JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, insan karotis arterlerinin formalinle sabitlenmiş parafine gömülü lezyonlarından yarı otomatik DNA ekstraksiyonu için bir protokol sunuyoruz. Doku lizisi, toksik ksilen olmadan gerçekleştirilir, bunu ikinci bir lizis aşaması, selüloz bazlı bağlanma için DNA'nın paramanyetik parçacıklara bağlanması, yıkama adımları ve DNA elüsyonu dahil olmak üzere otomatik bir DNA ekstraksiyon protokolü izler.

Özet

Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dokular, moleküler analizler ve klinik genomik çalışmalar için değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Bu dokular genellikle hücreler bakımından fakirdir veya işlenmesi zordur. Bu nedenle, nükleik asitlerin dikkatli bir şekilde izole edilmesi gerekir. Son yıllarda başta kanser olmak üzere birçok hastalıktan alınan dokular için DNA izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Ne yazık ki, FFPE dokularından ekstrakte edilen genomik DNA, nükleik asit zincirleri ve proteinler arasındaki çapraz bağlanmanın yanı sıra dizideki rastgele kırılmalar nedeniyle oldukça bozulur. Bu nedenle, bu numunelerden elde edilen DNA kalitesi belirgin şekilde azalır ve bu da onu daha sonraki moleküler aşağı akış analizleri için bir zorluk haline getirir. Zor dokularla ilgili diğer problemler, örneğin, kalsifiye insan aterosklerotik lezyonlarında ve yağ dokusunda hücre eksikliği, küçük cilt biyopsileri ve sonuç olarak eski veya sabit dokularda olduğu gibi istenen nükleik asitlerin düşük mevcudiyetidir.

Laboratuvarlarımızda, formalinle sabitlenmiş aterosklerotik lezyonlardan yarı otomatik bir izolasyon sistemi kullanarak DNA ekstraksiyonu için bir yöntem oluşturduk. Bu yöntemi ticari olarak mevcut diğer ekstraksiyon protokolleriyle karşılaştırdık ve daha fazla aşağı akış analizine odaklandık. DNA'nın saflığı ve konsantrasyonu spektrometri ve florometri ile ölçüldü. Parçalanma derecesi ve genel kalite değerlendirildi.

En yüksek DNA miktarı ve kalitesi, ticari FFPE protokolü yerine, otomatik ekstraksiyon sistemi için modifiye kan DNA protokolü ile elde edilmiştir. Bu adım adım protokolle, FFPE örneklerinden elde edilen DNA verimleri ortalama dört kat daha yüksekti ve daha az örnek, küçük damar biyopsileri ile uğraşırken kritik olan ekstraksiyon işleminde başarısız oldu. 200-800 bp arasındaki amplikon boyutları PCR ile tespit edilebilir. Bu çalışma, FFPE dokumuzdan elde edilen DNA'nın yüksek oranda parçalanmış olmasına rağmen, daha kısa ürünlerin başarılı bir şekilde amplifikasyonu ve dizilenmesi için hala kullanılabileceğini göstermektedir. Sonuç olarak, elimizde, otomatik teknoloji, özellikle küçük FFPE doku örnekleri için DNA ekstraksiyonu için en iyi sistem gibi görünmektedir.

Giriş

Formalin fiksasyonu ve ardından parafin gömme (FFPE), biyobankacılıkta patolojik örneğin uzun süreli korunması için standart bir prosedürdür1. Bu örnekler, histolojik çalışmaların yanı sıra moleküler analizler, özellikle genetik çalışmalar için değerli bir kaynak oluşturmaktadır2. FFPE dokuların diğer avantajları daha iyi uzun süreli depolama, daha düşük maliyetler ve daha kolay saklama koşullarıdır. Buradaki amacımız, yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonunun çok çeşitli moleküler tekniklerde ilk önemli adım olması ve FFPE dokularının en uygun numune kaynağı olması nedeniyle, küçük miktarlarda FFPE kesitlerinden tekrarlanabilir nükleik asit izolasyonu için güvenilir ve kullanımı kolay bir protokol sağlamaktır.

Yeni nesil dizileme (NGS) ve "omik" araştırma yaklaşımları gibi yeni bilimsel yaklaşımlar, yüksek kalitede nükleik asitler gerektirir 3,4,5. FFPE doku örneklerinden DNA çıkarmak zorlu bir çaba olmaya devam etmektedir. FFPE örneklerinden elde edilen DNA, yaşına ve fiksasyon koşullarına bağlı olarak kalite ve miktar açısından büyük farklılıklar gösterebilir. En sık kullanılan bileşik olan formalin, DNA-protein çapraz bağlanmasına 6,7,8 yol açar ve nükleotid dizisi9'da spesifik olmayan rastgele kırılmaya neden olur. Bu, aşağı akış genomik analizlerini önemli ölçüde etkileyebilir, çünkü çapraz bağlama polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonunu devre dışı bırakabilir 6,10. Fiksasyon işlemi sırasındaki kirleticiler nedeniyle, FFPE örneklerinden izole edilen DNA'nın saflığı genellikle sınırlıdır. Son yıllarda, çoğunlukla kanser dokusu örneklerinden 2,11,12,13 olmak üzere DNA izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir.

Genel olarak, FFPE dokusundan nükleik asitlerin ekstraksiyonu için protokoller üç ana gruba ayrılabilir. İlk, en yaygın olarak kullanılan yöntem grubu, ticari olarak temin edilebilen silika bazlı kolon sistemlerini içerir14. İkinci grup, ilk olarak Joseph Sambrook ve David W. Russell15 tarafından tanımlanan fenol ve kloroform ile manuel organik faz ekstraksiyon yöntemlerini içerir. Üçüncü bir grup olarak, son yıllarda sıvı taşıma sistemleri ve paramanyetik parçacık tabanlı sistemler gibi otomatik sistemler kurulmuştur16. Adı geçen üç sistemin her biri, tehlikeli kimyasallar (yani ksilen, fenol, kloroform), yüksek maliyetler17, insan gücü18 ve zaman tüketimi19 gibi farklı avantaj ve dezavantajlara sahiptir. Özellikle, zor doku örneği ve yüksek verimli analizler için standardizasyon, tekrarlanabilirlik, nispeten düşük zaman tüketimi, insan gücü ve maliyetler, nükleik asit izolasyonu için uygun bir yöntem bulmada en önemli özelliklerdir20. Otomatik ekstraksiyon yöntemlerinin daha iyi tekrarlanabilir sonuçlar gösterdiği ve küçük biyopsiler için daha hassas olduğu bilinmektedir. Ayrıca, daha az miktarda doku veya kana ihtiyaç duyulur ve yüksek miktarda parafin nedeniyle sistemin tıkanma riski azalır. Otomatik nükleik asit ekstraksiyonu için makineler ve ihtiyaç duyulan kitler manuel yöntemlere göre daha pahalı olsa da, daha az sorunlu ekstraksiyon işlemleri nedeniyle hala ikna edicidirler. Literatür taraması, bitkiler, hayvanlar ve insanlar gibi farklı doku ve organizmalardan manuel, sütun tabanlı ve otomatik DNA ve RNA ekstraksiyon yöntemlerinin yanı sıra kültürdeki hücreler arasında doğrudan bir karşılaştırmayı gösteren birçok yayın sağlar20,21,22. Literatürde ayrıca 10 yıllık snap frozen dokudan izole edilen DNA ve RNA'nın PCR, kantitatif PCR, NGS, metilasyon analizleri ve klonlama gibi alt akış analizleri için kullanılabileceğini gösteren kanıtlar bulunmaktadır 9,23,24,25,26.

Örneğin, yaşlı insan vasküler dokusunun yanı sıra, özellikle FFPE örnekleriyle ilgili küçük doku biyopsileri ile ilgili en büyük sorun, yüksek derecede kalsifiye olmuş aterosklerotik lezyonlarda hücre eksikliğidir ve bu da sonuç olarak düşük nükleik asit konsantrasyonlarına yol açar1. FFPE dokusundan DNA ekstraksiyonu için çeşitli yöntemler halihazırda oluşturulmuş ve yaygın olarak kullanılmasına rağmen, manuel numune hazırlama yöntemleri uzun uygulama süresigerektirir 27 ve deparafinizasyon için ksilen veya fenol gibi toksik reaktiflergereklidir 2. Açıklandığı gibi, deparafinizasyon işlemi, ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini ve miktarını belirgin şekilde etkileyen çok önemli bir zaman alıcı adımdır (örneğin, yaklaşık 30 dakika) (örneğin, deparafinizasyon çözeltisinin parçalanması ve bozulması gibi DNA üzerindeki toksik etkiler ve yüksek sıcaklıklar)28. Son zamanlarda geliştirilen yeni DNA ekstraksiyon protokolleri, diğer toksik olmayan deparafinizasyon çözümlerinin, onarım stratejilerinin ve otomatik boncuk teknolojilerinin kullanımına odaklanmaktadır. Özellikle, otomatik ve yarı otomatik yöntemlerin, verimli geri kazanım, çapraz kontaminasyon eksikliği ve kolay performans ile DNA ekstraksiyonunda başarılı olduğu gösterilmiştir29. Bu sınırlamaları aşan bir protokol oluşturduk. Sonuç olarak, tekniğimiz en yüksek nicel ve nitel standartlarda işleme ve uygulama süresinin azaltılmasına izin verir.

Özellikle genotipleme, epigenomik çalışmalar ve RNA dizileme gibi tekrarlanabilir yüksek verimli analizler için FFPE örneğinin kolon bazlı saflaştırma sistemleriyle işlenmesi genellikle zor ve zaman alıcıdır (örneğin, uzun deparafinizasyon adımları, kolon tıkanması ve uzun uygulama süreleri). Yüksek miktarda parafin nedeniyle silika membranların tıkanması en önemli sorundur. Yüksek kaliteli nükleik asitlerin izolasyonunu kötüleştirebilecek diğer durumlar, cildin mikrobiyopsileri, küçük fare dokusu, plaklar olarak çok yağlı veya kalsifiye doku, kemikleşmiş doku ve yaşlı numuneler gibi küçük miktarlarda dokudur. Özellikle tanı ve adli tıpta, sıvı işleme veya paramanyetik parçacık bazlı ekstraksiyon yöntemleri gibi otomatik ve yarı otomatik sistemler, esas olarak nispeten düşük uygulamalı süreler ve standardizasyon olasılığı nedeniyle son birkaç yılda giderek daha önemli hale geldi30,31. Halihazırda yayınlanmış protokollerin çoğu, tümör biyopsileri veya bitki dokusu gibi yüksek veya orta miktarda hücre içeren düz dokular için mükemmel çalışır 13,22,32. Sabit tek hücreler, kalsifiye damarlar, kollajenden zengin doku ve düşük hücre sayısına sahip yağ dokusu gibi nispeten zor işlenebilen dokulardan DNA'yı izole etmek için kullanılan yarı otomatik parçacık bazlı yöntemler hakkındaki literatür sadece yetersiz bir şekilde tanımlanmıştır33.

Bu çalışmada, vasküler parafine gömülü bölümlerden DNA izolasyonu için optimize edilmiş yarı otomatik bir yöntem tarif edilmiş ve iki manuel sütun tabanlı protokolle karşılaştırılmıştır. Doğrulama için DNA miktarı, saflığı ve parçalanma derecesi kullanıldı. Ticari olarak temin edilebilen kan DNA protokolü bir başlangıç noktası olarak kullanıldı ve yarı otomatik sistemin manuel adımları daha sonra FFPE ve doku protokolünden alınan adımları birleştirerek insan ve hayvan dokusundan taze donmuş doku örneklerinin yanı sıra FFPE'nin kullanımı için optimize edildi. Bu protokolün otomatik adımı, cihaza önceden yüklenmiştir ve kullanılan kite bağlıdır (burada, kan DNA kiti). Tarif edilen yarı otomatik kartuş tabanlı sistem ile firma tarafından önerildiği gibi cihaz için farklı protokoller ve kitler kullanmak yerine, aynı protokol, makine, kit ve sarf malzemeleri ile kan, taze donmuş doku, formalinle sabitlenmiş doku ve hatta tek hücrelerden DNA izole etmek mümkündür. Protokollerde, farklı uygulamalar için bir tampon ve bazı inkübasyon süreleri gibi sadece küçük farklılıklar vardır, bu da bu protokolü her türlü dokudan DNA çıkarmak için çok yararlı kılar. Protokolümüz öncelikle kalsifiye edilmiş, hücreler açısından fakir ve fibröz insan vasküler dokusu için optimize edilmiştir, ancak elbette yukarıda belirtilen her türlü zor doku için kullanılabilir ve daha da optimize edilebilir.

Özetlemek gerekirse, ateroskleroz (örneğin, aort, karotis arterler, koroner arterler) üzerinde çalışan kardiyovasküler alandaki araştırmacılar için, vasküler FFPE örneklerinden yarı otomatik DNA ekstraksiyonu için kullanımı kolay, nokta nokta bir protokol sunuyoruz.

Protokol

Biyobankamızda insan karotis aterosklerotik örneklerinin toplanması izni, yerel Hastane Etik Komitesi (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Münih, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Deneyler Helsinki Bildirgesi ilkelerine uygun olarak yapıldı.

1. Doku hazırlama

  1. Mikrotom ile FFPE örneğinden 10 μm'lik 5-8 doku kesiti hazırlayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Bloktan parafin fazlalığını azaltmak gerekli değildir.
    NOT: Tek bir büyük bölüm yerine daha ince tek bölümler tampon reaksiyonunu hızlandırır. O2 maruziyeti nedeniyle ilk bölümleri atın. Daha büyük numuneler için daha az bölüm kullanmak da mümkündür.
  2. Bu tüpleri, tüpün altındaki her bir numuneyi toplamak için oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5.000 x g'ye ayarlanmış bir tezgah üstü santrifüjde santrifüjleyin.
    DİKKAT: Çok uzun santrifüjleme, numunenin pıhtılaşmasına neden olur ve lizizi zorlaştırır.

2. Lipid çözünmesi ve deparafinizasyon

NOT: Bu adım, deparafinizasyon ve lipid sindirimi için gereklidir. Kullanılan tampon, ticari deparafinizasyon solüsyonlarından daha az toksiktir.

  1. Her tüpe 300 μL ticari olarak temin edilebilen inkübasyon tamponu ve 6 μL 1-tiyogaliserol ekleyin.
    NOT: Otomasyon sistemi kartuşunun maksimum hacmi olduğundan 300 μL'den fazla kullanmayın.
  2. 10 saniye boyunca vorteksleyin ve parafini çözündürmek için numuneyi bir ısıtma bloğunda 80 ° C ve 500 rpm'de 10 dakika inkübe edin.
    DİKKAT: Sonunda doku tamamen çözülmelidir. Gerekirse, inkübasyon sırasında birkaç kez girdap.

3. Örnek ve protein sindirimi

NOT: Proteaz K ile doğal sindirim, protein içermeyen temiz DNA ekstraktlarına sahip olmak için çok önemlidir. Ayrıca mevcut kirletici proteinleri de azaltır. Ayrıca, DNA'yı kurtarmak için nükleazlar da yok edilir34. Bu gece boyunca gerçekleştirilen bu adım, numunenin tam olarak sindirilmesi için de gereklidir.

  1. Numuneyi 60 °C'ye kadar soğumaya bırakın ve ardından sağlanan Proteinaz K çözeltisinden 30 μL ekleyin.
  2. Tekrar vorteksleyin ve karışımı bir ısıtma bloğunda gece boyunca (4-20 saat) 65 °C ve 500 rpm'de inkübe edin. Tam numune sindirimi için zaman zaman inkübasyon sırasında numuneleri vorteksleyin.
    NOT: Gece boyunca inkübasyon daha iyi sonuçlara yol açar. Karıştırma adımları her 30-60 dakikada bir önerilir. Sonuçta tüpün içinde herhangi bir görsel doku parçası olmamalıdır.

4. Hücre lizisi

  1. Kan kitinde sağlanan 400 μL lizis tamponu ekleyin ve kısa süre içinde girdap yapın.
  2. Numuneyi 65 °C'de 500 rpm ile 30 dakika tekrar inkübe edin.
  3. Numuneyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Parafin üstte sertleşecektir.
    DİKKAT: Parafini numuneden ayrı tutmak için tekrar girdap yapmayın. Aksi takdirde, parafin doku ile karıştırılır ve bu da numuneyi tahrip eder. Numune adım 6.1'de toplanacaktır.

5. Önceden dağıtılmış kartuşların hazırlanması

  1. Makineyi ve ilgili tablet bilgisayarı açın.
  2. Yazılım uygulamasını başlatın ve cihazı açmak için Kapı düğmesine tıklayın.
  3. Rafı cihazdan çıkarın ve önceden doldurulmuş kartuşu prob rafına yerleştirin. Kartuşun yerine oturduğunda iki kez tıklandığından emin olun ve sızdırmazlık folyosunu çıkarın.
  4. Pistonu kartuşun son (8) kuyusuna ekleyin. Cihazda pipet ucu görevi görür.
  5. Sağlanan 0.5 mL elüsyon tüplerini kit ile birlikte verilen 65 μL elüsyon tamponu ile doldurun. Tüpleri açık bırakın ve kartuştan sonra rafın ön kısmındaki özel konuma yerleştirin.
    NOT: Elüsyon için minimum hacim 60 μL'dir. Sistem, eklenen elüsyon hacminin 5-10 μL'sini kaybedecektir.

6. Otomatik DNA ekstraksiyonu

  1. Tüpün altındaki temiz numuneye ulaşmak için tekrar parafin ile karıştırmadan tüpün altındaki temiz numuneye ulaşmak için 1.5 mL'lik tüpün üzerine 4.3. adımdan itibaren parafini dikkatlice delin.
  2. Hazırlanan numunenin tüm karışımını (730 μL) kartuşun ilk kuyucuğuna aktarın.
  3. Rafı otomatik DNA ekstraksiyon makinesine yerleştirin. Rafın önce makinenin arkasından, daha sonra önünden kilitlendiğinden emin olun.
  4. Yazılımda sol üstteki turuncu Başlat düğmesine tıklayarak çalıştırmayı başlatın. Önceden yüklenmiş farklı protokollere sahip bir pencere açılacaktır. Cihazda Kan DNA protokolünü seçin. Yazılımda evet'e tıklayarak piston, elüsyon tüpü ve s'nin eklendiğini onaylayın. Cihazın kapısı otomatik olarak kapanacak ve çalışma başlayacaktır (ışık yeşile dönecektir). Koşu yaklaşık 38 dakika sürecektir. Başka bir kalibrasyona gerek yoktur.
    NOT: Sistem, raftaki tüm numuneler için pistonları alana kadar izleyin. Bu olmazsa, sistem otomatik olarak durur ve makine protokolünün yeniden başlatılması gerekir.
  5. Sistemin, kartuşun ilk kuyusunda otomatik lizis adımını ve ardından 3 ila 7 numaralı kuyularda yıkama adımlarını gerçekleştirdiğinden emin olun. Başka bir programlama adımına gerek yoktur. Programın tamamı şirket tarafından önceden yüklenmiştir.
  6. Tamamlandığında, sistemin hazırlanan elüsyon tüplerindeki DNA'yı eklenen piston aracılığıyla dışarı çıkardığından emin olun. Manyetik parçacıklar pistonda kalır. Sonunda piston, kartuşun son kuyusuna geri döner.

7. Koşuyu bitirin

  1. Çalışma tamamlandığında (makine yeşil renkte yanıp sönen ışığı gösterir), açma düğmesine (kapı işareti) tıklayarak cihazı açın ve rafı sistemden çıkarın.
  2. Kartuşları atın.
  3. Boş rafı cihaza tekrar takın ve sağ üst köşedeki kapı düğmesi ile kapıyı kapatın. Yazılım uygulamasını kapatın ve makineyi ve tablet bilgisayarı kapatın.
  4. Elüatları uzun süreli depolama için -20 °C'de veya kısa süreli depolama için 4 °C'de saklayın veya doğrudan aşağı akış analizi veya konsantrasyon ölçümleri için kullanın.

Sonuçlar

Protokolün oluşturulması için karotis arter aterosklerozu olan hastalardan alınan 5 adet FFPE doku bloğu kullanıldı. DNA, optimize edilmiş bir yarı otomatik protokol (kit C) ve ayrıca ticari olarak temin edilebilen iki manuel sütun tabanlı protokol (kit A ve kit B, bkz . Malzeme Tablosu) ile izole edildi. Kit A ve B ile DNA ekstraksiyonu, üreticinin protokolüne göre gerçekleştirildi. Piyasada bulunan iki kitin (kit A ve kit B) protokolünde yapılan tek...

Tartışmalar

FFPE dokusu için DNA ekstraksiyon yöntemleri, izole edilmiş DNA'nın kalitesi ve miktarı bakımından farklılık gösterir ve bu da kaçınılmaz olarak daha sonraki aşağı akış analizlerinin performansını etkiler. Bu nedenle, iş akışı ve standardizasyonun yanı sıra kalite yönetimini iyileştirmek için otomasyon zorunlu hale geliyor. Bu nedenle, bu çalışmada, FFPE örneklerinden DNA ekstraksiyonu için yarı otomatik bir yöntem değerlendirildi ve test edilen diğe...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Otomatik DNA ekstraksiyonu için protokolün oluşturulması, Promega şirketinden Dr. Paul Muschler tarafından desteklendi. Paul Muschler'e desteği ve bilimsel katkısı için teşekkür ederiz. Ayrıca meslektaşımız Dr. Moritz von Scheidt'e (Münih Alman Kalp Merkezi) bize Maxwell cihazını sağladığı ve deneysel kısmı desteklediği için teşekkür ederiz. Tüm deneyler Alman Kalp Merkezi (Münih, Almanya) ve Klinikum rechts der Isar (Münih, Almanya) laboratuvarlarında gerçekleştirildi. Araştırma DFG (PE 900/6-1) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubes for sample incubationEppendorf, Hamburg, Germany30120086
1-ThioglycerolPromega, Walldorf, GermanyA208
Agilent tape station software 3.2Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS KitThermoFisher Scientific, Schwerte, GermanyQ32851
FFPE DNA Purification Kits (Kit A)Norgene Biotek, Heidelberg, Germany47400
FFPE tissue samples n=5Munich Vascular Biobank,Munich, Germany
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)Qiagen, Hilden, Germany180134
Heating blocks, set to 80°C and 65°CVWR,Darmstadt,Germany460-0250
High Sensitivity D5000 reagentsAgilent, Waldbronn, Germany5067-5593
High Sensitivity D5000 ScreenTapeAgilent, Waldbronn, Germany5067-5592
Incubation BufferPromega, Walldorf, GermanyD920
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase KPromega, Walldorf, GermanyAS1400
Maxwell RSC 48 InstrumentPromega, Walldorf, GermanyAS8500
MicrocentrifugeEppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c SpectrometerThermoFisher Scientific, Schwerte, GermanyND-2000C
Optical capsAgilent, Waldbronn, Germany401425
Optical tube stripsAgilent, Waldbronn, Germany401428
Pipettors and pipette tipsEppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 for statistics, version 6.01GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisher Scientific, Schwerte, GermanyQ33216
TapeStation 4200Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 ProTecan, Männedorf, SwizerlandIN-MNANO

Referanslar

  1. Pelisek, J., et al. Biobanking: objectives, requirements, and future challenges-experiences from the munich vascular biobank. Journal of Clinical Medicine. 8 (2), 251 (2019).
  2. Goelz, S. E., Hamilton, S. R., Vogelstein, B. Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue. Biochemical and Biophysical Research Communications. 130 (1), 118-126 (1985).
  3. Busch, A., Eken, S. M., Maegdefessel, L. Prospective and therapeutic screening value of non-coding RNA as biomarkers in cardiovascular disease. Annals of Translational Medicine. 4 (12), (2016).
  4. Kandpal, R. P., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. BioTechniques. 46 (5), 351-355 (2009).
  5. McDonough, S. J., et al. Use of FFPE-derived DNA in next generation sequencing: DNA extraction methods. PloS One. 14 (4), (2019).
  6. Gilbert, M. T. P., et al. The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin-embedded tissues-which methods are useful when. PloS One. 2 (6), (2007).
  7. Williams, C., et al. A high frequency of sequence alterations is due to formalin fixation of archival specimens. The American Journal of Pathology. 155 (5), 1467-1471 (1999).
  8. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  9. Gillio-Tos, A., et al. Efficient DNA extraction from 25-year-old paraffin-embedded tissues: study of 365 samples. Pathology. 39 (3), 345-348 (2007).
  10. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  11. van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Experimental and Molecular Pathology. 94 (1), 121-125 (2013).
  12. Sarnecka, A. K., et al. DNA extraction from FFPE tissue samples–a comparison of three procedures. Contemporary Oncology. 23 (1), 52 (2019).
  13. Kalmár, A., et al. Comparison of automated and manual DNA isolation methods for DNA methylation analysis of biopsy, fresh frozen, and formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal cancer samples. Journal of Laboratory Automation. 20 (6), 642-651 (2015).
  14. McCormick, S. F. . Multilevel adaptive methods for partial differential equations. (SIAM). , (1989).
  15. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 4455 (2006).
  16. Berensmeier, S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids. Applied Microbiology and Biotechnology. 73 (3), 495-504 (2006).
  17. Petrigh, R. S., Fugassa, M. H. DNA extraction and a cost-effective detection method for Echinococcus granulosus protoscoleces. Veterinary Parasitology. 198 (3-4), 410-413 (2013).
  18. Lee, J. H., Park, Y., Choi, J. R., Lee, E. K., Kim, H. S. Comparisons of three automated systems for genomic DNA extraction in a clinical diagnostic laboratory. Yonsei Medical Journal. 51 (1), 104-110 (2010).
  19. Rohland, N., Siedel, H., Hofreiter, M. A rapid column-based ancient DNA extraction method for increased sample throughput. Molecular Ecology Resources. 10 (4), 677-683 (2010).
  20. Gutiérrez-López, R., Martínez-de la Puente, J., Gangoso, L., Soriguer, R. C., Figuerola, J. Comparison of manual and semi-automatic DNA extraction protocols for the barcoding characterization of hematophagous louse flies (Diptera: Hippoboscidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 40 (1), 11-15 (2015).
  21. Seiler, C., et al. Nucleic acid extraction from formalin-fixed paraffin-embedded cancer cell line samples: a trade off between quantity and quality. BMC Clinical Pathology. 16 (1), 17 (2016).
  22. Harada, S. . Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples. , 125-138 (2016).
  23. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PloS One. 12 (6), 0178706 (2017).
  24. Fujii, T., et al. Evaluation of DNA and RNA quality from archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue for next-generation sequencing-Retrospective study in Japanese single institution. Pathology International. , (2020).
  25. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Archiv: An International Journal of Pathology. 460 (2), 131-140 (2012).
  26. Niland, E. E., McGuire, A., Cox, M. H., Sandusky, G. E. High quality DNA obtained with an automated DNA extraction method with 70+ year old formalin-fixed celloidin-embedded (FFCE) blocks from the indiana medical history museum. American Journal of Translational Research. 4 (2), 198 (2012).
  27. Riemann, K., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 21 (4), 244-248 (2007).
  28. Steinau, M., Patel, S. S., Unger, E. R. Efficient DNA extraction for HPV genotyping in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 13 (4), 377-381 (2011).
  29. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. The Journal of Molecular Diagnostics. 10 (4), 311-316 (2008).
  30. Okello, J. B., et al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues. Analytical Biochemistry. 400 (1), 110-117 (2010).
  31. Witt, S., Neumann, J., Zierdt, H., Gébel, G., Röscheisen, C. Establishing a novel automated magnetic bead-based method for the extraction of DNA from a variety of forensic samples. Forensic Science International: Genetics. 6 (5), 539-547 (2012).
  32. Ivanova, N. V., Fazekas, A. J., Hebert, P. D. Semi-automated, membrane-based protocol for DNA isolation from plants. Plant Molecular Biology Reporter. 26 (3), 186 (2008).
  33. Sengüven, B., Baris, E., Oygur, T., Berktas, M. Comparison of methods for the extraction of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues. International Journal of Medical Sciences. 11 (5), 494 (2014).
  34. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research. 16 (3), 1215 (1988).
  35. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  36. Khokhar, S. K., Mitui, M., Leos, N. K., Rogers, B. B., Park, J. Y. Evaluation of Maxwell 16 for automated DNA extraction from whole blood and formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 50 (2), 267-272 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

DNA EkstraksiyonuFormalinle Sabitlenmi Parafin G m lFFPE DokularMolek ler AnalizlerGenomik al malarN kleik Asit zolasyonuDNA KalitesiOtomatik zolasyon SistemiDNA ProtokolleriDownstream AnalizleriSpektrometreFlorometriPar alanma De erlendirmesiPCR AmplifikasyonuK k Damar Biyopsileri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır