Extração de DNA otimizada de alta qualidade de lesões ateroscleróticas humanas fixadas em formalina e embebidas em parafina

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para extração semiautomatizada de DNA de lesões fixadas em formalina e embebidas em parafina de artérias carótidas humanas. A lise tecidual é realizada sem xileno tóxico, que é seguido por um protocolo automatizado de extração de DNA, incluindo uma segunda etapa de lise, ligação de DNA a partículas paramagnéticas para ligação à base de celulose, etapas de lavagem e eluição de DNA.

Resumo

Os tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) representam uma fonte valiosa para análises moleculares e estudos genômicos clínicos. Esses tecidos geralmente são pobres em células ou difíceis de processar. Portanto, os ácidos nucléicos precisam ser cuidadosamente isolados. Nos últimos anos, vários métodos de isolamento de DNA foram estabelecidos para tecidos de muitas doenças, principalmente câncer. Infelizmente, o DNA genômico extraído dos tecidos FFPE é altamente degradado devido à reticulação entre as fitas de ácidos nucléicos e proteínas, bem como quebras aleatórias na sequência. Portanto, a qualidade do DNA dessas amostras é acentuadamente reduzida, tornando-se um desafio para outras análises moleculares a jusante. Outros problemas com tecidos difíceis são, por exemplo, a falta de células em lesões ateroscleróticas humanas calcificadas e tecido adiposo, pequenas biópsias de pele e, consequentemente, baixa disponibilidade dos ácidos nucléicos desejados, como também é o caso em tecidos velhos ou fixos.

Em nossos laboratórios, estabelecemos um método para extração de DNA de lesões ateroscleróticas fixadas em formalina, usando um sistema de isolamento semi-automatizado. Comparamos esse método com outros protocolos de extração disponíveis comercialmente e nos concentramos em outras análises a jusante. A pureza e a concentração do DNA foram medidas por espectrometria e fluorometria. O grau de fragmentação e a qualidade geral foram avaliados.

A maior quantidade e qualidade de DNA foi obtida com o protocolo de DNA sanguíneo modificado para o sistema de extração automatizado, em vez do protocolo FFPE comercial. Com este protocolo passo a passo, os rendimentos de DNA das amostras FFPE foram em média quatro vezes maiores e menos amostras falharam no processo de extração, o que é crítico quando se trata de biópsias de pequenos vasos. Tamanhos de amplicon de 200 a 800 pb podem ser detectados por PCR. Este estudo mostra que, embora o DNA obtido de nosso tecido FFPE seja altamente fragmentado, ele ainda pode ser usado para amplificação e sequenciamento bem-sucedidos de produtos mais curtos. Em conclusão, em nossas mãos, a tecnologia automatizada parece ser o melhor sistema para extração de DNA, especialmente para pequenas amostras de tecido FFPE.

Introdução

A fixação em formalina seguida de inclusão em parafina (FFPE) é um procedimento padrão para preservação a longo prazo de espécimes patológicos em biobancos¹. Essas amostras fornecem uma fonte valiosa para estudos histológicos, bem como análises moleculares, especialmente estudos genéticos². Outras vantagens dos tecidos FFPE são melhor armazenamento a longo prazo, custos mais baixos e condições de armazenamento mais fáceis. Nossa intenção aqui é fornecer um protocolo confiável e fácil de usar para isolamento de ácido nucleico reprodutível a partir de pequenas quantidades de seções FFPE, uma vez que a extração de DNA de alta qualidade é o primeiro passo crucial em uma ampla gama de técnicas moleculares e os tecidos FFPE são a fonte mais disponível de amostras.

Novas abordagens científicas, como sequenciamento de próxima geração (NGS) e abordagens de pesquisa "ômicas", requerem alta qualidade dos ácidos nucléicos ^3,4,5. A extração de DNA de amostras de tecido FFPE continua sendo um empreendimento desafiador. O DNA das amostras FFPE pode variar amplamente em qualidade e quantidade, dependendo de sua idade e condições de fixação. A formalina, o composto mais usado, leva à reticulação DNA-proteína ^6,7,8 e causa quebra aleatória inespecífica na sequência de nucleotídeos⁹. Isso pode afetar significativamente as análises genômicas a jusante, uma vez que a reticulação pode desativar a amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) ^6,10. Devido a contaminantes durante o processo de fixação, a pureza do DNA isolado de amostras FFPE é frequentemente limitada. Nos últimos anos, vários métodos de isolamento de DNA foram estabelecidos, principalmente a partir de amostras de tecido cancerígeno 2,11,12,13.

Em geral, os protocolos para a extração de ácidos nucléicos do tecido FFPE podem ser diferenciados em três grupos principais. O primeiro grupo de métodos mais comumente usado inclui sistemas de coluna à base de sílica disponíveis comercialmente¹⁴. O segundo grupo envolve métodos manuais de extração em fase orgânica com fenol e clorofórmio, descritos pela primeira vez por Joseph Sambrook e David W. Russell¹⁵. Como um terceiro grupo, sistemas automatizados foram estabelecidos nos últimos anos, como sistemas de manuseio de líquidos, bem como sistemas baseados em partículas paramagnéticas¹⁶. Cada um dos três sistemas nomeados possui diferentes vantagens e desvantagens, como produtos químicos perigosos (ou seja, xileno, fenol, clorofórmio), altos custos¹⁷, mão de obra¹⁸ e consumo de tempo¹⁹. Especialmente, para a amostra de tecido difícil, bem como análises de alto rendimento, padronização, reprodutibilidade, consumo de tempo, mão de obra e custos relativamente baixos são as características mais relevantes para encontrar um método adequado para isolamento de ácido nucleico²⁰. Sabe-se que os métodos de extração automatizados apresentam melhores resultados reprodutíveis e são mais sensíveis para pequenas biópsias. Além disso, é necessária menos quantidade de tecido ou sangue e o risco de entupimento do sistema devido a grandes quantidades de parafina é reduzido. Embora as máquinas para extração automatizada de ácido nucleico e os kits necessários sejam mais caros em comparação com os métodos manuais, eles ainda são convincentes devido aos processos de extração menos problemáticos. A pesquisa bibliográfica fornece muitas publicações que ilustram uma comparação direta entre métodos de extração manual, baseada em coluna e automatizada de DNA e RNA de diferentes tecidos e organismos, como plantas, animais e humanos, bem como células em cultura 20,21,22. Também há evidências presentes na literatura que mostram que DNA e RNA isolados de tecido congelado de 10 anos podem ser usados para análises a jusante, como PCR, PCR quantitativo, NGS, análises de metilação e clonagem 9,23,24,25,26.

O grande problema, por exemplo, com o tecido vascular humano envelhecido, bem como com as biópsias de pequenos tecidos, especialmente em amostras de FFPE, é a falta de células nas lesões ateroscleróticas altamente calcificadas, o que, consequentemente, leva a baixas concentrações de ácidos nucléicos¹. Embora vários métodos de extração de DNA do tecido FFPE já tenham sido estabelecidos e sejam amplamente utilizados, os métodos manuais de preparo de amostras requerem um longo tempo de prática²⁷ e reagentes tóxicos como xileno ou fenol são necessários para a desparafinização². Conforme descrito, o processo de desparafinização é uma etapa crucial demorada (por exemplo, cerca de 30 min) que afeta marcadamente a qualidade e a quantidade do DNA extraído (por exemplo, efeitos tóxicos no DNA, como fragmentação e degradação da solução de desparafinização e altas temperaturas) ²⁸ . Novos protocolos de extração de DNA desenvolvidos recentemente se concentram no uso de outras soluções de desparafinização não tóxicas, estratégias de reparo e tecnologias automatizadas de grânulos. Em particular, métodos automatizados e semiautomatizados demonstraram ser bem-sucedidos na extração de DNA com recuperação eficiente, ausência de contaminação cruzada e fácil desempenho²⁹. Estabelecemos um protocolo que supera essas limitações. Como resultado, nossa técnica permite uma redução do tempo de processamento e prática nos mais altos padrões quantitativos e qualitativos.

Especialmente para análises reprodutíveis de alto rendimento, como genotipagem, estudos epigenômicos e sequenciamento de RNA, o manuseio de amostras FFPE com sistemas de purificação baseados em coluna é muitas vezes difícil e demorado (por exemplo, longas etapas de desparafinização, entupimento de coluna e longos tempos práticos). O entupimento das membranas de sílica devido à alta quantidade de parafina é o principal problema. Outras circunstâncias que podem piorar o isolamento de ácidos nucléicos de alta qualidade são pequenas quantidades de tecido, como microbiópsias de pele, tecido de camundongo pequeno, tecido muito gorduroso ou calcificado como placas, tecido ossificado e amostras envelhecidas. Especialmente no diagnóstico e na perícia, sistemas automatizados e semiautomatizados, como manuseio de líquidos ou métodos de extração baseados em partículas paramagnéticas, tornaram-se cada vez mais essenciais nos últimos anos^30,31, principalmente devido aos tempos de prática relativamente baixos e à possibilidade de padronização. A maioria dos protocolos já publicados funciona perfeitamente para tecidos lisos com quantidades altas ou médias de células, como biópsias tumorais ou tecido vegetal 13,22,32. A literatura sobre métodos semiautomatizados baseados em partículas usados para isolar DNA de tecidos relativamente difíceis de manusear, como células únicas fixas, vasos calcificados, tecido rico em colágeno e tecido adiposo com baixo número de células, é mal descrita³³.

Neste estudo, é descrito um método semiautomatizado otimizado para isolamento de DNA de seções embebidas em parafina vascular, comparando-o a dois protocolos manuais baseados em colunas. A quantidade de DNA, a pureza e a extensão da fragmentação foram usadas para validação. O protocolo de DNA sanguíneo disponível comercialmente foi usado como ponto de partida e as etapas manuais do sistema semiautomatizado foram posteriormente otimizadas para o uso de FFPE, bem como amostras de tecido fresco congelado de tecido humano e animal, combinando etapas do FFPE e do protocolo de tecido. A etapa automatizada deste protocolo é pré-instalada no instrumento e depende do kit usado (aqui, o kit de DNA sanguíneo). Com o sistema semiautomatizado baseado em cartucho descrito é possível isolar DNA de sangue, tecido fresco congelado, tecido fixado em formalina e até células individuais com o mesmo protocolo, máquina, kit e consumíveis, em vez de usar protocolos e kits diferentes para o instrumento, como é recomendado pela empresa. Existem apenas pequenas diferenças nos protocolos, como um tampão e alguns tempos de incubação para as diferentes aplicações, o que torna este protocolo muito útil para extrair DNA de todos os tipos de tecidos. Nosso protocolo é otimizado principalmente para tecido vascular humano calcificado, pobre em células e fibroso, mas pode, é claro, ser usado e otimizado para todos os tipos de tecidos difíceis mencionados acima.

Resumindo, para pesquisadores da área cardiovascular que trabalham com aterosclerose (por exemplo, aorta, artérias carótidas, artérias coronárias), fornecemos um protocolo ponto a ponto fácil de usar para extração semiautomatizada de DNA de amostras vasculares de FFPE.

Protocolo

A permissão para coletar amostras ateroscleróticas de carótidas humanas em nosso biobanco foi aprovada pelo Comitê de Ética do Hospital local (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Munique, Alemanha). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. Os experimentos foram realizados de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque.

1. Preparação de tecidos

1. Prepare 5 a 8 seções de tecido de 10 μm da amostra FFPE com o micrótomo e transfira-o em um tubo de 1,5 mL. Não é necessário reduzir o excesso de parafina do bloco.
   NOTA: Seções individuais mais finas em vez de uma seção grande aceleram a reação do buffer. Descarte as primeiras seções devido à exposição de O₂ . Para amostras maiores, também é possível usar menos seções.
2. Centrifugue esses tubos em uma centrífuga de bancada, ajustada para 5.000 x g por 1 min em temperatura ambiente para coletar cada sample no fundo do tubo.
   CUIDADO: A centrifugação muito longa leva à coagulação da amostra e complica a lise.

2. Dissolução lipídica e desparafinização

NOTA: Esta etapa é necessária para a desparafinização e digestão lipídica. O tampão usado é menos tóxico do que as soluções comerciais de desparafinização.

1. Adicione 300 μL do tampão de incubação disponível comercialmente e 6 μL de 1-tioglicerol a cada tubo.
   NOTA: Não use mais de 300 μL, pois este é o volume máximo do cartucho do sistema de automação.
2. Vortex por 10 s e incubar a amostra por 10 min a 80 °C e 500 rpm em um bloco de aquecimento para solubilizar a parafina.
   CUIDADO: O tecido deve ser completamente dissolvido no final. Se necessário, vórtice várias vezes durante a incubação.

3. Digestão de amostras e proteínas

NOTA: A digestão nativa com protease K é crucial para ter extratos de DNA limpos e sem proteínas. Também reduz quaisquer proteínas contaminantes presentes. Além disso, as nucleases também são destruídas para salvar o DNA³⁴. Esta etapa noturna também é necessária para a digestão completa da amostra.

1. Deixe a amostra esfriar até 60 ° C e, em seguida, adicione 30 μL da solução de proteinase K fornecida.
2. Vortex novamente e incubar a mistura a 65 °C e 500 rpm durante a noite (4–20 h) em um bloco de aquecimento. Vortex as amostras durante a incubação de tempos em tempos para uma digestão completa da amostra.
   NOTA: A incubação durante a noite leva a melhores resultados. As etapas de mistura são recomendadas a cada 30–60 min. No final, não deve haver nenhum pedaço de tecido visual dentro do tubo.

4. Lise celular

1. Adicione 400 μL do tampão de lise, fornecido no kit de sangue e no vórtice em breve.
2. Incubar novamente a amostra a 65 °C durante 30 min a 500 rpm.
3. Deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente. A parafina vai endurecer por cima.
   CUIDADO: Não vórtice novamente, para manter a parafina separada da amostra. Caso contrário, a parafina é misturada com o tecido, o que destrói a amostra. A amostra será coletada na etapa 6.1.

5. Preparação dos cartuchos pré-dispensados

1. Ligue a máquina, bem como o tablet associado.
2. Inicie o aplicativo de software e clique no botão Porta para abrir o instrumento.
3. Remova o rack do instrumento e insira o cartucho pré-cheio no suporte da sonda. Certifique-se de que o cartucho se encaixe duas vezes quando estiver no lugar e remova a película de vedação.
4. Adicione o êmbolo no último (8) poço do cartucho. Serve como ponta de pipeta no instrumento.
5. Encha os tubos de eluição de 0,5 mL fornecidos com 65 μL de tampão de eluição, fornecidos com o kit. Deixe os tubos abertos e insira-os na posição dedicada na parte frontal do rack, após o cartucho.
   NOTA: O volume mínimo para eluição é de 60 μL. O sistema perderá de 5 a 10 μL do volume de eluição adicionado.

6. Extração automatizada de DNA

1. Perfure cuidadosamente a parafina na parte superior do tubo de 1,5 mL da etapa 4.3 para alcançar a amostra limpa na parte inferior do tubo sem misturá-la com parafina novamente.
2. Transferir toda a mistura (730 μL) da amostra preparada para o primeiro alvéolo do cartucho.
3. Insira o rack na máquina automatizada de extração de DNA. Certifique-se de que o rack trave primeiro na parte traseira da máquina e depois na frente.
4. Inicie a execução clicando no botão laranja superior esquerdo Iniciar no software. Uma janela com diferentes protocolos pré-instalados será aberta. Selecione Protocolo de DNA de sangue no instrumento. Confirme se o êmbolo, o tubo de eluição e a amostra foram adicionados clicando em sim no software. A porta do instrumento fechará automaticamente e a corrida começará (a luz ficará verde). A corrida levará aproximadamente 38 min. Nenhuma calibração adicional é necessária.
   NOTA: Observe até que o sistema tenha coletado os êmbolos para todas as amostras no rack. Se isso não estiver acontecendo, o sistema para automaticamente e o protocolo da máquina deve ser reiniciado.
5. Certifique-se de que o sistema execute a etapa de lise automatizada no primeiro poço do cartucho, seguida pelas etapas de lavagem nos poços 3 a 7. Não há mais nenhuma etapa de programação necessária. O programa completo é pré-instalado pela empresa.
6. Uma vez feito isso, certifique-se de que o sistema elui o DNA nos tubos de eluição preparados por meio do êmbolo adicionado. As partículas magnéticas permanecem no êmbolo. O êmbolo no final volta para o último poço do cartucho.

7. Termine a corrida

1. Quando a execução estiver concluída (a máquina mostra uma luz verde piscando), abra o instrumento clicando no botão de abertura (sinal de porta) e remova o rack do sistema.
2. Descarte os cartuchos.
3. Reinsira o rack vazio no instrumento e feche a porta através do botão da porta no canto superior direito. Feche o aplicativo de software e desligue a máquina, bem como o tablet.
4. Armazene os eluatos a -20 °C para armazenamento de longo prazo ou a 4 °C para armazenamento de curto prazo ou use-os diretamente para análises a jusante ou medições de concentração.

Resultados

Para o estabelecimento do protocolo, foram utilizados 5 blocos teciduais FFPE de pacientes com aterosclerose da artéria carótida. O DNA foi isolado com um protocolo semiautomatizado otimizado (kit C), bem como com dois protocolos manuais baseados em coluna disponíveis comercialmente (kit A e kit B, consulte a Tabela de Materiais). A extração de DNA com kit A e B foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. A única alteração feita no protocolo dos dois k...

Discussão

Os métodos de extração de DNA para tecido FFPE variam em qualidade e quantidade de DNA isolado, o que inevitavelmente afeta o desempenho de outras análises a jusante. Assim, a automação está se tornando imperativa para melhorar o fluxo de trabalho e a padronização, bem como a gestão da qualidade. Portanto, no presente estudo, um método semiautomatizado para extração de DNA de amostras FFPE foi avaliado, demonstrando melhores resultados do que os outros protocolos manuais bas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes for sample incubation	Eppendorf, Hamburg, Germany	30120086
1-Thioglycerol	Promega, Walldorf, Germany	A208
Agilent tape station software 3.2	Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS Kit	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q32851
FFPE DNA Purification Kits (Kit A)	Norgene Biotek, Heidelberg, Germany	47400
FFPE tissue samples n=5	Munich Vascular Biobank,Munich, Germany
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)	Qiagen, Hilden, Germany	180134
Heating blocks, set to 80°C and 65°C	VWR,Darmstadt,Germany	460-0250
High Sensitivity D5000 reagents	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5593
High Sensitivity D5000 ScreenTape	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5592
Incubation Buffer	Promega, Walldorf, Germany	D920
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase K	Promega, Walldorf, Germany	AS1400
Maxwell RSC 48 Instrument	Promega, Walldorf, Germany	AS8500
Microcentrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c Spectrometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	ND-2000C
Optical caps	Agilent, Waldbronn, Germany	401425
Optical tube strips	Agilent, Waldbronn, Germany	401428
Pipettors and pipette tips	Eppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 for statistics, version 6.01	GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q33216
TapeStation 4200	Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan, Männedorf, Swizerland	IN-MNANO