cranioplast (Powder/Resin)	Coltene	H00383	Perm Reline/Power
I-Bond	Kulzer GmbH, Germany
LOOK Silk Suture	Surgical Specialities Corporation	SP115	LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture
RS-5168 Botvin Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5168	Forcep for surgery/ligation
RS-5138 Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5138	Forcep for surgery/ligation
UV light for I-Bond	Blast Lite By First Media	BL778	UV ligth for I-bond
Vannas Microdissecting Scissor	Roboz Surgical Instrument	RS5618	Scissor for ligation
Vet Bond	3M Vetbond	1469SB	Vet Glue
HYPOXIA
Hypoxidial	Starr Life Science
Oxygen sensor	Medical Products		MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig
EEG RECORDING
Female receptacle connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	832-10-024-10-001000	Ordered from Digikey
Grass Amplifier	Natus Neurology Incorporated		Grass Product
LabChart Pro	ADI Instruments		Software to run the system
Male Socket Connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	833-43-024-20-001000	Ordered from Digikey
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2274CD	TLC2274 Quad Low‐Noise Rail‐to Rail Operational Amplifier
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2272ACDR	TLC2274 Quad Low‐Noise Rail‐to Rail Operational Amplifier
Stainless Steel wire	A-M Systems	791400	0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft
Ultra-Flexible Wire	McMaster-Carr	9564T1	36 Gauze wire of various color