Extracción optimizada de ADN de alta calidad a partir de lesiones ateroscleróticas humanas fijadas en formol e incluidas en parafina

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la extracción semiautomatizada de ADN de lesiones fijadas en formol e incluidas en parafina de las arterias carótidas humanas. La lisis de tejidos se realiza sin xileno tóxico, a la que sigue un protocolo automatizado de extracción de ADN, que incluye una segunda etapa de lisis, la unión del ADN a partículas paramagnéticas para la unión basada en celulosa, las etapas de lavado y la elución del ADN.

Resumen

Los tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) representan una valiosa fuente para análisis moleculares y estudios genómicos clínicos. Estos tejidos suelen ser pobres en células o difíciles de procesar. Por lo tanto, los ácidos nucleicos deben aislarse cuidadosamente. En los últimos años, se han establecido varios métodos para el aislamiento de ADN para tejidos de muchas enfermedades, principalmente el cáncer. Desafortunadamente, el ADN genómico extraído de los tejidos FFPE está altamente degradado debido a la reticulación entre las hebras de ácido nucleico y las proteínas, así como a las rupturas aleatorias en la secuencia. Por lo tanto, la calidad del ADN de estas muestras se reduce notablemente, lo que supone un reto para futuros análisis moleculares posteriores. Otros problemas con los tejidos difíciles son, por ejemplo, la falta de células en las lesiones ateroscleróticas humanas calcificadas y en el tejido graso, las pequeñas biopsias de piel y, en consecuencia, la baja disponibilidad de los ácidos nucleicos deseados, como también ocurre en los tejidos viejos o fijos.

En nuestros laboratorios, hemos establecido un método para la extracción de ADN de lesiones ateroscleróticas fijadas en formol, utilizando un sistema de aislamiento semiautomatizado. Comparamos este método con otros protocolos de extracción disponibles comercialmente y nos centramos en análisis posteriores. La pureza y concentración del ADN se midieron mediante espectrometría y fluorometría. Se evaluó el grado de fragmentación y la calidad general.

La mayor cantidad y calidad de ADN se obtuvo con el protocolo de ADN sanguíneo modificado para el sistema de extracción automatizado, en lugar del protocolo comercial FFPE. Con este protocolo paso a paso, los rendimientos de ADN de las muestras de FFPE fueron, en promedio, cuatro veces más altos y menos especímenes fallaron en el proceso de extracción, que es crítico cuando se trata de biopsias de vasos pequeños. Los tamaños de amplicón de 200 a 800 pb pudieron detectarse mediante PCR. Este estudio muestra que, aunque el ADN obtenido de nuestro tejido FFPE está muy fragmentado, aún se puede utilizar para la amplificación y secuenciación exitosas de productos más cortos. En conclusión, en nuestras manos, la tecnología automatizada parece ser el mejor sistema para la extracción de ADN, especialmente para pequeñas muestras de tejido FFPE.

Introducción

La fijación en formol seguida de inclusión en parafina (FFPE) es un procedimiento estándar para la conservación a largo plazo de muestras patológicas en biobancos¹. Estas muestras proporcionan una valiosa fuente para estudios histológicos, así como para análisis moleculares, especialmente estudios genéticos². Otras ventajas de los tejidos FFPE son un mejor almacenamiento a largo plazo, menores costes y condiciones de almacenamiento más sencillas. Nuestra intención aquí es proporcionar un protocolo confiable y fácil de usar para el aislamiento de ácidos nucleicos reproducibles a partir de pequeñas cantidades de secciones de FFPE, ya que la extracción de ADN de alta calidad es el primer paso crucial en una amplia gama de técnicas moleculares y los tejidos FFPE son la fuente más disponible de muestras.

Los nuevos enfoques científicos, como la secuenciación de próxima generación (NGS) y los enfoques de investigación "ómica", requieren una alta calidad de los ácidos nucleicos ^3,4,5. La extracción de ADN de muestras de tejido FFPE sigue siendo una tarea difícil. El ADN de las muestras de FFPE puede variar ampliamente en calidad y cantidad, dependiendo de su edad y condiciones de fijación. La formalina, el compuesto más utilizado, conduce a la reticulación ADN-proteína ^6,7,8 y provoca una rotura aleatoria inespecífica en la secuencia de nucleótidos⁹. Esto puede tener un impacto significativo en los análisis genómicos posteriores, ya que la reticulación puede desactivar la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ^6,10. Debido a los contaminantes durante el proceso de fijación, la pureza del ADN aislado de las muestras de FFPE suele ser limitada. En los últimos años, se establecieron varios métodos para el aislamiento de ADN, principalmente a partir de muestras de tejido canceroso 2,11,12,13.

En general, los protocolos para la extracción de ácidos nucleicos de tejidos FFPE se pueden diferenciar en tres grupos principales. El primer grupo de métodos, el más utilizado, incluye los sistemas de columnas a base de sílice disponibles en el mercado¹⁴. El segundo grupo involucra métodos manuales de extracción en fase orgánica con fenol y cloroformo, descritos por primera vez por Joseph Sambrook y David W. Russell¹⁵. Como tercer grupo, en los últimos años se han establecido sistemas automatizados, como los sistemas de manipulación de líquidos, así como los sistemas paramagnéticos basados en partículas¹⁶. Cada uno de los tres sistemas nombrados tiene diferentes ventajas y desventajas, como productos químicos peligrosos (es decir, xileno, fenol, cloroformo), altos costos¹⁷, mano de obra¹⁸ y consumo de tiempo¹⁹. Especialmente, para la muestra de tejido difícil, así como para los análisis de alto rendimiento, la estandarización, la reproducibilidad, el consumo de tiempo relativamente bajo, la mano de obra y los costos son las características más relevantes para encontrar un método adecuado para el aislamiento de ácidos nucleicos²⁰. Se sabe que los métodos de extracción automatizados muestran mejores resultados reproducibles y son más sensibles para biopsias pequeñas. Además, se necesita menos cantidad de tejido o sangre y se reduce el riesgo de obstrucción del sistema debido a las altas cantidades de parafina. Aunque las máquinas para la extracción automatizada de ácidos nucleicos y los kits necesarios son más caros en comparación con los métodos manuales, siguen siendo convincentes debido a los procesos de extracción menos problemáticos. La búsqueda bibliográfica proporciona una gran cantidad de publicaciones que ilustran una comparación directa entre los métodos de extracción manual, en columna y automatizados de ADN y ARN de diferentes tejidos y organismos, como plantas, animales y humanos, así como de células en cultivo 20,21,22. También hay evidencias presentes en la literatura que muestran que el ADN y el ARN aislados de tejido congelado de 10 años de antigüedad pueden utilizarse para análisis posteriores como PCR, PCR cuantitativa, NGS, análisis de metilación y clonación 9,23,24,25,26.

El principal problema con, por ejemplo, el tejido vascular humano envejecido, así como las biopsias de tejido pequeño, especialmente en lo que respecta a las muestras de FFPE, es la falta de células en las lesiones ateroscleróticas altamente calcificadas, lo que conduce a bajas concentraciones de ácidos nucleicos¹. Aunque ya se han establecido y se utilizan ampliamente varios métodos para la extracción de ADN a partir de tejido FFPE, los métodos manuales de preparación de muestras requieren un largo tiempo de manipulación²⁷ y son necesarios reactivos tóxicos como el xileno o el fenol para la desparafinación². Como se ha descrito, el proceso de desparafinación es un paso crucial que requiere mucho tiempo (por ejemplo, alrededor de 30 minutos) y que afecta notablemente la calidad y cantidad del ADN extraído (por ejemplo, efectos tóxicos sobre el ADN, como la fragmentación y degradación de la solución de desparafinación y las altas temperaturas)²⁸. Los nuevos protocolos de extracción de ADN desarrollados recientemente se centran en el uso de otras soluciones de desparafinación no tóxicas, estrategias de reparación y tecnologías automatizadas de perlas. En particular, se ha demostrado que los métodos automatizados y semiautomatizados son exitosos en la extracción de ADN con una recuperación eficiente, ausencia de contaminación cruzada y fácil rendimiento²⁹. Hemos establecido un protocolo que supera estas limitaciones. Como resultado, nuestra técnica permite una reducción del tiempo de procesamiento y manipulación con los más altos estándares cuantitativos y cualitativos.

Especialmente en el caso de los análisis reproducibles de alto rendimiento, como el genotipado, los estudios epigenómicos y la secuenciación de ARN, la manipulación de muestras de FFPE con sistemas de purificación basados en columnas suele ser difícil y requiere mucho tiempo (por ejemplo, largos pasos de desparafinización, obstrucción de columnas y largos tiempos de manipulación). La obstrucción de las membranas de sílice debido a la gran cantidad de parafina es el principal problema. Otras circunstancias que pueden empeorar el aislamiento de ácidos nucleicos de alta calidad son pequeñas cantidades de tejido como microbiopsias de piel, tejido pequeño de ratón, tejido muy graso o calcificado como placas, tejido osificado y muestras envejecidas. Especialmente en el ámbito del diagnóstico y la medicina forense, los sistemas automatizados y semiautomatizados, como la manipulación de líquidos o los métodos de extracción basados en partículas paramagnéticas, se han vuelto cada vez más esenciales en los últimos años^30,31, principalmente debido a los tiempos de intervención relativamente bajos y a la posibilidad de estandarización. La mayoría de los protocolos ya publicados funcionan perfectamente para tejidos lisos con cantidades altas o medias de células, como biopsias tumorales o tejido vegetal 13,22,32. La literatura sobre los métodos semiautomatizados basados en partículas utilizados para aislar el ADN de tejidos relativamente difíciles de manejar, como células individuales fijas, vasos calcificados, tejido rico en colágeno y tejido graso con un número bajo de células, solo se describe de manera deficiente³³.

En este estudio, se describe un método semiautomatizado optimizado para el aislamiento de ADN a partir de secciones vasculares incluidas en parafina, comparándolo con dos protocolos manuales basados en columnas. La cantidad, pureza y grado de fragmentación del ADN se utilizaron para la validación. Se utilizó como punto de partida el protocolo de ADN sanguíneo disponible en el mercado y posteriormente se optimizaron los pasos manuales del sistema semiautomatizado para el uso de FFPE, así como de muestras frescas de tejido congelado de tejido humano y animal, combinando los pasos del FFPE y el protocolo de tejidos. El paso automatizado de este protocolo está preinstalado en el instrumento y depende del kit utilizado (en este caso, el kit de ADN sanguíneo). Con el sistema semiautomático basado en cartucho descrito es posible aislar ADN de sangre, tejido fresco congelado, tejido fijado en formol e incluso células individuales con el mismo protocolo, máquina, kit y consumibles, en lugar de utilizar diferentes protocolos y kits para el instrumento, como recomienda la empresa. Solo hay pequeñas diferencias en los protocolos, como un tampón y algunos tiempos de incubación para las diferentes aplicaciones, lo que hace que este protocolo sea muy útil para extraer ADN de todo tipo de tejidos. Nuestro protocolo está optimizado principalmente para tejido vascular humano calcificado, pobre en células y fibroso, pero, por supuesto, se puede utilizar y optimizar aún más para todo tipo de tejidos difíciles mencionados anteriormente.

En resumen, para los investigadores en el campo cardiovascular que trabajan en la aterosclerosis (por ejemplo, aorta, arterias carótidas, arterias coronarias) proporcionamos un protocolo punto por punto fácil de usar para la extracción semiautomatizada de ADN de muestras vasculares de FFPE.

Protocolo

El permiso para recolectar especímenes ateroscleróticos carotídeos humanos en nuestro biobanco fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital local (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Munich, Alemania). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki.

1. Preparación de tejidos

1. Prepare de 5 a 8 secciones de tejido de 10 μm a partir de la muestra de FFPE con el micrótomo y transfiérelo en un tubo de 1,5 mL. No es necesario reducir el exceso de parafina del bloque.
   NOTA: Las secciones individuales más delgadas en lugar de una sección grande aceleran la reacción del tampón. Deseche las primeras secciones debido a la exposición a O₂ . Para muestras más grandes, también es posible utilizar menos secciones.
2. Centrifugar estos tubos en una centrífuga de sobremesa, ajustada a 5.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente para recoger cada muestra en la parte inferior del tubo.
   PRECAUCIÓN: Una centrifugación demasiado prolongada conduce a la coagulación de la muestra y complica la lisis.

2. Disolución de lípidos y desparafinación

NOTA: Este paso es necesario para la desparafinación y la digestión de lípidos. El tampón utilizado es menos tóxico que las soluciones comerciales de desparafina.

1. Añada 300 μL del tampón de incubación disponible en el mercado y 6 μL de 1-tioglicerol a cada tubo.
   NOTA: No utilice más de 300 μL, ya que este es el volumen máximo del cartucho del sistema de automatización.
2. Vórtice durante 10 s e incube la muestra durante 10 minutos a 80 °C y 500 rpm en un bloque calefactor para solubilizar la parafina.
   PRECAUCIÓN: El tejido debe estar completamente disuelto al final. Si es necesario, vórtice varias veces durante la incubación.

3. Digestión de muestras y proteínas

NOTA: La digestión nativa con proteasa K es crucial para tener extractos de ADN limpios sin proteínas. También reduce las proteínas contaminantes presentes. Además, las nucleasas también se destruyen para salvar el ADN³⁴. Este paso nocturno también es necesario para la digestión completa de la muestra.

1. Deje que la muestra se enfríe a 60 °C y luego agregue 30 μL de la solución de proteinasa K proporcionada.
2. Vuelva a vórtice e incube la mezcla a 65 °C y 500 rpm durante la noche (4-20 h) en un bloque calefactor. Agite las muestras durante la incubación de vez en cuando para una digestión completa de la muestra.
   NOTA: La incubación nocturna conduce a mejores resultados. Se recomiendan pasos de mezcla cada 30-60 minutos. Al final, no debe haber ninguna pieza de tejido visual dentro del tubo.

4. Lisis celular

1. Añada en breve 400 μL del tampón de lisis, incluido en el kit de sangre y en el vórtice.
2. Vuelva a incubar la muestra a 65 °C durante 30 min a 500 rpm.
3. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente. La parafina se endurecerá en la parte superior.
   PRECAUCIÓN: No vuelva a hacer vórtice, para mantener la parafina separada de la muestra. De lo contrario, la parafina se mezcla con el tejido, lo que destruye la muestra. La muestra se recogerá en el paso 6.1.

5. Preparación de los cartuchos predispensados

1. Encienda el equipo, así como la tableta asociada.
2. Inicie la aplicación de software y haga clic en el botón Puerta para abrir el instrumento.
3. Retire la gradilla del instrumento e inserte el cartucho precargado en la gradilla de la sonda. Asegúrese de que el cartucho haga clic dos veces cuando esté en su lugar y retire la lámina de sellado.
4. Agregue el émbolo en el último (8) pocillo del cartucho. Sirve como punta de pipeta en el instrumento.
5. Llene los tubos de elución de 0,5 mL suministrados con 65 μL de tampón de elución, suministrados con el kit. Deje los tubos abiertos e insértelos en la posición dedicada en la parte delantera del rack, después del cartucho.
   NOTA: El volumen mínimo para la elución es de 60 μL. El sistema perderá de 5 a 10 μL del volumen de elución añadido.

6. Extracción automatizada de ADN

1. Perfore con cuidado la parafina en la parte superior del tubo de 1,5 ml del paso 4.3 para llegar a la muestra limpia en el fondo del tubo sin volver a mezclarla con la parafina.
2. Transfiera toda la mezcla (730 μL) de la muestra preparada en el primer pocillo del cartucho.
3. Inserte la rejilla en la máquina automática de extracción de ADN. Asegúrese de que la rejilla se bloquee primero en la parte trasera de la máquina y luego en la parte delantera.
4. Inicie la ejecución haciendo clic en el botón naranja de inicio superior izquierdo en el software. Se abrirá una ventana con diferentes protocolos preinstalados. Seleccione Protocolo de ADN sanguíneo en el instrumento. Confirme que se agregaron el émbolo, el tubo de elución y la muestra haciendo clic en sí en el software. La puerta del instrumento se cerrará automáticamente y comenzará la carrera (la luz se volverá verde). La carrera durará aproximadamente 38 min. No es necesaria ninguna calibración adicional.
   NOTA: Observe hasta que el sistema haya recogido los émbolos de todas las muestras en el estante. Si esto no sucede, el sistema se detiene automáticamente y se debe reiniciar el protocolo de la máquina.
5. Asegúrese de que el sistema realice el paso de lisis automatizado en el primer pocillo del cartucho, seguido de los pasos de lavado en los pocillos 3 a 7. No se necesita ningún otro paso de programación. El programa completo está preinstalado por la empresa.
6. Una vez hecho esto, asegúrese de que el sistema eluya el ADN en los tubos de elución preparados a través del émbolo agregado. Las partículas magnéticas permanecen en el émbolo. El émbolo al final vuelve al último pocillo del cartucho.

7. Termina la carrera

1. Cuando se complete la carrera (la máquina muestra una luz verde parpadeante), abra el instrumento haciendo clic en el botón de apertura (señal de puerta) y retire el bastidor del sistema.
2. Deseche los cartuchos.
3. Vuelva a insertar el bastidor vacío en el instrumento y cierre la puerta a través del botón de la puerta en la esquina superior derecha. Cierre la aplicación de software y apague la máquina, así como la tableta.
4. Almacene los eluidos a -20 °C para el almacenamiento a largo plazo o a 4 °C para el almacenamiento a corto plazo, o utilícelo directamente para análisis posteriores o mediciones de concentración.

Resultados

Para el establecimiento del protocolo se utilizaron 5 bloques de tejido FFPE de pacientes con aterosclerosis de la arteria carótida. El ADN se aisló con un protocolo semiautomatizado optimizado (kit C), así como con dos protocolos manuales basados en columnas disponibles comercialmente (kit A y kit B, ver Tabla de Materiales). La extracción de ADN con los kits A y B se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. El único cambio que se hizo en el protocolo d...

Discusión

Los métodos de extracción de ADN para el tejido FFPE varían en calidad y cantidad de ADN aislado, lo que inevitablemente afecta el rendimiento de los análisis posteriores. Por lo tanto, la automatización se está volviendo imperativa para mejorar el flujo de trabajo y la estandarización, así como la gestión de la calidad. Por lo tanto, en el presente estudio, se evaluó un método semiautomatizado para la extracción de ADN a partir de muestras de FFPE que demostró mejores resul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes for sample incubation	Eppendorf, Hamburg, Germany	30120086
1-Thioglycerol	Promega, Walldorf, Germany	A208
Agilent tape station software 3.2	Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS Kit	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q32851
FFPE DNA Purification Kits (Kit A)	Norgene Biotek, Heidelberg, Germany	47400
FFPE tissue samples n=5	Munich Vascular Biobank,Munich, Germany
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)	Qiagen, Hilden, Germany	180134
Heating blocks, set to 80°C and 65°C	VWR,Darmstadt,Germany	460-0250
High Sensitivity D5000 reagents	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5593
High Sensitivity D5000 ScreenTape	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5592
Incubation Buffer	Promega, Walldorf, Germany	D920
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase K	Promega, Walldorf, Germany	AS1400
Maxwell RSC 48 Instrument	Promega, Walldorf, Germany	AS8500
Microcentrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c Spectrometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	ND-2000C
Optical caps	Agilent, Waldbronn, Germany	401425
Optical tube strips	Agilent, Waldbronn, Germany	401428
Pipettors and pipette tips	Eppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 for statistics, version 6.01	GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q33216
TapeStation 4200	Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan, Männedorf, Swizerland	IN-MNANO