Optimierte hochwertige DNA-Extraktion aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten humanen atherosklerotischen Läsionen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die halbautomatische DNA-Extraktion aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Läsionen menschlicher Halsschlagadern vor. Die Gewebelyse wird ohne toxisches Xylol durchgeführt, gefolgt von einem automatisierten DNA-Extraktionsprotokoll, das einen zweiten Lyseschritt, die Bindung der DNA an paramagnetische Partikel für die Bindung auf Zellulosebasis, Waschschritte und die DNA-Elution umfasst.

Zusammenfassung

Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) Gewebe stellen eine wertvolle Quelle für molekulare Analysen und klinische genomische Studien dar. Diese Gewebe sind oft arm an Zellen oder schwer zu verarbeiten. Daher müssen Nukleinsäuren sorgfältig isoliert werden. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur DNA-Isolierung für Gewebe aus vielen Krankheiten, vor allem Krebs, etabliert. Leider wird genomische DNA, die aus FFPE-Geweben extrahiert wird, aufgrund der Vernetzung zwischen Nukleinsäuresträngen und Proteinen sowie durch zufällige Brüche in der Sequenz stark abgebaut. Daher ist die DNA-Qualität dieser Proben deutlich reduziert, was sie zu einer Herausforderung für weitere molekulare Downstream-Analysen macht. Weitere Probleme bei schwierigen Geweben sind z.B. der Mangel an Zellen in verkalkten atherosklerotischen Läsionen und Fettgewebe des Menschen, kleine Hautbiopsien und folglich eine geringe Verfügbarkeit der gewünschten Nukleinsäuren, wie es auch in altem oder fixiertem Gewebe der Fall ist.

In unseren Laboren haben wir eine Methode zur DNA-Extraktion aus formalinfixierten atherosklerotischen Läsionen unter Verwendung eines halbautomatischen Isolationssystems etabliert. Wir verglichen diese Methode mit anderen kommerziell erhältlichen Extraktionsprotokollen und konzentrierten uns auf weitere nachgelagerte Analysen. Reinheit und Konzentration der DNA wurden mittels Spektrometrie und Fluorometrie gemessen. Bewertet wurden der Grad der Fragmentierung und die Gesamtqualität.

Die höchste DNA-Quantität und -Qualität wurde mit dem modifizierten Blut-DNA-Protokoll für das automatisierte Extraktionssystem anstelle des kommerziellen FFPE-Protokolls erreicht. Mit diesem Schritt-für-Schritt-Protokoll waren die DNA-Ausbeuten von FFPE-Proben im Durchschnitt viermal höher und weniger Proben bestanden den Extraktionsprozess, was bei Biopsien kleiner Gefäße von entscheidender Bedeutung ist. Amplikongrößen von 200–800 bp konnten mittels PCR nachgewiesen werden. Diese Studie zeigt, dass die aus unserem FFPE-Gewebe gewonnene DNA zwar stark fragmentiert ist, aber dennoch für eine erfolgreiche Amplifikation und Sequenzierung kürzerer Produkte verwendet werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die automatisierte Technologie in unseren Händen das beste System für die DNA-Extraktion zu sein scheint, insbesondere für kleine FFPE-Gewebeproben.

Einleitung

Die Formalinfixierung mit anschließender Paraffineinbettung (FFPE) ist ein Standardverfahren zur Langzeitkonservierung pathologischer Proben im Biobanking¹. Diese Proben stellen eine wertvolle Quelle für histologische Studien sowie molekulare Analysen, insbesondere genetische Studien,^{dar 2}. Weitere Vorteile von FFPE-Geweben sind eine bessere Langzeitlagerung, geringere Kosten und einfachere Lagerbedingungen. Unsere Absicht ist es, ein zuverlässiges und einfach zu handhabendes Protokoll für die reproduzierbare Nukleinsäureisolierung aus kleinen Mengen von FFPE-Schnitten bereitzustellen, da eine qualitativ hochwertige DNA-Extraktion der erste entscheidende Schritt in einer Vielzahl von molekularen Techniken ist und FFPE-Gewebe die am besten verfügbare Probenquelle sind.

Neue wissenschaftliche Ansätze, wie z. B. Next-Generation-Sequencing (NGS) und "Omics"-Forschungsansätze, erfordern eine hohe Qualität der Nukleinsäuren ^3,4,5. Die Extraktion von DNA aus FFPE-Gewebeproben ist nach wie vor eine Herausforderung. DNA aus FFPE-Proben kann je nach Alter und Fixierungsbedingungen in Qualität und Quantität stark variieren. Formalin, die am häufigsten verwendete Verbindung, führt zur DNA-Protein-Vernetzung ^6,7,8 und bewirkt einen unspezifischen zufälligen Bruch in der Nukleotidsequenz⁹. Dies kann sich erheblich auf nachgelagerte genomische Analysen auswirken, da die Vernetzung die Amplifikation der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) deaktivieren kann ^6,10. Aufgrund von Verunreinigungen während des Fixierungsprozesses ist die Reinheit der aus FFPE-Proben isolierten DNA oft eingeschränkt. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur DNA-Isolierung etabliert, meist aus Krebsgewebeproben 2,11,12,13.

Generell können Protokolle für die Extraktion von Nukleinsäuren aus FFPE-Gewebe in drei Hauptgruppen unterschieden werden. Die erste, am häufigsten verwendete Gruppe von Verfahren umfasst kommerziell erhältliche Säulensysteme auf Kieselsäurebasis¹⁴. Die zweite Gruppe umfasst manuelle Extraktionsmethoden in der organischen Phase mit Phenol und Chloroform, die erstmals von Joseph Sambrook und David W. Russell^{beschrieben wurden 15}. Als dritte Gruppe haben sich in den letzten Jahren automatisierte Systeme etabliert, wie z.B. Liquid-Handling-Systeme sowie paramagnetische partikelbasierte Systeme¹⁶. Jedes der drei genannten Systeme hat unterschiedliche Vor- und Nachteile, wie z. B. gefährliche Chemikalien (d. h. Xylol, Phenol, Chloroform), hohe Kosten¹⁷, Arbeitskraft¹⁸ und Zeitaufwand¹⁹. Insbesondere für die schwierigen Gewebeproben sowie Hochdurchsatzanalysen sind Standardisierung, Reproduzierbarkeit, relativ geringer Zeit-, Personal- und Kostenaufwand die wichtigsten Merkmale bei der Suche nach einem geeigneten Verfahren zur Nukleinsäureisolierung²⁰. Es ist bekannt, dass automatisierte Extraktionsmethoden bessere reproduzierbare Ergebnisse liefern und für kleine Biopsien empfindlicher sind. Darüber hinaus wird weniger Gewebe oder Blut benötigt und das Risiko einer Verstopfung des Systems durch hohe Mengen an Paraffin wird reduziert. Obwohl Maschinen zur automatisierten Nukleinsäureextraktion und die benötigten Kits im Vergleich zu manuellen Methoden teurer sind, überzeugen sie dennoch durch weniger problematische Extraktionsprozesse. Die Literaturrecherche bietet eine Vielzahl von Publikationen, die einen direkten Vergleich zwischen manuellen, säulenbasierten und automatisierten DNA- und RNA-Extraktionsmethoden aus verschiedenen Geweben und Organismen wie Pflanzen, Tieren und Menschen sowie Zellen in Kultur veranschaulichen 20,21,22. Es gibt auch Hinweise in der Literatur, die zeigen, dass DNA und RNA, die aus 10 Jahre altem schockgefrorenem Gewebe isoliert wurden, für nachgelagerte Analysen wie PCR, quantitative PCR, NGS, Methylierungsanalysen und Klonierung^verwendet werden können 9,23,24,25,26.

Das Hauptproblem bei z.B. gealtertem humanem Gefäßgewebe sowie kleinen Gewebebiopsien, insbesondere bei FFPE-Proben, ist der Mangel an Zellen in den stark verkalkten atherosklerotischen Läsionen, was folglich zu niedrigen Konzentrationen von Nukleinsäuren^{führt 1}. Obwohl mehrere Methoden zur DNA-Extraktion aus FFPE-Gewebe bereits etabliert und weit verbreitet sind, erfordern die manuellen Probenvorbereitungsmethoden eine lange praktische Zeit²⁷ und toxische Reagenzien wie Xylol oder Phenol sind für die Entparaffinisierung erforderlich². Wie beschrieben, ist der Entparaffinierungsprozess ein entscheidender, zeitaufwändiger Schritt (z. B. etwa 30 Minuten), der die Qualität und Quantität der extrahierten DNA deutlich beeinflusst (z. B. toxische Wirkungen auf die DNA, wie z. B. Fragmentierung und Abbau der Entparaffinierungslösung und hohe Temperaturen)²⁸. Kürzlich entwickelte neue DNA-Extraktionsprotokolle konzentrieren sich auf die Verwendung anderer ungiftiger Entparaffinierungslösungen, Reparaturstrategien und automatisierter Bead-Technologien. Insbesondere hat sich gezeigt, dass automatisierte und halbautomatische Methoden bei der DNA-Extraktion erfolgreich sind, da sie eine effiziente Rückgewinnung, keine Kreuzkontamination und eine einfache Leistung aufweisen²⁹. Wir haben ein Protokoll etabliert, das diese Einschränkungen überwindet. Dadurch ermöglicht unsere Technik eine Reduzierung der Bearbeitungs- und Hands-on-Zeit bei höchsten quantitativen und qualitativen Standards.

Insbesondere bei reproduzierbaren Hochdurchsatzanalysen wie Genotypisierung, epigenomischen Studien und RNA-Sequenzierung ist die Handhabung von FFPE-Proben mit säulenbasierten Aufreinigungssystemen oft schwierig und zeitaufwändig (z. B. lange Entparaffinisierungsschritte, Säulenverstopfung und lange Hands-on-Zeiten). Das Hauptproblem ist die Verstopfung der Kieselsäuremembranen durch den hohen Paraffingehalt. Weitere Umstände, die die Isolierung von hochwertigen Nukleinsäuren verschlechtern können, sind kleine Gewebemengen wie Mikrobiopsien der Haut, kleines Mausgewebe, sehr fettiges oder verkalktes Gewebe wie Plaques, verknöchertes Gewebe und gealterte Proben. Insbesondere in der Diagnose und Forensik sind automatisierte und halbautomatische Systeme wie Liquid Handling oder paramagnetische partikelbasierte Extraktionsmethoden in den letzten Jahren immer wichtiger geworden^30,31, vor allem aufgrund der relativ geringen Hands-on-Zeiten und der Möglichkeit der Standardisierung. Die meisten der bereits veröffentlichten Protokolle eignen sich perfekt für glatte Gewebe mit hohen oder mittleren Zellmengen, wie z. B. Tumorbiopsien oder Pflanzengewebe 13,22,32. Die Literatur über Methoden für halbautomatische partikelbasierte Methoden, die zur Isolierung von DNA aus relativ schwer zu handhabendem Gewebe wie fixierten Einzelzellen, verkalkten Gefäßen, kollagenreichem Gewebe und Fettgewebe mit geringer Zellzahl verwendet werden, ist nur unzureichend beschrieben³³.

In dieser Arbeit wird eine optimierte halbautomatische Methode zur DNA-Isolierung aus vaskulären Paraffin-eingebetteten Schnitten beschrieben und mit zwei manuellen säulenbasierten Protokollen verglichen. Für die Validierung wurden die DNA-Menge, die Reinheit und das Ausmaß der Fragmentierung verwendet. Als Ausgangspunkt diente das kommerziell erhältliche Blut-DNA-Protokoll, und die manuellen Schritte des halbautomatischen Systems wurden anschließend für die Verwendung von FFPE sowie frischen gefrorenen Gewebeproben aus menschlichem und tierischem Gewebe optimiert, wobei Schritte aus dem FFPE- und dem Gewebeprotokoll kombiniert wurden. Der automatisierte Schritt dieses Protokolls ist auf dem Gerät vorinstalliert und hängt vom verwendeten Kit (hier dem Blut-DNA-Kit) ab. Mit dem beschriebenen halbautomatischen kartuschenbasierten System ist es möglich, DNA aus Blut, frisch gefrorenem Gewebe, formalinfixiertem Gewebe und sogar einzelnen Zellen mit dem gleichen Protokoll, der gleichen Maschine, dem gleichen Kit und den gleichen Verbrauchsmaterialien zu isolieren, anstatt verschiedene Protokolle und Kits für das Instrument zu verwenden, wie es vom Unternehmen empfohlen wird. Es gibt nur geringfügige Unterschiede in den Protokollen, wie z.B. einen Puffer und einige Inkubationszeiten für die verschiedenen Anwendungen, was dieses Protokoll sehr nützlich für die Extraktion von DNA aus allen Arten von Geweben macht. Unser Protokoll ist in erster Linie für verkalktes, zellarmes und fibröses menschliches Gefäßgewebe optimiert, kann aber natürlich für alle Arten von schwierigen Geweben, die oben erwähnt wurden, verwendet und weiter optimiert werden.

Zusammengefasst bieten wir Forschern im kardiovaskulären Bereich, die sich mit Atherosklerose (z. B. Aorta, Halsschlagadern, Koronararterien) befassen, ein einfach zu bedienendes Punkt-für-Punkt-Protokoll für die halbautomatische DNA-Extraktion aus vaskulären FFPE-Proben.

Protokoll

Die Erlaubnis zur Entnahme von atherosklerotischen Proben der menschlichen Halsschlagader in unserer Biobank wurde von der örtlichen Ethikkommission des Krankenhauses (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, München, Deutschland) genehmigt. Von allen Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

1. Vorbereitung des Gewebes

1. Bereiten Sie 5–8 Gewebeschnitte von 10 μm aus der FFPE-Probe mit dem Mikrotom vor und übertragen Sie es in ein 1,5-ml-Röhrchen. Es ist nicht notwendig, den Überschuss an Paraffin aus dem Block zu reduzieren.
   HINWEIS: Dünnere Einzelabschnitte anstelle eines großen Abschnitts beschleunigen die Pufferreaktion. Die ersten Abschnitte wegen O_2-Exposition verwerfen. Bei größeren Proben ist es auch möglich, weniger Schnitte zu verwenden.
2. Zentrifugieren Sie diese Röhrchen in einer Tischzentrifuge mit einer Temperatur von 5.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur, um jede Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.
   ACHTUNG: Eine zu lange Zentrifugation führt zur Gerinnung der Probe und erschwert die Lyse.

2. Lipidauflösung und Entparaffinisierung

HINWEIS:Dieser Schritt ist für die Entparaffinisierung und den Lipidaufschluss erforderlich. Der verwendete Puffer ist weniger toxisch als kommerzielle Entparaffinierungslösungen.

1. Geben Sie 300 μl des handelsüblichen Inkubationspuffers und 6 μl 1-Thioglycerin in jedes Röhrchen.
   HINWEIS: Verwenden Sie nicht mehr als 300 μl, da dies das maximale Volumen der Patrone des Automatisierungssystems ist.
2. 10 s vortexen und die Probe 10 min bei 80 °C und 500 U/min in einem Heizblock inkubieren, um Paraffin zu lösen.
   ACHTUNG: Das Gewebe sollte sich am Ende vollständig aufgelöst haben. Falls erforderlich, während der Inkubation mehrmals vortexen.

3. Proben- und Proteinverdauung

HINWEIS: Der native Verdau mit Protease K ist entscheidend, um saubere DNA-Extrakte ohne Proteine zu erhalten. Es reduziert auch alle vorhandenen kontaminierenden Proteine. Darüber hinaus werden auch Nukleasen zerstört, um die DNA^{zu retten 34}. Dieser Schritt über Nacht ist auch für den vollständigen Probenaufschluss erforderlich.

1. Lassen Sie die Probe auf 60 °C abkühlen und fügen Sie dann 30 μl der mitgelieferten Proteinase K-Lösung hinzu.
2. Erneut vortexen und die Mischung bei 65 °C und 500 U/min über Nacht (4–20 h) in einem Heizblock inkubieren. Während der Inkubation werden die Proben von Zeit zu Zeit vortext, um einen vollständigen Probenaufschluss zu erzielen.
   HINWEIS: Die Inkubation über Nacht führt zu besseren Ergebnissen. Mischschritte werden alle 30–60 Minuten empfohlen. Am Ende sollte sich kein sichtbares Gewebestück im Inneren des Röhrchens befinden.

4. Zelllyse

1. Geben Sie 400 μl des Lysepuffers, der im Blutkit enthalten ist, hinzu und wirbeln Sie ihn in Kürze ein.
2. Die Probe erneut bei 65 °C für 30 min mit 500 U/min inkubieren.
3. Lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur abkühlen. Das Paraffin härtet oben aus.
   ACHTUNG: Nicht erneut vortexen, um das Paraffin von der Probe getrennt zu halten. Andernfalls wird das Paraffin mit dem Gewebe vermischt, wodurch die Probe zerstört wird. Die Probe wird in Schritt 6.1 entnommen.

5. Vorbereitung der vordosierten Kartuschen

1. Schalten Sie das Gerät und den zugehörigen Tablet-Computer ein.
2. Starten Sie die Software-App und klicken Sie auf die Tür-Taste, um das Instrument zu öffnen.
3. Entfernen Sie das Gestell vom Gerät und setzen Sie die vorgefüllte Kartusche in das Sondengestell ein. Stellen Sie sicher, dass die Kartusche beim Einrasten zweimal einrastet und entfernen Sie die Siegelfolie.
4. Setzen Sie den Kolben in die letzte (8) Vertiefung der Kartusche ein. Er dient als Pipettenspitze im Instrument.
5. Füllen Sie die mitgelieferten 0,5 mL Elutionsröhrchen mit 65 μl Elutionspuffer, die mit dem Kit geliefert werden. Lassen Sie die Röhrchen offen und setzen Sie sie in die dafür vorgesehene Position im vorderen Teil des Racks nach der Kartusche ein.
   HINWEIS: Das Mindestvolumen für die Elution beträgt 60 μL. Das System verliert 5–10 μl des hinzugefügten Elutionsvolumens.

6. Automatisierte DNA-Extraktion

1. Durchstechen Sie vorsichtig das Paraffin auf dem 1,5-ml-Röhrchen aus Schritt 4.3, um an die saubere Probe am Boden des Röhrchens zu gelangen, ohne es erneut mit Paraffin zu vermischen.
2. Die gesamte Mischung (730 μl) der vorbereiteten Probe wird in die erste Vertiefung der Patrone übertragen.
3. Setzen Sie das Gestell in die automatisierte DNA-Extraktionsmaschine ein. Stellen Sie sicher, dass das Gestell zuerst hinten und danach vorne einrastet.
4. Starten Sie den Lauf, indem Sie in der Software auf die orangefarbene Schaltfläche Start oben links klicken. Es öffnet sich ein Fenster mit verschiedenen vorinstallierten Protokollen. Wählen Sie Blut-DNA-Protokoll auf dem Instrument. Bestätigen Sie, dass der Kolben, das Elutionsrohr und die Probe hinzugefügt wurden, indem Sie in der Software auf Ja klicken. Die Klappe des Instruments schließt sich automatisch und der Lauf beginnt (das Licht leuchtet grün). Die Fahrt dauert ca. 38 Minuten. Es ist keine weitere Kalibrierung erforderlich.
   HINWEIS: Beobachten Sie, bis das System die Kolben für alle Proben im Rack aufgenommen hat. Ist dies nicht der Fall, stoppt das System automatisch und das Maschinenprotokoll muss neu gestartet werden.
5. Stellen Sie sicher, dass das System den automatisierten Lyseschritt in der ersten Vertiefung der Kartusche durchführt, gefolgt von den Waschschritten in den Vertiefungen 3 bis 7. Es ist kein weiterer Programmierschritt erforderlich. Das komplette Programm wird von der Firma vorinstalliert.
6. Stellen Sie anschließend sicher, dass das System die DNA in den vorbereiteten Elutionsröhrchen über den hinzugefügten Kolben eluiert. Die magnetischen Partikel bleiben im Kolben. Der Kolben geht am Ende zurück in die letzte Vertiefung der Patrone.

7. Beende den Lauf

1. Wenn der Lauf abgeschlossen ist (das Gerät blinkt grün), öffnen Sie das Instrument, indem Sie auf die Schaltfläche zum Öffnen (Türschild) klicken, und entfernen Sie das Gestell aus dem System.
2. Entsorgen Sie die Patronen.
3. Setzen Sie das leere Gestell wieder in das Instrument ein und schließen Sie die Tür über den Türknopf in der oberen rechten Ecke. Schließen Sie die Software-App und schalten Sie das Gerät sowie den Tablet-Computer aus.
4. Lagern Sie die Eluate bei -20 °C für die Langzeitlagerung oder bei 4 °C für die Kurzzeitlagerung oder verwenden Sie sie direkt für nachgelagerte Analysen oder Konzentrationsmessungen.

Ergebnisse

Für die Erstellung des Protokolls wurden 5 FFPE-Gewebeblöcke von Patienten mit Arteriosklerose der Halsschlagader verwendet. Die DNA wurde sowohl mit einem optimierten halbautomatischen Protokoll (Kit C) als auch mit zwei kommerziell erhältlichen manuellen säulenbasierten Protokollen (Kit A und Kit B, siehe Materialtabelle) isoliert. Die DNA-Extraktion mit Kit A und B wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die einzige Änderung, die im Protokoll d...

Diskussion

DNA-Extraktionsmethoden für FFPE-Gewebe variieren in Qualität und Quantität der isolierten DNA, was sich zwangsläufig auf die Leistung weiterer nachgelagerter Analysen auswirkt. Daher wird die Automatisierung immer wichtiger, um den Workflow und die Standardisierung sowie das Qualitätsmanagement zu verbessern. Daher wurde in der vorliegenden Studie eine halbautomatische Methode zur DNA-Extraktion aus FFPE-Proben evaluiert, die bessere Ergebnisse als die anderen getesteten manuellen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes for sample incubation	Eppendorf, Hamburg, Germany	30120086
1-Thioglycerol	Promega, Walldorf, Germany	A208
Agilent tape station software 3.2	Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS Kit	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q32851
FFPE DNA Purification Kits (Kit A)	Norgene Biotek, Heidelberg, Germany	47400
FFPE tissue samples n=5	Munich Vascular Biobank,Munich, Germany
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)	Qiagen, Hilden, Germany	180134
Heating blocks, set to 80°C and 65°C	VWR,Darmstadt,Germany	460-0250
High Sensitivity D5000 reagents	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5593
High Sensitivity D5000 ScreenTape	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5592
Incubation Buffer	Promega, Walldorf, Germany	D920
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase K	Promega, Walldorf, Germany	AS1400
Maxwell RSC 48 Instrument	Promega, Walldorf, Germany	AS8500
Microcentrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c Spectrometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	ND-2000C
Optical caps	Agilent, Waldbronn, Germany	401425
Optical tube strips	Agilent, Waldbronn, Germany	401428
Pipettors and pipette tips	Eppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 for statistics, version 6.01	GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q33216
TapeStation 4200	Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan, Männedorf, Swizerland	IN-MNANO