È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Method Article
Qui, presentiamo un protocollo per l'estrazione semi-automatica del DNA da lesioni incluse in paraffina fissate in formalina delle arterie carotidi umane. La lisi tissutale viene eseguita senza xilene tossico, seguita da un protocollo automatizzato di estrazione del DNA, che include una seconda fase di lisi, il legame del DNA alle particelle paramagnetiche per il legame a base di cellulosa, le fasi di lavaggio e l'eluizione del DNA.
I tessuti FFPE (FFPE) fissati in formalina rappresentano una fonte preziosa per le analisi molecolari e gli studi di genomica clinica. Questi tessuti sono spesso poveri di cellule o difficili da elaborare. Pertanto, gli acidi nucleici devono essere accuratamente isolati. Negli ultimi anni, sono stati messi a punto vari metodi per l'isolamento del DNA per i tessuti di molte malattie, soprattutto tumori. Sfortunatamente, il DNA genomico estratto dai tessuti FFPE è altamente degradato a causa della reticolazione tra filamenti di acido nucleico e proteine, nonché di rotture casuali nella sequenza. Pertanto, la qualità del DNA di questi campioni è notevolmente ridotta, il che lo rende una sfida per ulteriori analisi molecolari a valle. Altri problemi con i tessuti difficili sono, ad esempio, la mancanza di cellule nelle lesioni aterosclerotiche umane calcificate e nel tessuto adiposo, piccole biopsie cutanee e di conseguenza la bassa disponibilità degli acidi nucleici desiderati come avviene anche nei tessuti vecchi o fissi.
Nei nostri laboratori, abbiamo messo a punto un metodo per l'estrazione del DNA da lesioni aterosclerotiche fissate in formalina, utilizzando un sistema di isolamento semiautomatico. Abbiamo confrontato questo metodo con altri protocolli di estrazione disponibili in commercio e ci siamo concentrati su ulteriori analisi a valle. La purezza e la concentrazione del DNA sono state misurate mediante spettrometria e fluorometria. Sono stati valutati il grado di frammentazione e la qualità complessiva.
La massima quantità e qualità del DNA è stata ottenuta con il protocollo del DNA del sangue modificato per il sistema di estrazione automatizzato, invece del protocollo FFPE commerciale. Con questo protocollo graduale, le rese di DNA dai campioni FFPE erano in media quattro volte superiori e un minor numero di campioni non ha superato il processo di estrazione, il che è fondamentale quando si tratta di biopsie di piccoli vasi. Le dimensioni dell'amplicone da 200 a 800 bp potrebbero essere rilevate mediante PCR. Questo studio dimostra che, sebbene il DNA ottenuto dal nostro tessuto FFPE sia altamente frammentato, può ancora essere utilizzato per l'amplificazione e il sequenziamento di prodotti più corti. In conclusione, nelle nostre mani, la tecnologia automatizzata sembra essere il miglior sistema per l'estrazione del DNA, in particolare per piccoli campioni di tessuto FFPE.
La fissazione della formalina seguita dall'inclusione di paraffina (FFPE) è una procedura standard per la conservazione a lungo termine di campioni patologici nel biobanking1. Questi campioni forniscono una fonte preziosa per gli studi istologici e le analisi molecolari, in particolare per gli studi genetici2. Ulteriori vantaggi dei fazzoletti FFPE sono una migliore conservazione a lungo termine, costi inferiori e condizioni di conservazione più facili. La nostra intenzione è quella di fornire un protocollo affidabile e facile da usare per l'isolamento riproducibile degli acidi nucleici da piccole quantità di sezioni FFPE, poiché l'estrazione del DNA di alta qualità è il primo passo cruciale in un'ampia gamma di tecniche molecolari e i tessuti FFPE sono la fonte di campioni più disponibile.
I nuovi approcci scientifici, come il sequenziamento di nuova generazione (NGS) e gli approcci di ricerca "omici", richiedono un'elevata qualità degli acidi nucleici 3,4,5. L'estrazione del DNA da campioni di tessuto FFPE rimane un'impresa impegnativa. Il DNA dei campioni FFPE può variare notevolmente in qualità e quantità a seconda dell'età e delle condizioni di fissazione. La formalina, il composto più frequentemente usato, porta alla reticolazione DNA-proteina 6,7,8 e provoca una rottura casuale non specifica nella sequenza nucleotidica9. Ciò può avere un impatto significativo sulle analisi genomiche a valle, poiché la reticolazione può disabilitare l'amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR) 6,10. A causa dei contaminanti durante il processo di fissazione, la purezza del DNA isolato dai campioni FFPE è spesso limitata. Negli ultimi anni, sono stati messi a punto vari metodi per l'isolamento del DNA, per lo più da campioni di tessuto tumorale 2,11,12,13.
In generale, i protocolli per l'estrazione di acidi nucleici dal tessuto FFPE possono essere differenziati in tre gruppi principali. Il primo gruppo di metodi, il più comunemente usato, comprende i sistemi di colonne a base di silice disponibili in commercio14. Il secondo gruppo coinvolge metodi manuali di estrazione in fase organica con fenolo e cloroformio, descritti per la prima volta da Joseph Sambrook e David W. Russell15. Come terzo gruppo, negli ultimi anni sono stati istituiti sistemi automatizzati come i sistemi di manipolazione dei liquidi e i sistemi basati su particelle paramagnetiche16. Ciascuno dei tre sistemi citati presenta diversi vantaggi e svantaggi come sostanze chimiche pericolose (ad esempio, xilene, fenolo, cloroformio), costi elevati17, manodopera18 e consumo di tempo19. In particolare, per i campioni di tessuto difficili e per le analisi ad alto rendimento, la standardizzazione, la riproducibilità, il consumo di tempo, la manodopera e i costi relativamente bassi sono le caratteristiche più rilevanti per trovare un metodo adatto per l'isolamento degli acidi nucleici20. È noto che i metodi di estrazione automatizzati mostrano risultati più riproducibili e sono più sensibili per le piccole biopsie. Inoltre, è necessaria una minore quantità di tessuto o sangue e si riduce il rischio di intasamento del sistema a causa di elevate quantità di paraffina. Sebbene le macchine per l'estrazione automatizzata degli acidi nucleici e i kit necessari siano più costosi rispetto ai metodi manuali, sono comunque convincenti grazie ai processi di estrazione meno problematici. La ricerca bibliografica fornisce molte pubblicazioni che illustrano un confronto diretto tra metodi di estrazione manuale, su colonna e automatizzata di DNA e RNA da diversi tessuti e organismi, come piante, animali e esseri umani, nonché cellule in coltura 20,21,22. Ci sono anche prove presenti in letteratura che dimostrano che il DNA e l'RNA isolati da tessuti congelati a scatto di 10 anni possono essere utilizzati per analisi a valle come PCR, PCR quantitativa, NGS, analisi di metilazione e clonazione 9,23,24,25,26.
Il problema principale, ad esempio, dell'invecchiamento del tessuto vascolare umano, così come delle biopsie tissutali di piccole dimensioni, in particolare per quanto riguarda i campioni di FFPE, è la mancanza di cellule nelle lesioni aterosclerotiche altamente calcificate, che di conseguenza porta a basse concentrazioni di acidi nucleici1. Sebbene siano già stati stabiliti diversi metodi per l'estrazione del DNA dal tessuto FFPE e siano ampiamente utilizzati, i metodi di preparazione manuale dei campioni richiedono un lungo tempo di utilizzo27 e reagenti tossici come lo xilene o il fenolo sono necessari per la deparaffinazione2. Come descritto, il processo di deparaffinazione è una fase cruciale che richiede molto tempo (ad esempio, circa 30 minuti) che influisce notevolmente sulla qualità e sulla quantità del DNA estratto (ad esempio, effetti tossici sul DNA, come la frammentazione e la degradazione della soluzione di deparaffinazione e le alte temperature)28. I nuovi protocolli di estrazione del DNA sviluppati di recente si concentrano sull'utilizzo di altre soluzioni di deparaffinazione non tossiche, strategie di riparazione e tecnologie automatizzate per le microsfere. In particolare, è stato dimostrato che i metodi automatizzati e semi-automatizzati hanno successo nell'estrazione del DNA con un recupero efficiente, assenza di contaminazione incrociata e prestazioni facili29. Abbiamo stabilito un protocollo che supera queste limitazioni. Di conseguenza, la nostra tecnica consente una riduzione dei tempi di lavorazione e di intervento manuale ai più alti standard quantitativi e qualitativi.
Soprattutto per le analisi riproducibili ad alto rendimento come la genotipizzazione, gli studi epigenomici e il sequenziamento dell'RNA, la gestione dei campioni FFPE con i sistemi di purificazione basati su colonna è spesso difficile e richiede molto tempo (ad esempio, lunghe fasi di deparaffinazione, intasamento della colonna e lunghi tempi di utilizzo). L'intasamento delle membrane di silice a causa dell'elevata quantità di paraffina è il problema principale. Altre circostanze che possono peggiorare l'isolamento di acidi nucleici di alta qualità sono piccole quantità di tessuto come micro-biopsie della pelle, piccoli tessuti di topo, tessuti molto grassi o calcificati come placche, tessuto ossificato e campioni invecchiati. Soprattutto nella diagnosi e nella medicina legale, negli ultimi anni i sistemi automatizzati e semi-automatizzati come la manipolazione dei liquidi o i metodi di estrazione basati su particelle paramagnetichesono diventati sempre più essenziali, principalmente a causa dei tempi di intervento relativamente bassi e della possibilità di standardizzazione. La maggior parte dei protocolli già pubblicati funziona perfettamente per i tessuti lisci con quantità elevate o medie di cellule, come le biopsie tumorali o i tessuti vegetali 13,22,32. La letteratura sui metodi semi-automatizzati basati su particelle utilizzate per isolare il DNA da tessuti relativamente difficili da maneggiare come singole cellule fisse, vasi calcificati, tessuti ricchi di collagene e tessuto adiposo con un basso numero di cellule è scarsamente descritta33.
In questo studio, viene descritto un metodo semi-automatico ottimizzato per l'isolamento del DNA da sezioni incluse in paraffina vascolare, confrontandolo con due protocolli manuali basati su colonne. Per la convalida sono state utilizzate la quantità, la purezza e l'entità della frammentazione del DNA. Il protocollo del DNA del sangue, disponibile in commercio, è stato utilizzato come punto di partenza e le fasi manuali del sistema semi-automatico sono state successivamente ottimizzate per l'uso di FFPE e campioni di tessuto fresco congelato da tessuti umani e animali, combinando le fasi del FFPE e del protocollo tissutale. La fase automatizzata di questo protocollo è preinstallata sullo strumento e dipende dal kit utilizzato (qui, il kit del DNA del sangue). Con il sistema semi-automatizzato basato su cartuccia descritto è possibile isolare il DNA dal sangue, dal tessuto fresco congelato, dal tessuto fissato in formalina e persino da singole cellule con lo stesso protocollo, la stessa macchina, lo stesso kit e gli stessi materiali di consumo, invece di utilizzare protocolli e kit diversi per lo strumento, come raccomandato dall'azienda. Ci sono solo piccole differenze nei protocolli, come un tampone e alcuni tempi di incubazione per le diverse applicazioni, il che rende questo protocollo molto utile per estrarre il DNA da tutti i tipi di tessuti. Il nostro protocollo è ottimizzato principalmente per il tessuto vascolare umano calcificato, povero di cellule e fibroso, ma può ovviamente essere utilizzato e ulteriormente ottimizzato per tutti i tipi di tessuti difficili sopra menzionati.
Riassumendo, per i ricercatori nel campo cardiovascolare che lavorano sull'aterosclerosi (ad esempio, aorta, arterie carotidi, arterie coronarie) forniamo un protocollo punto per punto facile da usare per l'estrazione semi-automatizzata del DNA da campioni di FFPE vascolare.
L'autorizzazione a raccogliere campioni aterosclerotici carotidei umani nella nostra biobanca è stata approvata dal Comitato Etico Ospedaliero locale (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Monaco di Baviera, Germania). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti. Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki.
1. Preparazione dei tessuti
2. Dissoluzione e deparaffinazione dei lipidi
NOTA: Questo passaggio è necessario per la deparaffinazione e la digestione dei lipidi. Il tampone utilizzato è meno tossico delle soluzioni di deparaffinazione commerciali.
3. Digestione del campione e delle proteine
NOTA: La digestione nativa con proteasi K è fondamentale per avere estratti di DNA puliti senza proteine. Riduce inoltre le proteine contaminanti presenti. Inoltre, anche le nucleasi vengono distrutte per salvare il DNA34. Questa fase notturna è necessaria anche per la digestione completa del campione.
4. Lisi cellulare
5. Preparazione delle cartucce pre-dosate
6. Estrazione automatizzata del DNA
7. Termina la corsa
Per la definizione del protocollo, sono stati utilizzati 5 blocchi di tessuto FFPE da pazienti con aterosclerosi dell'arteria carotide. Il DNA è stato isolato con un protocollo semi-automatico ottimizzato (kit C) e con due protocolli manuali basati su colonne disponibili in commercio (kit A e kit B, vedi Tabella dei materiali). L'estrazione del DNA con i kit A e B è stata eseguita secondo il protocollo del produttore. L'unica modifica che è stata apportata al protocol...
I metodi di estrazione del DNA per il tessuto FFPE variano in qualità e quantità di DNA isolato, il che influisce inevitabilmente sulle prestazioni di ulteriori analisi a valle. Pertanto, l'automazione sta diventando imperativa per migliorare il flusso di lavoro e la standardizzazione, nonché la gestione della qualità. Pertanto, nel presente studio, è stato valutato un metodo semi-automatizzato per l'estrazione del DNA da campioni FFPE che ha dimostrato risultati migliori rispetto a...
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.
L'istituzione del protocollo per l'estrazione automatizzata del DNA è stata supportata dal Dr. Paul Muschler dell'azienda Promega. Ringraziamo Paul Muschler per il suo sostegno e il suo contributo scientifico. Ringraziamo anche il nostro collega Dr. Moritz von Scheidt (German Heart Center Munich) per averci fornito lo strumento Maxwell e per aver supportato la parte sperimentale. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nei laboratori del German Heart Centre (Monaco di Baviera, Germania) e del Klinikum rechts der Isar (Monaco di Baviera, Germania). La ricerca è stata finanziata dal DFG (PE 900/6-1).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 ml tubes for sample incubation | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30120086 | |
1-Thioglycerol | Promega, Walldorf, Germany | A208 | |
Agilent tape station software 3.2 | Agilent, Waldbronn, Germany | ||
dsDNA HS Kit | ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany | Q32851 | |
FFPE DNA Purification Kits (Kit A) | Norgene Biotek, Heidelberg, Germany | 47400 | |
FFPE tissue samples n=5 | Munich Vascular Biobank,Munich, Germany | ||
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B) | Qiagen, Hilden, Germany | 180134 | |
Heating blocks, set to 80°C and 65°C | VWR,Darmstadt,Germany | 460-0250 | |
High Sensitivity D5000 reagents | Agilent, Waldbronn, Germany | 5067-5593 | |
High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent, Waldbronn, Germany | 5067-5592 | |
Incubation Buffer | Promega, Walldorf, Germany | D920 | |
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase K | Promega, Walldorf, Germany | AS1400 | |
Maxwell RSC 48 Instrument | Promega, Walldorf, Germany | AS8500 | |
Microcentrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
NanoDrop 2000c Spectrometer | ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany | ND-2000C | |
Optical caps | Agilent, Waldbronn, Germany | 401425 | |
Optical tube strips | Agilent, Waldbronn, Germany | 401428 | |
Pipettors and pipette tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Prism 6 for statistics, version 6.01 | GraphPad Inc., San Diego, California | ||
Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany | Q33216 | |
TapeStation 4200 | Agilent, Waldbronn, Germany | ||
Tecan Infinite M200 Pro | Tecan, Männedorf, Swizerland | IN-MNANO |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon