Extraction optimisée d’ADN de haute qualité à partir de lésions athéroscléreuses humaines fixées au formol et incluses dans de la paraffine

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d’extraction semi-automatisée de l’ADN à partir de lésions fixées au formol et incluses dans la paraffine des artères carotides humaines. La lyse tissulaire est effectuée sans xylène toxique, qui est suivie d’un protocole d’extraction automatisé de l’ADN, comprenant une deuxième étape de lyse, la liaison de l’ADN à des particules paramagnétiques pour la liaison à base de cellulose, des étapes de lavage et l’élution de l’ADN.

Résumé

Les tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE) représentent une source précieuse pour les analyses moléculaires et les études génomiques cliniques. Ces tissus sont souvent pauvres en cellules ou difficiles à traiter. Par conséquent, les acides nucléiques doivent être soigneusement isolés. Ces dernières années, diverses méthodes d’isolement de l’ADN ont été mises au point pour les tissus de nombreuses maladies, principalement le cancer. Malheureusement, l’ADN génomique extrait des tissus FFPE est fortement dégradé en raison de la réticulation entre les brins d’acide nucléique et les protéines, ainsi que des ruptures aléatoires en séquence. Par conséquent, la qualité de l’ADN de ces échantillons est nettement réduite, ce qui rend difficile la réalisation d’analyses moléculaires ultérieures. D’autres problèmes avec les tissus difficiles sont, par exemple, le manque de cellules dans les lésions athéroscléreuses humaines calcifiées et les tissus adipeux, les petites biopsies cutanées et, par conséquent, la faible disponibilité des acides nucléiques souhaités, comme c’est également le cas dans les tissus anciens ou fixés.

Dans nos laboratoires, nous avons mis au point une méthode d’extraction de l’ADN à partir de lésions athéroscléreuses fixées au formol, à l’aide d’un système d’isolement semi-automatisé. Nous avons comparé cette méthode à d’autres protocoles d’extraction disponibles dans le commerce et nous nous sommes concentrés sur d’autres analyses en aval. La pureté et la concentration de l’ADN ont été mesurées par spectrométrie et fluorométrie. Le degré de fragmentation et la qualité globale ont été évalués.

La quantité et la qualité d’ADN les plus élevées ont été obtenues avec le protocole d’ADN sanguin modifié pour le système d’extraction automatisé, au lieu du protocole commercial FFPE. Grâce à ce protocole étape par étape, les rendements en ADN des échantillons FFPE étaient en moyenne quatre fois plus élevés et moins d’échantillons ont échoué au processus d’extraction, ce qui est essentiel lorsqu’il s’agit de biopsies de petits vaisseaux. Des tailles d’amplicon de 200 à 800 pb ont pu être détectées par PCR. Cette étude montre que bien que l’ADN obtenu à partir de notre tissu FFPE soit très fragmenté, il peut toujours être utilisé pour une amplification et un séquençage réussis de produits plus courts. En conclusion, entre nos mains, la technologie automatisée semble être le meilleur système pour l’extraction d’ADN, en particulier pour les petits échantillons de tissus FFPE.

Introduction

La fixation au formol suivie d’un enrobage de paraffine (FFPE) est une procédure standard pour la conservation à long terme d’échantillons pathologiques dans les biobanques¹. Ces échantillons constituent une source précieuse pour les études histologiques ainsi que pour les analyses moléculaires, en particulier les études génétiques². D’autres avantages des mouchoirs FFPE sont un meilleur stockage à long terme, des coûts réduits et des conditions de stockage plus faciles. Notre intention ici est de fournir un protocole fiable et facile à utiliser pour l’isolement reproductible des acides nucléiques à partir de petites quantités de coupes FFPE, car l’extraction d’ADN de haute qualité est la première étape cruciale d’un large éventail de techniques moléculaires et les tissus FFPE sont la source d’échantillons la plus disponible.

Les nouvelles approches scientifiques, telles que le séquençage de nouvelle génération (NGS) et les approches de recherche « omiques », nécessitent une haute qualité d’acides nucléiques ^3,4,5. L’extraction d’ADN à partir d’échantillons de tissus FFPE reste une entreprise difficile. La qualité et la quantité de l’ADN provenant d’échantillons FFPE peuvent varier considérablement en fonction de son âge et de ses conditions de fixation. Le formol, le composé le plus fréquemment utilisé, conduit à la réticulation ADN-protéine ^6,7,8 et provoque une rupture aléatoire non spécifique dans la séquence nucléotidique⁹. Cela peut avoir un impact significatif sur les analyses génomiques en aval, car la réticulation peut désactiver l’amplification de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ^6,10. En raison des contaminants pendant le processus de fixation, la pureté de l’ADN isolé à partir d’échantillons FFPE est souvent limitée. Au cours des dernières années, diverses méthodes d’isolement de l’ADN ont été mises en place, principalement à partir d’échantillons de tissus cancéreux 2,11,12,13.

En général, les protocoles d’extraction des acides nucléiques à partir de tissus FFPE peuvent être différenciés en trois groupes principaux. Le premier groupe de méthodes, le plus couramment utilisé, comprend les systèmes de colonnes à base de silice disponibles dans le commerce¹⁴. Le deuxième groupe implique des méthodes d’extraction manuelles en phase organique avec du phénol et du chloroforme, décrites pour la première fois par Joseph Sambrook et David W. Russell¹⁵. En tant que troisième groupe, des systèmes automatisés ont été mis en place au cours des dernières années, tels que les systèmes de manipulation de liquides ainsi que les systèmes paramagnétiques à base de particules¹⁶. Chacun des trois systèmes nommés présente des avantages et des inconvénients différents, tels que des produits chimiques dangereux (c’est-à-dire le xylène, le phénol, le chloroforme), des coûts élevés¹⁷, de la main-d’œuvre¹⁸ et la consommation de temps¹⁹. En particulier, pour les échantillons de tissus difficiles ainsi que pour les analyses à haut débit, la normalisation, la reproductibilité, la consommation de temps, la main-d’œuvre et les coûts relativement faibles sont les caractéristiques les plus pertinentes pour trouver une méthode appropriée pour l’isolement des acides nucléiques²⁰. Les méthodes d’extraction automatisées sont connues pour donner des résultats plus reproductibles et sont plus sensibles pour les petites biopsies. De plus, moins de tissu ou de sang est nécessaire et le risque d’obstruction du système dû à des quantités élevées de paraffine est réduit. Bien que les machines pour l’extraction automatisée des acides nucléiques et les kits nécessaires soient plus chères que les méthodes manuelles, elles convainquent toujours en raison des processus d’extraction moins problématiques. La recherche documentaire fournit de nombreuses publications qui illustrent une comparaison directe entre les méthodes manuelles, basées sur des colonnes et automatisées d’extraction d’ADN et d’ARN à partir de différents tissus et organismes, tels que les plantes, les animaux et les humains, ainsi que des cellules en culture 20,21,22. Il existe également des preuves présentes dans la littérature montrant que l’ADN et l’ARN isolés de tissus congelés de 10 ans peuvent être utilisés pour des analyses en aval telles que la PCR, la PCR quantitative, le NGS, les analyses de méthylation et le clonage 9,23,24,25,26.

Le problème majeur, par exemple, des tissus vasculaires humains âgés, ainsi que des biopsies de petits tissus, en particulier des échantillons FFPE, est le manque de cellules dans les lésions athéroscléreuses hautement calcifiées, ce qui conduit par conséquent à de faibles concentrations d’acides nucléiques¹. Bien que plusieurs méthodes d’extraction d’ADN à partir de tissus FFPE aient déjà été établies et soient largement utilisées, les méthodes manuelles de préparation des échantillons nécessitent un long temps de manipulation²⁷ et des réactifs toxiques tels que le xylène ou le phénol sont nécessaires pour la déparaffinisation². Comme nous l’avons décrit, le processus de déparaffinisation est une étape cruciale qui prend du temps (p. ex., environ 30 min) et qui affecte considérablement la qualité et la quantité de l’ADN extrait (p. ex., effets toxiques sur l’ADN, tels que la fragmentation et la dégradation de la solution de déparaffinisation et les températures élevées)²⁸. De nouveaux protocoles d’extraction d’ADN récemment développés se concentrent sur l’utilisation d’autres solutions de déparaffinisation non toxiques, de stratégies de réparation et de technologies de billes automatisées. En particulier, les méthodes automatisées et semi-automatisées se sont avérées efficaces dans l’extraction de l’ADN avec une récupération efficace, l’absence de contamination croisée et des performances faciles²⁹. Nous avons établi un protocole qui surmonte ces limitations. Par conséquent, notre technique permet une réduction du temps de traitement et de manipulation selon les normes quantitatives et qualitatives les plus élevées.

En particulier pour les analyses reproductibles à haut débit telles que le génotypage, les études épigénomiques et le séquençage de l’ARN, la manipulation d’échantillons FFPE avec des systèmes de purification sur colonne est souvent difficile et chronophage (par exemple, de longues étapes de déparaffinisation, le colmatage de la colonne et de longs temps de manipulation). Le colmatage des membranes de silice en raison d’une grande quantité de paraffine est le principal problème. D’autres circonstances peuvent aggraver l’isolement des acides nucléiques de haute qualité : de petites quantités de tissus, telles que des micro-biopsies de la peau, de petits tissus de souris, des tissus très gras ou calcifiés sous forme de plaques, des tissus ossifiés et des échantillons âgés. En particulier dans le domaine du diagnostic et de la médecine légale, les systèmes automatisés et semi-automatisés tels que la manipulation de liquides ou les méthodes d’extraction paramagnétiques basées sur les particules sont devenus de plus en plus essentiels au cours des dernières années^30,31, principalement en raison des temps de manipulation relativement courts et de la possibilité de normalisation. La plupart des protocoles déjà publiés fonctionnent parfaitement pour les tissus lisses avec des quantités élevées ou moyennes de cellules, tels que les biopsies tumorales ou les tissus végétaux 13,22,32. La littérature sur les méthodes semi-automatisées à base de particules utilisées pour isoler l’ADN de tissus relativement difficiles à manipuler tels que les cellules uniques fixes, les vaisseaux calcifiés, les tissus riches en collagène et les tissus adipeux à faible nombre de cellules n’est que mal décrite³³.

Dans cette étude, une méthode semi-automatisée optimisée pour l’isolement de l’ADN à partir de coupes intégrées à la paraffine vasculaire est décrite, en la comparant à deux protocoles manuels basés sur des colonnes. La quantité, la pureté et l’étendue de la fragmentation de l’ADN ont été utilisées pour la validation. Le protocole d’ADN sanguin disponible dans le commerce a été utilisé comme point de départ et les étapes manuelles du système semi-automatisé ont ensuite été optimisées pour l’utilisation du FFPE ainsi que des échantillons de tissus frais congelés provenant de tissus humains et animaux, en combinant les étapes du FFPE et du protocole tissulaire. L’étape automatisée de ce protocole est préinstallée sur l’instrument et dépend du kit utilisé (ici, le kit ADN sanguin). Avec le système semi-automatisé à cartouche décrit, il est possible d’isoler l’ADN du sang, des tissus fraîchement congelés, des tissus fixés au formol et même des cellules uniques avec le même protocole, la même machine, le même kit et les mêmes consommables, au lieu d’utiliser des protocoles et des kits différents pour l’instrument, comme cela est recommandé par l’entreprise. Il n’y a que des différences mineures dans les protocoles, comme un tampon et des temps d’incubation pour les différentes applications, ce qui rend ce protocole très utile pour extraire l’ADN de toutes sortes de tissus. Notre protocole est principalement optimisé pour les tissus vasculaires humains calcifiés, pauvres en cellules et fibreux, mais peut bien sûr être utilisé et optimisé pour toutes sortes de tissus difficiles mentionnés ci-dessus.

En résumé, pour les chercheurs dans le domaine cardiovasculaire travaillant sur l’athérosclérose (par exemple, l’aorte, les artères carotides, les artères coronaires), nous fournissons un protocole point par point facile à utiliser pour l’extraction semi-automatisée d’ADN à partir d’échantillons vasculaires FFPE.

Protocole

L’autorisation de collecter des échantillons d’athérosclérose carotidienne humaine dans notre biobanque a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital local (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Munich, Allemagne). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients. Les expériences ont été réalisées conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki.

1. Préparation des tissus

1. Préparez 5 à 8 coupes de tissu de 10 μm à partir de l’échantillon FFPE avec le microtome et transférez-le dans un tube de 1,5 mL. Il n’est pas nécessaire de réduire l’excès de paraffine du bloc.
   REMARQUE : Des sections simples plus fines au lieu d’une grande section accélèrent la réaction du tampon. Jetez les premières sections en raison de l’exposition à O₂ . Pour des échantillons plus grands, il est également possible d’utiliser moins de sections.
2. Centrifugez ces tubes dans une centrifugeuse de paillasse, réglée à 5 000 x g pendant 1 minute à température ambiante pour prélever chaque échantillon au fond du tube.
   ATTENTION : Une centrifugation trop longue entraîne une coagulation de l’échantillon et complique la lyse.

2. Dissolution et déparaffinisation des lipides

REMARQUE :Cette étape est nécessaire pour la déparaffinisation et la digestion des lipides. Le tampon utilisé est moins toxique que les solutions de déparaffinisation commerciales.

1. Ajouter 300 μL du tampon d’incubation disponible dans le commerce et 6 μL de 1-thioglycérol dans chaque tube.
   REMARQUE : N’utilisez pas plus de 300 μL car il s’agit du volume maximum de la cartouche du système d’automatisation.
2. Vortex pendant 10 s et incuber l’échantillon pendant 10 min à 80 °C et 500 tr/min dans un bloc chauffant pour solubiliser la paraffine.
   ATTENTION : Le tissu doit être complètement dissous à la fin. Si nécessaire, faites plusieurs fois tourbillonner pendant l’incubation.

3. Digestion des échantillons et des protéines

REMARQUE : La digestion native avec la protéase K est cruciale pour avoir des extraits d’ADN propres sans protéines. Il réduit également les protéines contaminantes présentes. De plus, les nucléases sont également détruites pour sauver l’ADN³⁴. Cette étape de nuit est également nécessaire pour une digestion complète de l’échantillon.

1. Laissez refroidir l’échantillon à 60 °C, puis ajoutez 30 μL de la solution de protéinase K fournie.
2. Agitez à nouveau et incubez le mélange à 65 °C et 500 tr/min pendant la nuit (4 à 20 h) dans un bloc chauffant. Vortex les échantillons pendant l’incubation de temps en temps pour une digestion complète des échantillons.
   REMARQUE : L’incubation d’une nuit donne de meilleurs résultats. Il est recommandé d’effectuer des étapes de mélange toutes les 30 à 60 minutes. En fin de compte, il ne devrait pas y avoir de morceau de tissu visuel à l’intérieur du tube.

4. Lyse cellulaire

1. Ajouter 400 μL du tampon de lyse, fourni dans la trousse de sang et vortex sous peu.
2. Incuber à nouveau l’échantillon à 65 °C pendant 30 min à 500 tr/min.
3. Laissez l’échantillon refroidir à température ambiante. La paraffine durcira sur le dessus.
   ATTENTION : Ne vortex pas à nouveau, pour garder la paraffine séparée de l’échantillon. Sinon, la paraffine est mélangée au tissu, ce qui détruit l’échantillon. L’échantillon sera prélevé à l’étape 6.1.

5. Préparation des cartouches pré-distribuées

1. Mettez l’appareil sous tension, ainsi que la tablette associée.
2. Démarrez l’application logicielle et cliquez sur le bouton Porte pour ouvrir l’instrument.
3. Retirez le rack de l’instrument et insérez la cartouche préremplie dans le rack de la sonde. Assurez-vous que la cartouche s’enclenche deux fois lorsqu’elle est en place et retirez la feuille d’étanchéité.
4. Ajoutez le piston dans le dernier (8) puits de la cartouche. Il sert de pointe de pipette dans l’instrument.
5. Remplissez les tubes d’élution de 0,5 ml fournis avec 65 μL de tampon d’élution fourni avec le kit. Laissez les tubes ouverts et insérez-les dans la position dédiée dans la partie avant du rack, après la cartouche.
   REMARQUE : Le volume minimum pour l’élution est de 60 μL. Le système perdra 5 à 10 μL du volume d’élution ajouté.

6. Extraction automatisée de l’ADN

1. Percez soigneusement la paraffine sur le dessus du tube de 1,5 mL à partir de l’étape 4.3 pour atteindre l’échantillon propre au fond du tube sans le mélanger à nouveau avec de la paraffine.
2. Transvasez l’ensemble du mélange (730 μL) de l’échantillon préparé dans le premier puits de la cartouche.
3. Insérez le rack dans la machine d’extraction d’ADN automatisée. Assurez-vous que le rack se verrouille d’abord à l’arrière de la machine, puis à l’avant.
4. Démarrez la course en cliquant sur le bouton orange Démarrer en haut à gauche dans le logiciel. Une fenêtre avec différents protocoles préinstallés s’ouvrira. Sélectionnez Protocole d’ADN sanguin sur l’instrument. Vérifiez que le piston, le tube d’élution et l’échantillon ont été ajoutés en cliquant sur oui dans le logiciel. La porte de l’instrument se fermera automatiquement et le cycle commencera (le voyant deviendra vert). La course durera environ 38 min. Aucun étalonnage supplémentaire n’est nécessaire.
   REMARQUE : Surveillez jusqu’à ce que le système ait ramassé les pistons pour tous les échantillons dans le rack. Si ce n’est pas le cas, le système s’arrête automatiquement et le protocole de la machine doit être redémarré.
5. Assurez-vous que le système effectue l’étape de lyse automatisée dans le premier puits de la cartouche, suivie des étapes de lavage dans les puits 3 à 7. Il n’y a pas d’autre étape de programmation nécessaire. Le programme complet est préinstallé par l’entreprise.
6. Une fois cela fait, assurez-vous que le système élue l’ADN dans les tubes d’élution préparés via le piston ajouté. Les particules magnétiques restent dans le piston. Le piston à la fin retourne au dernier puits de la cartouche.

7. Terminez la course

1. Une fois le fonctionnement terminé (la machine affiche un voyant vert clignotant), ouvrez l’instrument en cliquant sur le bouton d’ouverture (panneau de porte) et retirez le rack du système.
2. Jetez les cartouches.
3. Réinsérez le rack vide dans l’instrument et fermez la porte à l’aide du bouton de porte dans le coin supérieur droit. Fermez l’application logicielle et éteignez la machine, ainsi que la tablette.
4. Stockez les éluats à -20 °C pour un stockage à long terme ou à 4 °C pour un stockage à court terme, ou utilisez-les directement pour l’analyse en aval ou les mesures de concentration.

Résultats

Pour l’établissement du protocole, 5 blocs de tissus FFPE de patients atteints d’athérosclérose de l’artère carotide ont été utilisés. L’ADN a été isolé à l’aide d’un protocole semi-automatisé optimisé (kit C) ainsi que de deux protocoles manuels basés sur des colonnes disponibles dans le commerce (kit A et kit B, voir le tableau des matériaux). L’extraction de l’ADN avec les kits A et B a été réalisée selon le protocole du fabricant. L...

Discussion

Les méthodes d’extraction de l’ADN pour les tissus FFPE varient en qualité et en quantité d’ADN isolé, ce qui affecte inévitablement la performance des analyses ultérieures en aval. Ainsi, l’automatisation devient impérative pour améliorer le flux de travail et la standardisation, ainsi que la gestion de la qualité. Par conséquent, dans la présente étude, une méthode semi-automatisée d’extraction d’ADN à partir d’échantillons FFPE a été évaluée, démontr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes for sample incubation	Eppendorf, Hamburg, Germany	30120086
1-Thioglycerol	Promega, Walldorf, Germany	A208
Agilent tape station software 3.2	Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS Kit	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q32851
FFPE DNA Purification Kits (Kit A)	Norgene Biotek, Heidelberg, Germany	47400
FFPE tissue samples n=5	Munich Vascular Biobank,Munich, Germany
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)	Qiagen, Hilden, Germany	180134
Heating blocks, set to 80°C and 65°C	VWR,Darmstadt,Germany	460-0250
High Sensitivity D5000 reagents	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5593
High Sensitivity D5000 ScreenTape	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5592
Incubation Buffer	Promega, Walldorf, Germany	D920
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase K	Promega, Walldorf, Germany	AS1400
Maxwell RSC 48 Instrument	Promega, Walldorf, Germany	AS8500
Microcentrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c Spectrometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	ND-2000C
Optical caps	Agilent, Waldbronn, Germany	401425
Optical tube strips	Agilent, Waldbronn, Germany	401428
Pipettors and pipette tips	Eppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 for statistics, version 6.01	GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q33216
TapeStation 4200	Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan, Männedorf, Swizerland	IN-MNANO