Estrazione ottimizzata di DNA di alta qualità da lesioni aterosclerotiche umane fissate in formalina e incluse in paraffina

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'estrazione semi-automatica del DNA da lesioni incluse in paraffina fissate in formalina delle arterie carotidi umane. La lisi tissutale viene eseguita senza xilene tossico, seguita da un protocollo automatizzato di estrazione del DNA, che include una seconda fase di lisi, il legame del DNA alle particelle paramagnetiche per il legame a base di cellulosa, le fasi di lavaggio e l'eluizione del DNA.

Abstract

I tessuti FFPE (FFPE) fissati in formalina rappresentano una fonte preziosa per le analisi molecolari e gli studi di genomica clinica. Questi tessuti sono spesso poveri di cellule o difficili da elaborare. Pertanto, gli acidi nucleici devono essere accuratamente isolati. Negli ultimi anni, sono stati messi a punto vari metodi per l'isolamento del DNA per i tessuti di molte malattie, soprattutto tumori. Sfortunatamente, il DNA genomico estratto dai tessuti FFPE è altamente degradato a causa della reticolazione tra filamenti di acido nucleico e proteine, nonché di rotture casuali nella sequenza. Pertanto, la qualità del DNA di questi campioni è notevolmente ridotta, il che lo rende una sfida per ulteriori analisi molecolari a valle. Altri problemi con i tessuti difficili sono, ad esempio, la mancanza di cellule nelle lesioni aterosclerotiche umane calcificate e nel tessuto adiposo, piccole biopsie cutanee e di conseguenza la bassa disponibilità degli acidi nucleici desiderati come avviene anche nei tessuti vecchi o fissi.

Nei nostri laboratori, abbiamo messo a punto un metodo per l'estrazione del DNA da lesioni aterosclerotiche fissate in formalina, utilizzando un sistema di isolamento semiautomatico. Abbiamo confrontato questo metodo con altri protocolli di estrazione disponibili in commercio e ci siamo concentrati su ulteriori analisi a valle. La purezza e la concentrazione del DNA sono state misurate mediante spettrometria e fluorometria. Sono stati valutati il grado di frammentazione e la qualità complessiva.

La massima quantità e qualità del DNA è stata ottenuta con il protocollo del DNA del sangue modificato per il sistema di estrazione automatizzato, invece del protocollo FFPE commerciale. Con questo protocollo graduale, le rese di DNA dai campioni FFPE erano in media quattro volte superiori e un minor numero di campioni non ha superato il processo di estrazione, il che è fondamentale quando si tratta di biopsie di piccoli vasi. Le dimensioni dell'amplicone da 200 a 800 bp potrebbero essere rilevate mediante PCR. Questo studio dimostra che, sebbene il DNA ottenuto dal nostro tessuto FFPE sia altamente frammentato, può ancora essere utilizzato per l'amplificazione e il sequenziamento di prodotti più corti. In conclusione, nelle nostre mani, la tecnologia automatizzata sembra essere il miglior sistema per l'estrazione del DNA, in particolare per piccoli campioni di tessuto FFPE.

Introduzione

La fissazione della formalina seguita dall'inclusione di paraffina (FFPE) è una procedura standard per la conservazione a lungo termine di campioni patologici nel biobanking¹. Questi campioni forniscono una fonte preziosa per gli studi istologici e le analisi molecolari, in particolare per gli studi genetici². Ulteriori vantaggi dei fazzoletti FFPE sono una migliore conservazione a lungo termine, costi inferiori e condizioni di conservazione più facili. La nostra intenzione è quella di fornire un protocollo affidabile e facile da usare per l'isolamento riproducibile degli acidi nucleici da piccole quantità di sezioni FFPE, poiché l'estrazione del DNA di alta qualità è il primo passo cruciale in un'ampia gamma di tecniche molecolari e i tessuti FFPE sono la fonte di campioni più disponibile.

I nuovi approcci scientifici, come il sequenziamento di nuova generazione (NGS) e gli approcci di ricerca "omici", richiedono un'elevata qualità degli acidi nucleici ^3,4,5. L'estrazione del DNA da campioni di tessuto FFPE rimane un'impresa impegnativa. Il DNA dei campioni FFPE può variare notevolmente in qualità e quantità a seconda dell'età e delle condizioni di fissazione. La formalina, il composto più frequentemente usato, porta alla reticolazione DNA-proteina ^6,7,8 e provoca una rottura casuale non specifica nella sequenza nucleotidica⁹. Ciò può avere un impatto significativo sulle analisi genomiche a valle, poiché la reticolazione può disabilitare l'amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR) ^6,10. A causa dei contaminanti durante il processo di fissazione, la purezza del DNA isolato dai campioni FFPE è spesso limitata. Negli ultimi anni, sono stati messi a punto vari metodi per l'isolamento del DNA, per lo più da campioni di tessuto tumorale 2,11,12,13.

In generale, i protocolli per l'estrazione di acidi nucleici dal tessuto FFPE possono essere differenziati in tre gruppi principali. Il primo gruppo di metodi, il più comunemente usato, comprende i sistemi di colonne a base di silice disponibili in commercio¹⁴. Il secondo gruppo coinvolge metodi manuali di estrazione in fase organica con fenolo e cloroformio, descritti per la prima volta da Joseph Sambrook e David W. Russell¹⁵. Come terzo gruppo, negli ultimi anni sono stati istituiti sistemi automatizzati come i sistemi di manipolazione dei liquidi e i sistemi basati su particelle paramagnetiche¹⁶. Ciascuno dei tre sistemi citati presenta diversi vantaggi e svantaggi come sostanze chimiche pericolose (ad esempio, xilene, fenolo, cloroformio), costi elevati¹⁷, manodopera¹⁸ e consumo di tempo¹⁹. In particolare, per i campioni di tessuto difficili e per le analisi ad alto rendimento, la standardizzazione, la riproducibilità, il consumo di tempo, la manodopera e i costi relativamente bassi sono le caratteristiche più rilevanti per trovare un metodo adatto per l'isolamento degli acidi nucleici²⁰. È noto che i metodi di estrazione automatizzati mostrano risultati più riproducibili e sono più sensibili per le piccole biopsie. Inoltre, è necessaria una minore quantità di tessuto o sangue e si riduce il rischio di intasamento del sistema a causa di elevate quantità di paraffina. Sebbene le macchine per l'estrazione automatizzata degli acidi nucleici e i kit necessari siano più costosi rispetto ai metodi manuali, sono comunque convincenti grazie ai processi di estrazione meno problematici. La ricerca bibliografica fornisce molte pubblicazioni che illustrano un confronto diretto tra metodi di estrazione manuale, su colonna e automatizzata di DNA e RNA da diversi tessuti e organismi, come piante, animali e esseri umani, nonché cellule in coltura 20,21,22. Ci sono anche prove presenti in letteratura che dimostrano che il DNA e l'RNA isolati da tessuti congelati a scatto di 10 anni possono essere utilizzati per analisi a valle come PCR, PCR quantitativa, NGS, analisi di metilazione e clonazione 9,23,24,25,26.

Il problema principale, ad esempio, dell'invecchiamento del tessuto vascolare umano, così come delle biopsie tissutali di piccole dimensioni, in particolare per quanto riguarda i campioni di FFPE, è la mancanza di cellule nelle lesioni aterosclerotiche altamente calcificate, che di conseguenza porta a basse concentrazioni di acidi nucleici¹. Sebbene siano già stati stabiliti diversi metodi per l'estrazione del DNA dal tessuto FFPE e siano ampiamente utilizzati, i metodi di preparazione manuale dei campioni richiedono un lungo tempo di utilizzo²⁷ e reagenti tossici come lo xilene o il fenolo sono necessari per la deparaffinazione². Come descritto, il processo di deparaffinazione è una fase cruciale che richiede molto tempo (ad esempio, circa 30 minuti) che influisce notevolmente sulla qualità e sulla quantità del DNA estratto (ad esempio, effetti tossici sul DNA, come la frammentazione e la degradazione della soluzione di deparaffinazione e le alte temperature)²⁸. I nuovi protocolli di estrazione del DNA sviluppati di recente si concentrano sull'utilizzo di altre soluzioni di deparaffinazione non tossiche, strategie di riparazione e tecnologie automatizzate per le microsfere. In particolare, è stato dimostrato che i metodi automatizzati e semi-automatizzati hanno successo nell'estrazione del DNA con un recupero efficiente, assenza di contaminazione incrociata e prestazioni facili²⁹. Abbiamo stabilito un protocollo che supera queste limitazioni. Di conseguenza, la nostra tecnica consente una riduzione dei tempi di lavorazione e di intervento manuale ai più alti standard quantitativi e qualitativi.

Soprattutto per le analisi riproducibili ad alto rendimento come la genotipizzazione, gli studi epigenomici e il sequenziamento dell'RNA, la gestione dei campioni FFPE con i sistemi di purificazione basati su colonna è spesso difficile e richiede molto tempo (ad esempio, lunghe fasi di deparaffinazione, intasamento della colonna e lunghi tempi di utilizzo). L'intasamento delle membrane di silice a causa dell'elevata quantità di paraffina è il problema principale. Altre circostanze che possono peggiorare l'isolamento di acidi nucleici di alta qualità sono piccole quantità di tessuto come micro-biopsie della pelle, piccoli tessuti di topo, tessuti molto grassi o calcificati come placche, tessuto ossificato e campioni invecchiati. Soprattutto nella diagnosi e nella medicina legale, negli ultimi anni i sistemi automatizzati e semi-automatizzati come la manipolazione dei liquidi o i metodi di estrazione basati su particelle paramagnetiche^sono diventati sempre più ^{essenziali, principalmente} a causa dei tempi di intervento relativamente bassi e della possibilità di standardizzazione. La maggior parte dei protocolli già pubblicati funziona perfettamente per i tessuti lisci con quantità elevate o medie di cellule, come le biopsie tumorali o i tessuti vegetali 13,22,32. La letteratura sui metodi semi-automatizzati basati su particelle utilizzate per isolare il DNA da tessuti relativamente difficili da maneggiare come singole cellule fisse, vasi calcificati, tessuti ricchi di collagene e tessuto adiposo con un basso numero di cellule è scarsamente descritta³³.

In questo studio, viene descritto un metodo semi-automatico ottimizzato per l'isolamento del DNA da sezioni incluse in paraffina vascolare, confrontandolo con due protocolli manuali basati su colonne. Per la convalida sono state utilizzate la quantità, la purezza e l'entità della frammentazione del DNA. Il protocollo del DNA del sangue, disponibile in commercio, è stato utilizzato come punto di partenza e le fasi manuali del sistema semi-automatico sono state successivamente ottimizzate per l'uso di FFPE e campioni di tessuto fresco congelato da tessuti umani e animali, combinando le fasi del FFPE e del protocollo tissutale. La fase automatizzata di questo protocollo è preinstallata sullo strumento e dipende dal kit utilizzato (qui, il kit del DNA del sangue). Con il sistema semi-automatizzato basato su cartuccia descritto è possibile isolare il DNA dal sangue, dal tessuto fresco congelato, dal tessuto fissato in formalina e persino da singole cellule con lo stesso protocollo, la stessa macchina, lo stesso kit e gli stessi materiali di consumo, invece di utilizzare protocolli e kit diversi per lo strumento, come raccomandato dall'azienda. Ci sono solo piccole differenze nei protocolli, come un tampone e alcuni tempi di incubazione per le diverse applicazioni, il che rende questo protocollo molto utile per estrarre il DNA da tutti i tipi di tessuti. Il nostro protocollo è ottimizzato principalmente per il tessuto vascolare umano calcificato, povero di cellule e fibroso, ma può ovviamente essere utilizzato e ulteriormente ottimizzato per tutti i tipi di tessuti difficili sopra menzionati.

Riassumendo, per i ricercatori nel campo cardiovascolare che lavorano sull'aterosclerosi (ad esempio, aorta, arterie carotidi, arterie coronarie) forniamo un protocollo punto per punto facile da usare per l'estrazione semi-automatizzata del DNA da campioni di FFPE vascolare.

Protocollo

L'autorizzazione a raccogliere campioni aterosclerotici carotidei umani nella nostra biobanca è stata approvata dal Comitato Etico Ospedaliero locale (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Monaco di Baviera, Germania). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti. Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki.

1. Preparazione dei tessuti

1. Preparare 5-8 sezioni di tessuto da 10 μm dal campione FFPE con il microtomo e trasferirle in una provetta da 1,5 mL. Non è necessario ridurre l'eccesso di paraffina dal blocco.
   NOTA: Le sezioni singole più sottili invece di una sezione grande accelerano la reazione tampone. Scartare le prime sezioni a causa dell'esposizione a O₂ . Per campioni più grandi, è anche possibile utilizzare un minor numero di sezioni.
2. Centrifugare queste provette in una centrifuga da banco, impostata su 5.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente per raccogliere ogni campione sul fondo della provetta.
   ATTENZIONE: Una centrifugazione troppo lunga porta alla coagulazione del campione e complica la lisi.

2. Dissoluzione e deparaffinazione dei lipidi

NOTA: Questo passaggio è necessario per la deparaffinazione e la digestione dei lipidi. Il tampone utilizzato è meno tossico delle soluzioni di deparaffinazione commerciali.

1. Aggiungere 300 μl di tampone di incubazione disponibile in commercio e 6 μl di 1-tioglicerolo a ciascuna provetta.
   NOTA: Non utilizzare più di 300 μl in quanto questo è il volume massimo della cartuccia del sistema di automazione.
2. Agitare per 10 s e incubare il campione per 10 minuti a 80 °C e 500 giri/min in un blocco riscaldante per solubilizzare la paraffina.
   ATTENZIONE: Il tessuto deve essere completamente sciolto alla fine. Se necessario, agitare più volte durante l'incubazione.

3. Digestione del campione e delle proteine

NOTA: La digestione nativa con proteasi K è fondamentale per avere estratti di DNA puliti senza proteine. Riduce inoltre le proteine contaminanti presenti. Inoltre, anche le nucleasi vengono distrutte per salvare il DNA³⁴. Questa fase notturna è necessaria anche per la digestione completa del campione.

1. Lasciare raffreddare il campione a 60 °C e quindi aggiungere 30 μl della soluzione di proteinasi K fornita.
2. Agitare nuovamente e incubare la miscela a 65 °C e 500 giri/min per una notte (4-20 ore) in un blocco riscaldante. Agitare di tanto in tanto i campioni durante l'incubazione per una completa digestione del campione.
   NOTA: L'incubazione notturna porta a risultati migliori. Si consiglia di mescolare ogni 30-60 minuti. Alla fine, non dovrebbe esserci alcun pezzo di tessuto visivo all'interno del tubo.

4. Lisi cellulare

1. Aggiungere 400 μl del tampone di lisi, fornito nel kit di sangue, e vorticare a breve.
2. Incubare nuovamente il campione a 65 °C per 30 minuti a 500 giri/min.
3. Lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente. La paraffina si indurirà in cima.
   ATTENZIONE: Non agitare di nuovo, per mantenere la paraffina separata dal campione. In caso contrario, la paraffina viene mescolata con il tessuto, distruggendo il campione. Il campione verrà raccolto nel passaggio 6.1.

5. Preparazione delle cartucce pre-dosate

1. Accendere la macchina e il tablet associato.
2. Avvia l'app software e fai clic sul pulsante Porta per aprire lo strumento.
3. Rimuovere il rack dallo strumento e inserire la cartuccia preriempita nel rack della sonda. Assicurarsi che la cartuccia scatti due volte quando è in posizione e rimuovere la pellicola sigillante.
4. Aggiungere lo stantuffo nell'ultimo (8) pozzetto della cartuccia. Funge da punta della pipetta nello strumento.
5. Riempire le provette di eluizione da 0,5 mL fornite con 65 μL di tampone di eluizione, fornite con il kit. Lasciare le provette aperte e inserirle nell'apposita posizione nella parte anteriore del rack, dopo la cartuccia.
   NOTA: Il volume minimo per l'eluizione è di 60 μl. Il sistema perderà 5-10 μl del volume di eluizione aggiunto.

6. Estrazione automatizzata del DNA

1. Forare con cautela la paraffina sulla parte superiore della provetta da 1,5 mL dal passaggio 4.3 per raggiungere il campione pulito sul fondo della provetta senza mescolarlo nuovamente con la paraffina.
2. Trasferire l'intera miscela (730 μL) del campione preparato nel primo pozzetto della cartuccia.
3. Inserire il rack nella macchina automatizzata per l'estrazione del DNA. Assicurarsi che la cremagliera si blocchi prima nella parte posteriore della macchina e poi nella parte anteriore.
4. Avvia la corsa facendo clic sul pulsante di avvio arancione in alto a sinistra nel software. Si aprirà una finestra con diversi protocolli preinstallati. Selezionare Protocollo DNA sangue sullo strumento. Verificare che lo stantuffo, il tubo di eluizione e il campione siano stati aggiunti facendo clic su Sì nel software. Lo sportello dello strumento si chiuderà automaticamente e la corsa inizierà (la luce diventerà verde). La corsa durerà circa 38 minuti. Non sono necessarie ulteriori calibrazioni.
   NOTA: Osservare fino a quando il sistema non ha rilevato gli stantuffi per tutti i campioni nel rack. In caso contrario, il sistema si arresta automaticamente e il protocollo della macchina deve essere riavviato.
5. Assicurarsi che il sistema esegua la fase di lisi automatizzata nel primo pozzetto della cartuccia, seguita dalle fasi di lavaggio nei pozzetti da 3 a 7. Non sono necessari ulteriori passaggi di programmazione. Il programma completo è preinstallato dall'azienda.
6. Una volta terminato, assicurarsi che il sistema eluisca il DNA nelle provette di eluizione preparate tramite lo stantuffo aggiunto. Le particelle magnetiche rimangono nello stantuffo. Lo stantuffo alla fine torna all'ultimo pozzetto della cartuccia.

7. Termina la corsa

1. Al termine della corsa (la macchina mostra una luce verde lampeggiante), aprire lo strumento facendo clic sul pulsante per l'apertura (cartello della porta) e rimuovere la cremagliera dal sistema.
2. Gettare le cartucce.
3. Reinserire il rack vuoto nello strumento e chiudere lo sportello tramite il pulsante dello sportello nell'angolo in alto a destra. Chiudi l'app software e spegni la macchina, così come il tablet.
4. Conservare gli eluati a -20 °C per la conservazione a lungo termine o a 4 °C per la conservazione a breve termine o utilizzarli direttamente per analisi a valle o misure di concentrazione.

Risultati

Per la definizione del protocollo, sono stati utilizzati 5 blocchi di tessuto FFPE da pazienti con aterosclerosi dell'arteria carotide. Il DNA è stato isolato con un protocollo semi-automatico ottimizzato (kit C) e con due protocolli manuali basati su colonne disponibili in commercio (kit A e kit B, vedi Tabella dei materiali). L'estrazione del DNA con i kit A e B è stata eseguita secondo il protocollo del produttore. L'unica modifica che è stata apportata al protocol...

Discussione

I metodi di estrazione del DNA per il tessuto FFPE variano in qualità e quantità di DNA isolato, il che influisce inevitabilmente sulle prestazioni di ulteriori analisi a valle. Pertanto, l'automazione sta diventando imperativa per migliorare il flusso di lavoro e la standardizzazione, nonché la gestione della qualità. Pertanto, nel presente studio, è stato valutato un metodo semi-automatizzato per l'estrazione del DNA da campioni FFPE che ha dimostrato risultati migliori rispetto a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes for sample incubation	Eppendorf, Hamburg, Germany	30120086
1-Thioglycerol	Promega, Walldorf, Germany	A208
Agilent tape station software 3.2	Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS Kit	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q32851
FFPE DNA Purification Kits (Kit A)	Norgene Biotek, Heidelberg, Germany	47400
FFPE tissue samples n=5	Munich Vascular Biobank,Munich, Germany
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)	Qiagen, Hilden, Germany	180134
Heating blocks, set to 80°C and 65°C	VWR,Darmstadt,Germany	460-0250
High Sensitivity D5000 reagents	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5593
High Sensitivity D5000 ScreenTape	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5592
Incubation Buffer	Promega, Walldorf, Germany	D920
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase K	Promega, Walldorf, Germany	AS1400
Maxwell RSC 48 Instrument	Promega, Walldorf, Germany	AS8500
Microcentrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c Spectrometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	ND-2000C
Optical caps	Agilent, Waldbronn, Germany	401425
Optical tube strips	Agilent, Waldbronn, Germany	401428
Pipettors and pipette tips	Eppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 for statistics, version 6.01	GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q33216
TapeStation 4200	Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan, Männedorf, Swizerland	IN-MNANO