ホルマリン固定パラフィン包埋ヒトアテローム性動脈硬化病変からの最適化された高品質DNA抽出

要約

ここでは、ヒト頸動脈のホルマリン固定パラフィン包埋病変からの半自動DNA抽出のプロトコールを紹介します。組織溶解は、有毒なキシレンを使用せずに行われ、その後、第2の溶解ステップ、セルロースベースの結合のためのDNAの常磁性粒子へのDNAの結合、洗浄ステップ、およびDNA溶出を含む自動DNA抽出プロトコルが続きます。

要約

ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織は、分子解析や臨床ゲノム研究の貴重な情報源です。これらの組織は、多くの場合、細胞が貧弱であるか、処理が困難です。したがって、核酸は慎重に分離する必要があります。近年、がんを中心とした多くの疾患の組織に対して、さまざまなDNA単離法が確立されています。残念ながら、FFPE組織から抽出されたゲノムDNAは、核酸鎖とタンパク質の間の架橋や、配列のランダムな切断により、非常に分解されています。そのため、これらのサンプルからのDNA品質は著しく低下し、さらなる分子ダウンストリーム分析が課題となります。困難な組織の他の問題は、例えば、石灰化したヒトアテローム性動脈硬化症病変および脂肪組織における細胞の欠如、小さな皮膚生検、およびその結果として、古い組織または固定組織の場合と同様に所望の核酸の利用可能性が低いことである。

当研究室では、ホルマリン固定アテローム性動脈硬化病変から、半自動単離システムを用いてDNAを抽出する方法を確立しました。この分析法を他の市販の抽出プロトコルと比較し、さらなるダウンストリーム分析に焦点を当てました。DNAの純度と濃度は、分光法と蛍光測定法によって測定されました。断片化の程度と全体的な品質が評価されました。

最高のDNA量と質は、市販のFFPEプロトコルではなく、自動抽出システム用の改変血液DNAプロトコルで得られました。この段階的なプロトコールにより、FFPEサンプルからのDNA収量は平均4倍になり、抽出プロセスに失敗した検体は少なくなりました。これは、小血管生検を扱う際に重要です。200〜800 bpのアンプリコンサイズをPCRで検出できました。この研究は、当社のFFPE組織から得られたDNAは高度に断片化されていますが、それでも短い製品の増幅とシーケンシングを成功させるために使用できることを示しています。結論として、私たちの手の中では、自動化技術は、特に小さなFFPE組織標本のDNA抽出に最適なシステムのようです。

概要

ホルマリン固定とそれに続くパラフィン包埋(FFPE)は、^{バイオバンキング1}における病理学的標本の長期保存のための標準的な手順です。これらのサンプルは、組織学的研究だけでなく、分子分析、特に遺伝学的研究²のための貴重な情報源を提供します。FFPE組織のさらなる利点は、長期保存、低コスト、保管条件の容易さです。ここでの私たちの意図は、高品質のDNA抽出が幅広い分子技術の最初の重要なステップであり、FFPE組織がサンプルの最も利用可能な供給源であるため、少量のFFPE切片から再現性のある核酸単離のための信頼性と使いやすいプロトコルを提供することです。

次世代シーケンシング(NGS)や「オミクス」研究アプローチなどの新しい科学的アプローチには、高品質の核酸^{が必要です3,4,5}。FFPE組織サンプルからDNAを抽出することは、依然として困難な試みです。FFPEサンプルのDNAは、その年齢や固定条件によって、質と量が大きく異なることがあります。最も頻繁に使用される化合物であるホルマリンは、DNA-タンパク質架橋^6,7,8を引き起こし、ヌクレオチド配列⁹に非特異的なランダム切断を引き起こします。架橋はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を無効にする可能性があるため、これは下流のゲノム解析に大きな影響を与える可能性があります^6,10。固定プロセス中の汚染物質により、FFPEサンプルから単離されたDNAの純度はしばしば制限されます。近年、DNA単離のための様々な方法が確立されており、主に癌組織標本^から2,11,12,13。

一般に、FFPE組織からの核酸抽出のプロトコールは、主に3つのグループに区別できます。最初の、最も一般的に使用される方法のグループには、市販のシリカベースのカラムシステム¹⁴が含まれる。2番目のグループは、Joseph SambrookとDavid W. Russellによって最初に記述された、フェノールとクロロホルムによる手動の有機相抽出方法を含む¹⁵。第3のグループとして、リキッドハンドリングシステムや常磁性粒子ベースのシステム¹⁶など、自動化システムがここ数年で確立された。3つの名前が付けられたシステムのそれぞれは、有害化学物質(すなわち、キシレン、フェノール、クロロホルム)、高コスト¹⁷、人的資源¹⁸、および時間消費¹⁹など、異なる長所と短所を有する。特に、困難な組織試料やハイスループット分析の場合、標準化、再現性、比較的低い時間消費、人的資源、およびコストは、核酸単離に適した方法を見つける上で最も重要な特徴である²⁰。自動抽出法は、再現性の高い結果を示し、小規模な生検に対してより感度が高いことが知られています。さらに、必要な組織や血液の量が少なくなり、大量のパラフィンによるシステムの詰まりのリスクが軽減されます。自動核酸抽出用の機械と必要なキットは、手動の方法に比べて高価ですが、抽出プロセスの問題が少ないため、依然として説得力があります。文献検索は、植物、動物、ヒトなどの異なる組織や生物、ならびに培養中の細胞からの手動、カラムベース、および自動のDNAおよびRNA抽出方法を直接比較することを示す多くの出版物を提供する20,21,22。また、10年前のスナップ凍結組織から単離されたDNAとRNAが、PCR、定量PCR、NGS、メチル化分析、クローニング9,23,24,25,26などのダウンストリーム分析に使用できることを示す証拠も文献に存在します。

例えば、老化したヒト血管組織や小さな組織生検、特にFFPEサンプルの主な問題は、高度に石灰化したアテローム性動脈硬化病変の細胞が不足していることであり、その結果、核酸の濃度が低くなっています¹。FFPE組織からのDNA抽出にはいくつかの方法がすでに確立され、広く使用されていますが、手動のサンプル調製方法は長いハンズオン時間を必要とし²⁷ 、脱パラフィンにはキシレンやフェノールなどの有毒試薬が必要です²。上述したように、脱パラフィンプロセスは、抽出されたDNAの質と量に著しく影響する重要な時間のかかるステップ(例えば、約30分)である(例えば、脱パラフィン溶液の断片化や分解、高温など、DNAに対する毒性作用)²⁸。最近開発された新しいDNA抽出プロトコルは、他の無毒な脱パラフィンソリューション、修復戦略、および自動ビーズ技術の使用に焦点を当てています。特に、自動化された方法および半自動化された方法は、効率的な回収、クロスコンタミネーションの欠如、および容易なパフォーマンスでDNA抽出に成功することが示されています²⁹。私たちは、これらの制限を克服するプロトコルを確立しました。その結果、当社の技術により、最高の定量的および定性的基準で処理と実践時間を短縮することができます。

特に、ジェノタイピング、エピゲノム研究、RNAシーケンシングなどの再現性の高いハイスループット解析では、カラムベースの精製システムを使用したFFPE試料の取り扱いは、多くの場合、困難で時間がかかります(例:長いデパラフィンステップ、カラムの詰まり、長いハンズオン時間)。パラフィンの大量摂取によるシリカ膜の目詰まりが大きな問題です。高品質の核酸の単離を悪化させる可能性のある他の状況は、皮膚のマイクロバイオプシー、小さなマウス組織、プラークなどの非常に脂肪の多いまたは石灰化した組織、骨化した組織、および老化したサンプルなどの少量の組織です。特に診断や法医学では、リキッドハンドリングや常磁性粒子ベースの抽出方法などの自動化および半自動システムが、主にハンズオン時間が比較的短く、標準化の可能性のために、ここ数年でますます重要になりました^30,31。すでに公開されているプロトコルのほとんどは、腫瘍生検や植物組織13,22,32などの細胞量が多いまたは中程度の滑らかな組織に対して完全に機能します。固定された単一細胞、石灰化した血管、コラーゲンが豊富な組織、細胞数が少ない脂肪組織など、比較的扱いにくい組織からDNAを単離するために使用される半自動粒子ベースの方法に関する文献は、あまり説明されていません³³。

この研究では、血管パラフィン包埋切片からのDNA単離のための最適化された半自動法について、2つの手動カラムベースのプロトコルと比較して説明します。DNAの量、純度、および断片化の程度をバリデーションに使用しました。市販の血液DNAプロトコルを出発点として使用し、半自動システムの手動ステップは、その後、FFPEの使用だけでなく、ヒトおよび動物組織からの新鮮な凍結組織サンプルの使用に最適化されました。このプロトコルの自動ステップは、装置にあらかじめインストールされており、使用するキット(ここでは血液DNAキット)によって異なります。記載されている半自動カートリッジベースのシステムでは、血液、新鮮凍結組織、ホルマリン固定組織、さらには単一細胞からDNAを同じプロトコル、機械、キット、消耗品で分離することが可能です。プロトコルにはわずかな違いしかなく、例えば1つのバッファーやアプリケーションごとにインキュベーション時間があるだけなので、このプロトコルはあらゆる種類の組織からDNAを抽出するのに非常に便利です。私たちのプロトコルは、主に石灰化、細胞の乏しい細胞、および線維性のヒト血管組織に最適化されていますが、もちろん、上記のあらゆる種類の困難な組織にさらに最適化することができます。

要約すると、アテローム性動脈硬化症(大動脈、頸動脈、冠状動脈など)に取り組む心血管分野の研究者向けに、血管FFPEサンプルからの半自動DNA抽出のための使いやすいポイントバイポイントプロトコルを提供します。

プロトコル

ヒト頸動脈アテローム性動脈硬化性標本をバイオバンクに収集する許可は、地元の病院倫理委員会(2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Munich, Germany)によって承認されました。書面によるインフォームドコンセントは、すべての患者から得られました。実験はヘルシンキ宣言の原則に従って行われました。

1. ティッシュの準備

1. ミクロトームを含むFFPEサンプルから10 μmの組織切片を5〜8個調製し、1.5 mLチューブに移します。ブロックからのパラフィンの過剰量を減らす必要はありません。
   注:1つの大きな切片ではなく、1つの切片を薄くすると、バッファー反応が加速します。O₂ 被ばくのため、最初のセクションを破棄します。サンプルが大きい場合は、使用するセクションを減らすことも可能です。
2. これらのチューブをベンチトップ遠心分離機で遠心分離し、室温で5,000 x g に1分間設定して、チューブの底に各サンプルを収集します。
   注意:遠心分離が長すぎると、サンプルが凝固し、溶解が複雑になります。

2. 脂質溶解と脱パラフィン

注:このステップは、脱パラフィンと脂質消化に必要です。使用されるバッファーは、市販の脱パラフィン溶液よりも毒性が低くなります。

1. 市販のインキュベーションバッファー300μLと1-チオグリセロール6μLを各チューブに加えます。
   注意: 300μLは自動化システムカートリッジの最大容量であるため、使用しないでください。
2. 10秒間ボルテックスし、加熱ブロック内でサンプルを80°C、500rpmで10分間インキュベートしてパラフィンを可溶化します。
   注意: 組織は最終的に完全に溶解する必要があります。必要に応じて、インキュベーション中に数回ボルテックスします。

3. サンプルとタンパク質の消化

注:プロテアーゼKによるネイティブ消化は、タンパク質を含まないクリーンなDNA抽出物を得るために重要です。また、存在する汚染タンパク質も低減します。さらに、^DNA34を保存するためにヌクレアーゼも破壊される。この一晩のステップは、完全なサンプル分解にも必要です。

1. サンプルを60°Cまで冷ましてから、付属のプロテイナーゼK溶液30μLを加えます。
2. 再びボルテックスし、混合物を65°C、500rpmで一晩(4〜20時間)加熱ブロック内でインキュベートします。インキュベーション中にサンプルを時々ボルテックスして、完全なサンプル分解を行います。
   注:一晩インキュベートすると、より良い結果が得られます。混合ステップは30〜60分ごとに推奨されます。結局、チューブ内に視覚的なティッシュピースがあってはなりません。

4. 細胞溶解

1. 血液キットに付属の溶解バッファー400μLを加え、まもなくボルテックスします。
2. サンプルを再度65°Cで30分間、500rpmでインキュベートします。
3. サンプルを室温まで冷まします。パラフィンは上部で固まります。
   注意:パラフィンをサンプルから分離しておくために、再度ボルテックスしないでください。さもなければ、パラフィンは組織と混合され、それがサンプルを破壊する。サンプルはステップ6.1で収集されます。

5. あらかじめ塗布されたカートリッジの準備

1. マシンと関連するタブレットコンピューターの電源を入れます。
2. ソフトウェアアプリを起動し、 ドア ボタンをクリックして機器を開きます。
3. ラックを装置から取り外し、事前に充填されたカートリッジをプローブラックに挿入します。カートリッジが所定の位置に収まるときに 2 回カチッと音がすることを確認し、シーリング ホイルを取り外してください。
4. カートリッジの最後の(8)ウェルにプランジャーを追加します。これは、機器のピペットチップとして機能します。
5. 付属の0.5 mL溶出チューブに、キットに付属の65 μLの溶出バッファーを満たします。チューブは開いたままにして、カートリッジの後、ラックの前部の専用位置に挿入します。
   注:溶出の最小容量は60μLです。システムは、追加された溶出量のうち 5 〜 10 μL を失います。

6. DNAの自動抽出

1. ステップ 4.3 で 1.5 mL チューブの上部にパラフィンを慎重に穿刺し、パラフィンと再度混合せずにチューブの底にあるクリーンなサンプルに到達させます。
2. 調製したサンプルの全混合物(730 μL)をカートリッジの最初のウェルに移します。
3. ラックを自動DNA抽出機に挿入します。ラックが最初にマシンの背面にロックされ、その後で前面にロックされていることを確認します。
4. ソフトウェアの左上のオレンジ色の [スタート ]ボタンをクリックして、実行を開始します。さまざまなプロトコルがプリインストールされたウィンドウが開きます。装置で 血液DNAプロトコル を選択します。プランジャー、溶出チューブ、サンプルが追加されたことを確認するには、ソフトウェアで[はい]をクリックします。計器のドアが自動的に閉まり、走行が始まります(ライトが緑色に変わります)。所要時間は約38分です。これ以上のキャリブレーションは必要ありません。
   メモ: システムがラック内のすべてのサンプルのプランジャーをピックアップするまで見てください。これが行われない場合、システムは自動的に停止し、マシンプロトコルを再起動する必要があります。
5. システムがカートリッジの最初のウェルで自動溶解ステップを実行し、続いてウェル 3 から 7 で洗浄ステップを実行することを確認します。これ以上のプログラミング手順は必要ありません。完全なプログラムは会社によってプリインストールされています。
6. 完了したら、システムが調製した溶出チューブ内のDNAを添加したプランジャーを介して溶出することを確認します。磁性粒子はプランジャー内に留まります。最後のプランジャーは、カートリッジの最後のウェルに戻ります。

7. ランを終える

1. 実行が完了したら(マシンに緑色の点滅ライトが表示されます)、開くボタン(ドアサイン)をクリックして機器を開き、ラックをシステムから取り外します。
2. カートリッジを廃棄します。
3. 空のラックを機器に再度挿入し、右上隅のドアボタンでドアを閉じます。ソフトウェアアプリを閉じて、マシンとタブレットコンピューターの電源を切ります。
4. 溶出液は、長期保存の場合は-20°C、短期保存の場合は4°Cで保存するか、ダウンストリーム分析や濃度測定に直接使用します。

結果

プロトコルの確立には、頸動脈のアテローム性動脈硬化症患者からの 5 つの FFPE 組織ブロックが使用されました。DNAは、最適化された半自動プロトコル(キットC)と、市販の2つの手動カラムベースのプロトコル(キットAおよびキットB、 材料表を参照)で単離しました。キットAおよびBによるDNA抽出は、製造元のプロトコルに従って行った。市販の2つのキッ?...

ディスカッション

FFPE組織のDNA抽出法は、単離されたDNAの質と量にばらつきがあり、必然的にその後のダウンストリーム分析のパフォーマンスに影響を与えます。そのため、ワークフローや標準化、品質管理の向上のためには、自動化が不可欠になってきています。したがって、本研究では、FFPEサンプルからのDNA抽出の半自動方法が評価され、他のテストされた手動カラムベースのプ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes for sample incubation	Eppendorf, Hamburg, Germany	30120086
1-Thioglycerol	Promega, Walldorf, Germany	A208
Agilent tape station software 3.2	Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS Kit	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q32851
FFPE DNA Purification Kits (Kit A)	Norgene Biotek, Heidelberg, Germany	47400
FFPE tissue samples n=5	Munich Vascular Biobank,Munich, Germany
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)	Qiagen, Hilden, Germany	180134
Heating blocks, set to 80°C and 65°C	VWR,Darmstadt,Germany	460-0250
High Sensitivity D5000 reagents	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5593
High Sensitivity D5000 ScreenTape	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5592
Incubation Buffer	Promega, Walldorf, Germany	D920
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase K	Promega, Walldorf, Germany	AS1400
Maxwell RSC 48 Instrument	Promega, Walldorf, Germany	AS8500
Microcentrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c Spectrometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	ND-2000C
Optical caps	Agilent, Waldbronn, Germany	401425
Optical tube strips	Agilent, Waldbronn, Germany	401428
Pipettors and pipette tips	Eppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 for statistics, version 6.01	GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q33216
TapeStation 4200	Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan, Männedorf, Swizerland	IN-MNANO