Électroencéphalogramme vidéo continu pendant l’hypoxie-ischémie chez les souris néonatales

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode d’enregistrement EEG vidéo continu utilisant plusieurs électrodes de profondeur chez des souris néonatales subissant une hypoxie-ischémie.

Résumé

L’hypoxie ischémique est la cause la plus fréquente de crises néonatales. Les modèles animaux sont essentiels pour comprendre les mécanismes et la physiologie sous-jacents aux crises néonatales et à l’ischémie de l’hypoxie. Ce manuscrit décrit une méthode de surveillance continue de l’électroencéphalogramme vidéo (EEG) chez des souris néonatales pour détecter les crises et analyser le fond de l’EEG pendant l’ischémie d’hypoxie. L’utilisation de la vidéo et de l’EEG en conjonction permet de décrire la sémiologie des crises et de confirmer les crises. Cette méthode permet également d’analyser les spectrogrammes de puissance et les tendances des modèles de fond EEG au cours de la période expérimentale. Dans ce modèle d’ischémie d’hypoxie, la méthode permet l’enregistrement EEG avant la blessure pour obtenir une base de référence normative et pendant la blessure et la récupération. Le temps total de surveillance est limité par l’incapacité de séparer les petits de la mère pendant plus de quatre heures. Bien que nous ayons utilisé un modèle de crises hypoxiques-ischémiques dans ce manuscrit, cette méthode de surveillance EEG vidéo néonatale pourrait être appliquée à divers modèles de maladies et de crises chez les rongeurs.

Introduction

L’encéphalopathie hypoxique ischémique (EIS) est une affection qui touche 1,5 nouveau-né sur 1000 chaque année et est la cause la plus fréquente de crises ^{néonatales1,2}. Les nourrissons qui survivent sont à risque de diverses déficiences neurologiques telles que la paralysie cérébrale, la déficience intellectuelle et l’épilepsie3,4,5.

Les modèles animaux jouent un rôle essentiel dans la compréhension et l’étude de la physiopathologie de l’ischémie de l’hypoxie et des crises ^{néonatales6,7}. Un modèle de Vannucci modifié est utilisé pour induire une hypoxie ischémie (HI) le jour postnatal 10 (p10)^7,8. Les chiots souris de cet âge se traduisent neurologiquement approximativement par le terme complet de nouveau-né ^humain9.

La surveillance par électroencéphalographie vidéo continue (EEG) utilisée conjointement avec ce modèle de blessure permet de mieux comprendre et caractériser les crises ischémiques hypoxiques néonatales. Des études antérieures ont utilisé diverses méthodes pour analyser les crises néonatales chez les rongeurs, y compris les enregistrements vidéo, les enregistrements EEG limités et les enregistrements EEG de télémétrie10,11,12,13,14,15,16. Dans le manuscrit suivant, nous discutons en profondeur du processus d’enregistrement de l’EEG vidéo en continu chez les chiots souris pendant l’hypoxie-ischémie. Cette technique de surveillance EEG vidéo continue chez les mouse pupitres néonatales pourrait être appliquée à une variété de modèles de maladies et de convulsions.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie.

1. Construction d’électrodes/construction de câbles

1. Utilisez un fil en acier inoxydable isolé unipolaire (0,005 » de diamètre nu, revêtu de 0,008 ») pour fabriquer une électrode connectée à un connecteur de prise femelle (connecteur de prise femelle 0,079).
2. Utilisez un câble spécial sur mesure pour connecter les animaux à l’amplificateur.
   1. Connectez un connecteur mâle à 4 broches (connecteur mâle 0,079 ») à un amplificateur opérationnel correspondant à l’impédance de gain d’unité à 4 canaux (op-amp). Fixez une résistance 10K aux fils qui se connectent à la batterie 9 V. Un fil de terre non connecté à l’amplificateur opérationnel agit comme point médian de la batterie.
   2. Connectez une extrémité du câble (AWG, 0,012 » OD) à l’amplificateur opérationnel et connectez l’autre extrémité du câble à l’amplificateur.

2. Chirurgie d’implantation d’électrodes

1. Anesthésier le chiot (jour postnatal 9) avec 4-5% d’isoflurane dans une hotte à écoulement descendant. Avant le début de la procédure, injecter aux chiots de la bupivacaïne (0,02-0,05 mL, infiltration locale sous-cutanée à 0,25 %).
2. Une fois que l’animal est immobile, transfert à un stade stéréotaxique avec un cône de nez. Utilisez le verso de la barre auriculaire car il est doux pour maintenir la tête stable. À cet âge, les chiots n’ont pas une oreille complètement développée pour utiliser l’extrémité pointue de la barre auriculaire.
3. Réduisez le débit d’isoflurane et maintenez-le à 2,5-3%. Gardez un œil sur la respiration régulière du chiot tout au long de la procédure chirurgicale. Pincez la queue pour vérifier la réponse à la douleur, puis procédez à l’incision.
4. Stériliser la zone d’incision sur le crâne avec de la bétadine et de l’alcool (3 cycles d’alternance d’iode et d’éthanol à 70%). Drapez la partie du corps environnante de manière à ce que la région de l’incision soit visible.
5. Ouvrez le cuir chevelu antérieur-postérieur légèrement au-dessus des yeux et rétractez environ 0,5 cm de peau. Repositionnez la tête de la souris sur la scène stéréotaxique afin que la peau tire vers l’extérieur exposant le crâne.
6. Appliquez du peroxyde d’hydrogène sur le crâne à l’aide d’un coton-tige et grattez le crâne à l’aide d’une lame de scalpel. Le crâne est très doux; faites preuve de prudence lorsque vous grattez.
7. Appliquez une goutte (environ 50 μL) d’adhésif et étalez-la autour de la zone du crâne exposée à l’aide de son applicateur. Exposez à la lumière UV pendant 40 s pour régler l’adhésif.
8. Mesurez les coordonnées en utilisant le bregma exposé comme référence. Électrodes implantaires bilatéralement dans la région CA1 de l’hippocampe [-3,5 mm dorsal-ventral (DV), ±2 mm médial-latéral (ML), -1,75 mm de profondeur (D)] et bilatéralement dans le cortex pariétal [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] et une électrode de référence dans le ^cervelet17. Utilisez une aiguille de 32 G pour créer un trou dans la région marquée.
9. Nettoyez le sang de la surface du crâne. Électrodes inférieures attachées au connecteur de la douille femelle dans le cerveau à l’aide du bras stéréotaxique et fixées en place avec de l’acrylique dentaire. Implantez l’électrode dans le cerveau. Le casque du connecteur de prise se trouve sur le dessus du crâne collé ensemble par de l’acrylique dentaire.
10. Injecter du kétoprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée dans la région interscapulaire une fois l’électrode fixée. Replacez les chiots avec la mère.
    REMARQUE: Introduisez la moitié de la litière avec le casque à la fois à la mère plutôt que de les présenter un à la fois. Cela empêchera la mère d’endommager le casque du chiot.

3. Configuration et enregistrement de l’EEG (ligne de base/pré-blessure)

1. Après 24 h de récupération après l’implantation de l’électrode, placer chaque animal dans une chambre en plexiglas chauffée (37 °C) sur mesure pour l’enregistrement EEG. Cette chambre servira également de chambre d’hypoxie.
2. Connectez les chiots dans la chambre à un système de surveillance vidéo-EEG via un câble flexible (câble op-amp sur mesure).
   REMARQUE: Avec le casque en place, les souris sont librement mobiles et ne présentent aucune différence de comportement. Une fois attachés aux fils d’électrode, les fils doivent être ajustés à l’intérieur de l’attache de la chambre afin de fournir la bonne quantité de mou afin que le chiot puisse se déplacer librement dans la chambre.
3. Numérisez les données EEG à 1000 Hz avec un gain de 1K à l’aide d’un amplificateur d’herbe. Examinez le signal EEG (filtre passe-bande entre 3 et 70 Hz) plus tard à l’aide d’un logiciel (par exemple, LabChart Pro).
4. Enregistrez un EEG de base avant la blessure pendant 30 minutes avant de déconnecter les animaux pour une procédure de ligature de l’artère carotide.

4. Ligature de l’artère carotide gauche

1. Anesthésiez le chiot (jour postnatal 10) avec 4-5% d’isoflurane dans une hotte à écoulement descendant et placez-le sur une installation spécialement aménagée sur un tampon de bain d’eau. Placez l’animal en décubitus dorsal et fixez les membres antérieurs avec du ruban adhésif en papier.
   1. Abaissez le débit d’isoflurane à 2-3%. Pincez la queue pour la réponse à la douleur et surveillez la respiration tout au long de la procédure.
2. Stériliser la zone d’incision (entre la mandibule et la clavicule) sur le côté gauche du cou avec de la bétadine et de l’alcool (3 cycles d’alternance d’iode et d’éthanol à 70%).
3. Faites une incision d’environ 1 cm de long sur le côté gauche du cou à l’aide de microcisseurs. À l’aide d’un microscope à dissection, rétractez soigneusement le tissu sous-cutané et la peau pour exposer l’artère carotide. Prenez soin d’identifier le nerf vague (latéral à l’artère) et de le séparer délicatement et de le rétracter de l’artère.
4. Enfilez une suture de soie stérile de 5 cm de long sous l’artère à l’aide de micro-pinces. Attachez une suture à double nœud autour de l’artère pour obstruer l’écoulement.
5. Coupez l’excès de suture et fermez l’artère exposée en retirant le tissu sous-cutané et la peau. Utilisez le lien vétérinaire pour sceller l’incision.
6. Replacez l’animal sous surveillance EEG continue dans une chambre à température ambiante, qui est placée sur un matelas chauffant. Effectuez des contrôles ponctuels de la température infrarouge de la température centrale du chiot pour éviter d’ouvrir la chambre. Laissez l’animal récupérer pendant 1 h avant l’hypoxie.

5. EEG et hypoxie

1. Surveillez en permanence le _FiO2 (fraction d’oxygène inspiré) dans la chambre via un moniteur d’oxygène.
2. Rincer la chambre avec 60 L/min de 100% _N2 et 0,415 L/min pour 100% _O2. Une fois que la saturation en oxygène dans la chambre atteint 12%, diminuez le débit de N2 à 10 L / min tout en maintenant le débit d’O2 inchangé. Avec de petits ajustements, maintenez le _FiO2 à 8% pendant 45 min.
3. Après 45 min d’exposition à l’hypoxie, ramener _fiO2 à 21%.
4. Demandez aux chiots de récupérer en chambre et de surveiller l’EEG pendant 2 heures après l’hypoxie.
5. Une fois la période d’enregistrement terminée, déconnectez les souris de l’enregistrement EEG et retournez à la mère.

6. Analyse EEG

1. Analysez le fichier EEG avec la vidéo dans LabChart Pro. Demandez à un chercheur aveugle de marquer l’EEG pour les crises et les modèles de ^fond17. Les crises sont définies comme un événement électrographique d’une durée supérieure à 10 secondes avec des décharges d’ondes vives rythmiques à haute fréquence (≥3x ligne de base) avec une évolution ^claire17.
2. Demandez à un deuxième chercheur aveugle d’examiner au hasard les événements marqués pour obtenir un accord.
3. Passez en revue la vidéo associée à chaque événement électrographique marqué et analysez-la en fonction du score de crise comportementale néonatale des ^rongeurs16. En bref, ce score varie de 0 à 6 (immobilité à comportement tonico-clonique sévère). Pour caractériser davantage la sémiologie des crises, analysez le comportement pour la latéralité (mouvements multifocaux / bilatéraux vs focals / unilatéraux vs mixtes).
4. Créez un spectrogramme de puissance. Utilisez une transformée de Fourier rapide avec une fenêtre de données Cosinus-Bell d’une taille de 1024 points de données. Créez un axe X lisse dans le spectrogramme à l’aide d’un chevauchement de fenêtre de 87,5%. Exprimez la puissance en ^μV218.

Résultats

Sémiologie des crises

L’exposition à l’hypoxie-ischémie néonatale entraîne des crises généralisées et focales chez la souris (figure 1A-C). Les enregistrements EEG vidéo permettent de corréler les résultats électrographiques au comportement sur vidéo. Ces comportements ont été notés à l’aide d’un score de crise comportementale néonatale de rongeurs (BSS)¹⁶ publié précédemment. En plus d...

Discussion

Nous avons présenté un modèle de surveillance vidéo-EEG continue chez des souris néonatales lors de crises hypoxiques-ischémiques. L’analyse vidéo en conjonction avec l’EEG permet de caractériser la sémiologie des crises. L’analyse de l’EEG permet l’extraction de spectrogrammes de puissance et l’analyse d’amplitude de fond.

Le placement correct et soigneux des électrodes est crucial dans ce protocole, car une blessure lors du placement de l’électrode ou un placement ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SURGERY
Ball Point Applicator	Metrex Research	8300-F	i-bond applicator
Cranioplast (Powder/Resin)	Coltene	H00383	Perm Reline/Power
I-Bond	Kulzer GmbH, Germany
LOOK Silk Suture	Surgical Specialities Corporation	SP115	LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture
RS-5168 Botvin Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5168	Forcep for surgery/ligation
RS-5138 Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5138	Forcep for surgery/ligation
UV light for I-Bond	Blast Lite By First Media	BL778	UV ligth for I-bond
Vannas Microdissecting Scissor	Roboz Surgical Instrument	RS5618	Scissor for ligation
Vet Bond	3M Vetbond	1469SB	Vet Glue
HYPOXIA
Hypoxidial	Starr Life Science
Oxygen sensor	Medical Products		MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig
EEG RECORDING
Female receptacle connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	832-10-024-10-001000	Ordered from Digikey
Grass Amplifier	Natus Neurology Incorporated		Grass Product
LabChart Pro	ADI Instruments		Software to run the system
Male Socket Connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	833-43-024-20-001000	Ordered from Digikey
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2274CD	TLC2274 Quad Low‐Noise Rail‐to Rail Operational Amplifier
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2272ACDR	TLC2274 Quad Low‐Noise Rail‐to Rail Operational Amplifier
Stainless Steel wire	A-M Systems	791400	0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft
Ultra-Flexible Wire	McMaster-Carr	9564T1	36 Gauze wire of various color