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Method Article
Aquí, presentamos un protocolo para la extracción semiautomatizada de ADN de lesiones fijadas en formol e incluidas en parafina de las arterias carótidas humanas. La lisis de tejidos se realiza sin xileno tóxico, a la que sigue un protocolo automatizado de extracción de ADN, que incluye una segunda etapa de lisis, la unión del ADN a partículas paramagnéticas para la unión basada en celulosa, las etapas de lavado y la elución del ADN.
Los tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) representan una valiosa fuente para análisis moleculares y estudios genómicos clínicos. Estos tejidos suelen ser pobres en células o difíciles de procesar. Por lo tanto, los ácidos nucleicos deben aislarse cuidadosamente. En los últimos años, se han establecido varios métodos para el aislamiento de ADN para tejidos de muchas enfermedades, principalmente el cáncer. Desafortunadamente, el ADN genómico extraído de los tejidos FFPE está altamente degradado debido a la reticulación entre las hebras de ácido nucleico y las proteínas, así como a las rupturas aleatorias en la secuencia. Por lo tanto, la calidad del ADN de estas muestras se reduce notablemente, lo que supone un reto para futuros análisis moleculares posteriores. Otros problemas con los tejidos difíciles son, por ejemplo, la falta de células en las lesiones ateroscleróticas humanas calcificadas y en el tejido graso, las pequeñas biopsias de piel y, en consecuencia, la baja disponibilidad de los ácidos nucleicos deseados, como también ocurre en los tejidos viejos o fijos.
En nuestros laboratorios, hemos establecido un método para la extracción de ADN de lesiones ateroscleróticas fijadas en formol, utilizando un sistema de aislamiento semiautomatizado. Comparamos este método con otros protocolos de extracción disponibles comercialmente y nos centramos en análisis posteriores. La pureza y concentración del ADN se midieron mediante espectrometría y fluorometría. Se evaluó el grado de fragmentación y la calidad general.
La mayor cantidad y calidad de ADN se obtuvo con el protocolo de ADN sanguíneo modificado para el sistema de extracción automatizado, en lugar del protocolo comercial FFPE. Con este protocolo paso a paso, los rendimientos de ADN de las muestras de FFPE fueron, en promedio, cuatro veces más altos y menos especímenes fallaron en el proceso de extracción, que es crítico cuando se trata de biopsias de vasos pequeños. Los tamaños de amplicón de 200 a 800 pb pudieron detectarse mediante PCR. Este estudio muestra que, aunque el ADN obtenido de nuestro tejido FFPE está muy fragmentado, aún se puede utilizar para la amplificación y secuenciación exitosas de productos más cortos. En conclusión, en nuestras manos, la tecnología automatizada parece ser el mejor sistema para la extracción de ADN, especialmente para pequeñas muestras de tejido FFPE.
La fijación en formol seguida de inclusión en parafina (FFPE) es un procedimiento estándar para la conservación a largo plazo de muestras patológicas en biobancos1. Estas muestras proporcionan una valiosa fuente para estudios histológicos, así como para análisis moleculares, especialmente estudios genéticos2. Otras ventajas de los tejidos FFPE son un mejor almacenamiento a largo plazo, menores costes y condiciones de almacenamiento más sencillas. Nuestra intención aquí es proporcionar un protocolo confiable y fácil de usar para el aislamiento de ácidos nucleicos reproducibles a partir de pequeñas cantidades de secciones de FFPE, ya que la extracción de ADN de alta calidad es el primer paso crucial en una amplia gama de técnicas moleculares y los tejidos FFPE son la fuente más disponible de muestras.
Los nuevos enfoques científicos, como la secuenciación de próxima generación (NGS) y los enfoques de investigación "ómica", requieren una alta calidad de los ácidos nucleicos 3,4,5. La extracción de ADN de muestras de tejido FFPE sigue siendo una tarea difícil. El ADN de las muestras de FFPE puede variar ampliamente en calidad y cantidad, dependiendo de su edad y condiciones de fijación. La formalina, el compuesto más utilizado, conduce a la reticulación ADN-proteína 6,7,8 y provoca una rotura aleatoria inespecífica en la secuencia de nucleótidos9. Esto puede tener un impacto significativo en los análisis genómicos posteriores, ya que la reticulación puede desactivar la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 6,10. Debido a los contaminantes durante el proceso de fijación, la pureza del ADN aislado de las muestras de FFPE suele ser limitada. En los últimos años, se establecieron varios métodos para el aislamiento de ADN, principalmente a partir de muestras de tejido canceroso 2,11,12,13.
En general, los protocolos para la extracción de ácidos nucleicos de tejidos FFPE se pueden diferenciar en tres grupos principales. El primer grupo de métodos, el más utilizado, incluye los sistemas de columnas a base de sílice disponibles en el mercado14. El segundo grupo involucra métodos manuales de extracción en fase orgánica con fenol y cloroformo, descritos por primera vez por Joseph Sambrook y David W. Russell15. Como tercer grupo, en los últimos años se han establecido sistemas automatizados, como los sistemas de manipulación de líquidos, así como los sistemas paramagnéticos basados en partículas16. Cada uno de los tres sistemas nombrados tiene diferentes ventajas y desventajas, como productos químicos peligrosos (es decir, xileno, fenol, cloroformo), altos costos17, mano de obra18 y consumo de tiempo19. Especialmente, para la muestra de tejido difícil, así como para los análisis de alto rendimiento, la estandarización, la reproducibilidad, el consumo de tiempo relativamente bajo, la mano de obra y los costos son las características más relevantes para encontrar un método adecuado para el aislamiento de ácidos nucleicos20. Se sabe que los métodos de extracción automatizados muestran mejores resultados reproducibles y son más sensibles para biopsias pequeñas. Además, se necesita menos cantidad de tejido o sangre y se reduce el riesgo de obstrucción del sistema debido a las altas cantidades de parafina. Aunque las máquinas para la extracción automatizada de ácidos nucleicos y los kits necesarios son más caros en comparación con los métodos manuales, siguen siendo convincentes debido a los procesos de extracción menos problemáticos. La búsqueda bibliográfica proporciona una gran cantidad de publicaciones que ilustran una comparación directa entre los métodos de extracción manual, en columna y automatizados de ADN y ARN de diferentes tejidos y organismos, como plantas, animales y humanos, así como de células en cultivo 20,21,22. También hay evidencias presentes en la literatura que muestran que el ADN y el ARN aislados de tejido congelado de 10 años de antigüedad pueden utilizarse para análisis posteriores como PCR, PCR cuantitativa, NGS, análisis de metilación y clonación 9,23,24,25,26.
El principal problema con, por ejemplo, el tejido vascular humano envejecido, así como las biopsias de tejido pequeño, especialmente en lo que respecta a las muestras de FFPE, es la falta de células en las lesiones ateroscleróticas altamente calcificadas, lo que conduce a bajas concentraciones de ácidos nucleicos1. Aunque ya se han establecido y se utilizan ampliamente varios métodos para la extracción de ADN a partir de tejido FFPE, los métodos manuales de preparación de muestras requieren un largo tiempo de manipulación27 y son necesarios reactivos tóxicos como el xileno o el fenol para la desparafinación2. Como se ha descrito, el proceso de desparafinación es un paso crucial que requiere mucho tiempo (por ejemplo, alrededor de 30 minutos) y que afecta notablemente la calidad y cantidad del ADN extraído (por ejemplo, efectos tóxicos sobre el ADN, como la fragmentación y degradación de la solución de desparafinación y las altas temperaturas)28. Los nuevos protocolos de extracción de ADN desarrollados recientemente se centran en el uso de otras soluciones de desparafinación no tóxicas, estrategias de reparación y tecnologías automatizadas de perlas. En particular, se ha demostrado que los métodos automatizados y semiautomatizados son exitosos en la extracción de ADN con una recuperación eficiente, ausencia de contaminación cruzada y fácil rendimiento29. Hemos establecido un protocolo que supera estas limitaciones. Como resultado, nuestra técnica permite una reducción del tiempo de procesamiento y manipulación con los más altos estándares cuantitativos y cualitativos.
Especialmente en el caso de los análisis reproducibles de alto rendimiento, como el genotipado, los estudios epigenómicos y la secuenciación de ARN, la manipulación de muestras de FFPE con sistemas de purificación basados en columnas suele ser difícil y requiere mucho tiempo (por ejemplo, largos pasos de desparafinización, obstrucción de columnas y largos tiempos de manipulación). La obstrucción de las membranas de sílice debido a la gran cantidad de parafina es el principal problema. Otras circunstancias que pueden empeorar el aislamiento de ácidos nucleicos de alta calidad son pequeñas cantidades de tejido como microbiopsias de piel, tejido pequeño de ratón, tejido muy graso o calcificado como placas, tejido osificado y muestras envejecidas. Especialmente en el ámbito del diagnóstico y la medicina forense, los sistemas automatizados y semiautomatizados, como la manipulación de líquidos o los métodos de extracción basados en partículas paramagnéticas, se han vuelto cada vez más esenciales en los últimos años30,31, principalmente debido a los tiempos de intervención relativamente bajos y a la posibilidad de estandarización. La mayoría de los protocolos ya publicados funcionan perfectamente para tejidos lisos con cantidades altas o medias de células, como biopsias tumorales o tejido vegetal 13,22,32. La literatura sobre los métodos semiautomatizados basados en partículas utilizados para aislar el ADN de tejidos relativamente difíciles de manejar, como células individuales fijas, vasos calcificados, tejido rico en colágeno y tejido graso con un número bajo de células, solo se describe de manera deficiente33.
En este estudio, se describe un método semiautomatizado optimizado para el aislamiento de ADN a partir de secciones vasculares incluidas en parafina, comparándolo con dos protocolos manuales basados en columnas. La cantidad, pureza y grado de fragmentación del ADN se utilizaron para la validación. Se utilizó como punto de partida el protocolo de ADN sanguíneo disponible en el mercado y posteriormente se optimizaron los pasos manuales del sistema semiautomatizado para el uso de FFPE, así como de muestras frescas de tejido congelado de tejido humano y animal, combinando los pasos del FFPE y el protocolo de tejidos. El paso automatizado de este protocolo está preinstalado en el instrumento y depende del kit utilizado (en este caso, el kit de ADN sanguíneo). Con el sistema semiautomático basado en cartucho descrito es posible aislar ADN de sangre, tejido fresco congelado, tejido fijado en formol e incluso células individuales con el mismo protocolo, máquina, kit y consumibles, en lugar de utilizar diferentes protocolos y kits para el instrumento, como recomienda la empresa. Solo hay pequeñas diferencias en los protocolos, como un tampón y algunos tiempos de incubación para las diferentes aplicaciones, lo que hace que este protocolo sea muy útil para extraer ADN de todo tipo de tejidos. Nuestro protocolo está optimizado principalmente para tejido vascular humano calcificado, pobre en células y fibroso, pero, por supuesto, se puede utilizar y optimizar aún más para todo tipo de tejidos difíciles mencionados anteriormente.
En resumen, para los investigadores en el campo cardiovascular que trabajan en la aterosclerosis (por ejemplo, aorta, arterias carótidas, arterias coronarias) proporcionamos un protocolo punto por punto fácil de usar para la extracción semiautomatizada de ADN de muestras vasculares de FFPE.
El permiso para recolectar especímenes ateroscleróticos carotídeos humanos en nuestro biobanco fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital local (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Munich, Alemania). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki.
1. Preparación de tejidos
2. Disolución de lípidos y desparafinación
NOTA: Este paso es necesario para la desparafinación y la digestión de lípidos. El tampón utilizado es menos tóxico que las soluciones comerciales de desparafina.
3. Digestión de muestras y proteínas
NOTA: La digestión nativa con proteasa K es crucial para tener extractos de ADN limpios sin proteínas. También reduce las proteínas contaminantes presentes. Además, las nucleasas también se destruyen para salvar el ADN34. Este paso nocturno también es necesario para la digestión completa de la muestra.
4. Lisis celular
5. Preparación de los cartuchos predispensados
6. Extracción automatizada de ADN
7. Termina la carrera
Para el establecimiento del protocolo se utilizaron 5 bloques de tejido FFPE de pacientes con aterosclerosis de la arteria carótida. El ADN se aisló con un protocolo semiautomatizado optimizado (kit C), así como con dos protocolos manuales basados en columnas disponibles comercialmente (kit A y kit B, ver Tabla de Materiales). La extracción de ADN con los kits A y B se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. El único cambio que se hizo en el protocolo d...
Los métodos de extracción de ADN para el tejido FFPE varían en calidad y cantidad de ADN aislado, lo que inevitablemente afecta el rendimiento de los análisis posteriores. Por lo tanto, la automatización se está volviendo imperativa para mejorar el flujo de trabajo y la estandarización, así como la gestión de la calidad. Por lo tanto, en el presente estudio, se evaluó un método semiautomatizado para la extracción de ADN a partir de muestras de FFPE que demostró mejores resul...
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.
El establecimiento del protocolo para la extracción automatizada de ADN fue apoyado por el Dr. Paul Muschler de la empresa Promega. Agradecemos a Paul Muschler por su apoyo y contribución científica. También agradecemos a nuestro colega Dr. Moritz von Scheidt (Centro Alemán del Corazón de Munich) por proporcionarnos el instrumento Maxwell y por apoyar la parte experimental. Todos los experimentos se realizaron en los laboratorios del Centro Alemán del Corazón (Múnich, Alemania) y del Klinikum rechts der Isar (Múnich, Alemania). La investigación fue financiada por DFG (PE 900/6-1).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 ml tubes for sample incubation | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30120086 | |
1-Thioglycerol | Promega, Walldorf, Germany | A208 | |
Agilent tape station software 3.2 | Agilent, Waldbronn, Germany | ||
dsDNA HS Kit | ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany | Q32851 | |
FFPE DNA Purification Kits (Kit A) | Norgene Biotek, Heidelberg, Germany | 47400 | |
FFPE tissue samples n=5 | Munich Vascular Biobank,Munich, Germany | ||
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B) | Qiagen, Hilden, Germany | 180134 | |
Heating blocks, set to 80°C and 65°C | VWR,Darmstadt,Germany | 460-0250 | |
High Sensitivity D5000 reagents | Agilent, Waldbronn, Germany | 5067-5593 | |
High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent, Waldbronn, Germany | 5067-5592 | |
Incubation Buffer | Promega, Walldorf, Germany | D920 | |
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase K | Promega, Walldorf, Germany | AS1400 | |
Maxwell RSC 48 Instrument | Promega, Walldorf, Germany | AS8500 | |
Microcentrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
NanoDrop 2000c Spectrometer | ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany | ND-2000C | |
Optical caps | Agilent, Waldbronn, Germany | 401425 | |
Optical tube strips | Agilent, Waldbronn, Germany | 401428 | |
Pipettors and pipette tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Prism 6 for statistics, version 6.01 | GraphPad Inc., San Diego, California | ||
Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany | Q33216 | |
TapeStation 4200 | Agilent, Waldbronn, Germany | ||
Tecan Infinite M200 Pro | Tecan, Männedorf, Swizerland | IN-MNANO |
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