포르말린 고정 파라핀 함유 인간 죽상경화성 병변에서 최적화된 고품질 DNA 추출

요약

여기에서는 인간 경동맥의 포르말린 고정 파라핀 삽입 병변에서 반자동 DNA 추출을 위한 프로토콜을 제시합니다. 조직 용해는 독성 자일렌 없이 수행되며, 그 후 두 번째 용해 단계, 셀룰로오스 기반 결합을 위한 상자성 입자에 DNA의 결합, 세척 단계 및 DNA 용출을 포함한 자동화된 DNA 추출 프로토콜이 수행됩니다.

초록

포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직은 분자 분석 및 임상 유전체 연구를 위한 귀중한 소스입니다. 이러한 조직은 종종 세포가 부족하거나 처리하기 어렵습니다. 따라서 핵산을 조심스럽게 분리해야 합니다. 최근 몇 년 동안 많은 질병, 주로 암의 조직에 대해 DNA를 분리하는 다양한 방법이 확립되었습니다. 불행히도 FFPE 조직에서 추출한 게놈 DNA는 핵산 가닥과 단백질 사이의 가교 결합과 순차적의 무작위 절단으로 인해 심하게 분해됩니다. 따라서 이러한 샘플의 DNA 품질이 현저히 저하되어 추가 분자 다운스트림 분석이 어려워집니다. 어려운 조직과 관련된 다른 문제는, 예를 들어, 석회화된 인간 죽상경화성 병변 및 지방 조직에 세포가 부족하고, 작은 피부 생검이 수행되며, 결과적으로 오래된 조직이나 고정된 조직에서와 같이 원하는 핵산의 가용성이 낮다는 것입니다.

저희 실험실에서는 반자동 분리 시스템을 사용하여 포르말린 고정 죽상경화성 병변에서 DNA를 추출하는 방법을 확립했습니다. 우리는 이 방법을 상업적으로 이용 가능한 다른 추출 프로토콜과 비교하고 추가 다운스트림 분석에 중점을 두었습니다. DNA의 순도와 농도는 분광법과 형광측정법으로 측정하였다. 단편화의 정도와 전반적인 품질을 평가했습니다.

가장 높은 DNA의 양과 질은 상용 FFPE 프로토콜 대신 자동 추출 시스템을 위한 변형된 혈액 DNA 프로토콜로 얻어졌습니다. 이 단계별 프로토콜을 통해 FFPE 샘플의 DNA 수율은 평균 4배 더 높았고 추출 과정에 실패한 샘플은 더 적었으며, 이는 소형 혈관 생검을 처리할 때 매우 중요합니다. 200–800 bp의 앰플리콘 크기는 PCR로 검출할 수 있습니다. 이 연구는 FFPE 조직에서 얻은 DNA가 고도로 단편화되어 있지만 여전히 짧은 제품의 성공적인 증폭 및 염기서열분석에 사용할 수 있음을 보여줍니다. 결론적으로, 자동화 기술은 특히 작은 FFPE 조직 표본의 경우 DNA 추출을 위한 최고의 시스템인 것으로 보입니다.

서문

포르말린 고정 후 파라핀 포매(FFPE)는 바이오뱅킹¹에서 병리학적 표본을 장기간 보존하기 위한 표준 절차입니다. 이러한 샘플은 조직학적 연구와 분자 분석, 특히 유전자 연구를 위한 귀중한 출처를 제공합니다². FFPE 조직의 또 다른 장점은 더 나은 장기 보관, 더 낮은 비용 및 더 쉬운 보관 조건입니다. 고품질 DNA 추출은 광범위한 분자 기술에서 첫 번째 중요한 단계이고 FFPE 조직이 가장 사용 가능한 샘플 공급원이기 때문에 당사의 의도는 소량의 FFPE 절편에서 재현성 있는 핵산 분리를 위한 신뢰할 수 있고 사용하기 쉬운 프로토콜을 제공하는 것입니다.

차세대 염기서열분석(NGS) 및 "오믹스(omics)" 연구 접근법과 같은 새로운 과학적 접근법은 고품질의 핵산을 필요로 합니다 ^3,4,5. FFPE 조직 샘플에서 DNA를 추출하는 것은 여전히 어려운 작업입니다. FFPE 샘플의 DNA는 연령과 고정 조건에 따라 품질과 양이 크게 달라질 수 있습니다. 가장 빈번하게 사용되는 화합물인 포르말린(Formalin)은 DNA-단백질 가교결합(crosslink) ^6,7,8을 유발하고 뉴클레오티드 염기서열⁽nucleotide sequence)에서 비특이적 무작위 파괴(randomal breakage)를 일으킨다9. 이는 교차결합이 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭을 비활성화할 수 있기 때문에 다운스트림 게놈 분석에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다 ^6,10. 고정 과정 중 오염 물질로 인해 FFPE 샘플에서 분리된 DNA의 순도가 제한되는 경우가 많습니다. 최근 몇 년 동안 DNA 분리를 위한 다양한 방법이 확립되었으며, 주로 암 조직 표본 ^2,11,12,13에서 추출되었습니다.

일반적으로 FFPE 조직에서 핵산을 추출하기 위한 프로토콜은 세 가지 주요 그룹으로 구별할 수 있습니다. 첫 번째, 가장 일반적으로 사용되는 방법 그룹에는 상업적으로 이용 가능한 실리카 기반 컬럼 시스템⁽¹⁴)이 포함됩니다. 두 번째 그룹은 Joseph Sambrook과 David W. Russell¹⁵에 의해 처음 기술된 페놀 및 클로로포름을 사용한 수동 유기상 추출 방법과 관련이 있습니다. 세 번째 그룹으로, 지난 몇 년 동안 액체 취급 시스템(liquid handling system) 및 상자성 입자 기반 시스템(paramagnetic particle-based system)과 같은 자동화 시스템이 구축되었다¹⁶. 세 가지 명명된 시스템은 각각 유해 화학물질(즉, 자일렌, 페놀, 클로로포름), 높은 비용¹⁷, 인력¹⁸, 시간 소비¹⁹와 같은 서로 다른 장점과 단점을 가지고 있다. 특히, 고처리량 분석뿐만 아니라 까다로운 조직 표본의 경우 표준화, 재현성, 상대적으로 낮은 시간 소비, 인력 및 비용이 핵산 분리에 적합한 방법을 찾는 데 가장 중요한 기능입니다²⁰. 자동 추출 방법은 재현성이 더 좋은 결과를 보여주는 것으로 알려져 있으며 소규모 생검에 더 민감합니다. 또한 필요한 조직이나 혈액의 양이 적고 많은 양의 파라핀으로 인한 시스템 막힘 위험이 줄어듭니다. 자동 핵산 추출을 위한 기계와 필요한 키트는 수동 방법에 비해 더 비싸지만, 문제가 적은 추출 프로세스로 인해 여전히 설득력이 있습니다. 문헌 검색은 식물, 동물, 인간과 같은 다양한 조직 및 유기체와 배양 세포에서 수동, 컬럼 기반 및 자동 DNA 및 RNA 추출 방법을 직접 비교하는 많은 출판물을 제공합니다 20,21,22. 10년 된 스냅 냉동 조직에서 분리된 DNA와 RNA가 PCR, 정량적 PCR, NGS, 메틸화 분석 및 클로닝과 같은 다운스트림 분석에 사용될 수 있음을 보여주는 문헌에 존재하는 증거도 있습니다 9,23,24,25,26.

예를 들어, 노화된 인간 혈관 조직과 작은 조직 생검, 특히 FFPE 샘플과 관련된 주요 문제는 고도로 석회화된 죽상경화성 병변에 세포가 부족하여 결과적으로 핵산 농도가 낮아진다는 것입니다¹. FFPE 조직에서 DNA를 추출하기 위한 여러 방법이 이미 확립되어 널리 사용되고 있지만, 수동 시료 전처리 방법은 긴 수작업 시간이 필요하며²⁷ 탈파라핀화를 위해 자일렌 또는 페놀과 같은 독성 시약이 필요합니다². 설명한 바와 같이, 탈파라핀화 공정은 추출된 DNA의 품질과 양에 현저한 영향을 미치는 시간이 많이 소요되는 중요한 단계(예: 약 30분)입니다(예: 탈파라핀화 용액의 단편화 및 분해 및 고온과 같은 DNA에 대한 독성 영향)²⁸. 최근에 개발된 새로운 DNA 추출 프로토콜은 다른 무독성 파라핀화 솔루션, 복구 전략 및 자동화된 비드 기술을 사용하는 데 중점을 둡니다. 특히, 자동화 및 반자동 방법은 효율적인 회수, 교차 오염 부족 및 쉬운 성능으로 DNA 추출에 성공적인 것으로 나타났습니다²⁹. 우리는 이러한 한계를 극복하는 프로토콜을 수립했습니다. 결과적으로, 우리의 기술은 최고의 정량적 및 정성적 표준에서 처리 및 수작업 시간을 줄일 수 있습니다.

특히 유전형 분석, 후성유전체학 연구 및 RNA 염기서열분석과 같은 재현성 있는 고처리량 분석의 경우, 컬럼 기반 정제 시스템으로 FFPE 검체를 처리하는 것은 종종 어렵고 시간이 많이 소요됩니다(예: 긴 탈파라핀화 단계, 컬럼 막힘, 긴 실습 시간). 많은 양의 파라핀으로 인한 실리카 막의 막힘이 주요 문제입니다. 고품질 핵산의 분리를 악화시킬 수 있는 다른 상황으로는 피부의 미세 생검, 작은 마우스 조직, 플라크와 같은 매우 지방이 많거나 석회화된 조직, 골화된 조직 및 노화된 샘플과 같은 소량의 조직이 있습니다. 특히 진단 및 법의학 분야에서는 지난 몇 년 동안 액체 취급 또는 상자성 입자 기반 추출 방법과 같은 자동 및 반자동 시스템이 점점 더 중요해졌는데, 이는 주로 상대적으로 적은 실습 시간과 표준화 가능성으로 인해^30,31 증가했습니다. 이미 발표된 대부분의 프로토콜은 종양 생검 또는 식물 조직과 같이 세포량이 많거나 중간 정도인 매끄러운 조직에 완벽하게 작용합니다 13,22,32. 고정된 단세포, 석회화된 혈관, 콜라겐이 풍부한 조직, 세포 수가 적은 지방 조직과 같이 상대적으로 다루기 어려운 조직에서 DNA를 분리하는 데 사용되는 반자동 입자 기반 방법에 대한 문헌은 제대로 설명되지 않았습니다³³.

이 연구에서는 혈관 파라핀 삽입 절편에서 DNA를 분리하기 위한 최적화된 반자동 방법을 설명하고 이를 두 개의 수동 컬럼 기반 프로토콜과 비교합니다. DNA의 양, 순도 및 단편화 정도가 검증에 사용되었습니다. 상업적으로 이용 가능한 혈액 DNA 프로토콜이 시작점으로 사용되었으며, 이후 반자동 시스템의 수동 단계는 FFPE와 조직 프로토콜의 단계를 결합하여 인간 및 동물 조직의 신선한 냉동 조직 샘플뿐만 아니라 FFPE의 사용에 최적화되었습니다. 이 프로토콜의 자동화된 단계는 기기에 사전 설치되어 있으며 사용된 키트(여기서는 혈액 DNA 키트)에 따라 다릅니다. 설명된 반자동 카트리지 기반 시스템을 사용하면 회사에서 권장하는 기기에 대해 다른 프로토콜 및 키트를 사용하는 대신 동일한 프로토콜, 기계, 키트 및 소모품을 사용하여 혈액, 갓 동결된 조직, 포르말린 고정 조직 및 단일 세포에서 DNA를 분리할 수 있습니다. 프로토콜에는 하나의 완충액과 다른 응용 프로그램에 대한 약간의 배양 시간과 같은 사소한 차이만 있기 때문에 이 프로토콜은 모든 종류의 조직에서 DNA를 추출하는 데 매우 유용합니다. 당사의 프로토콜은 주로 석회화되고 세포가 부족한 인간 혈관 조직 및 섬유성 인간 혈관 조직에 최적화되어 있지만, 위에서 언급한 모든 종류의 어려운 조직에 대해 사용할 수 있으며 추가로 최적화할 수 있습니다.

요약하면, 죽상동맥경화증(예: 대동맥, 경동맥, 관상동맥)을 연구하는 심혈관 분야의 연구자를 위해 당사는 혈관 FFPE 샘플에서 반자동 DNA 추출을 위한 사용하기 쉬운 포인트별 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

당사 바이오뱅크에서 인간 경동맥경화성 표본을 수집할 수 있는 허가는 지역 병원 윤리 위원회(2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Munich, Germany)의 승인을 받았습니다. 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 실험은 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었습니다.

1. 조직 준비

1. 마이크로톰으로 FFPE 샘플에서 10μm의 조직 절편 5-8개를 준비하고 1.5mL 튜브에 옮깁니다. 블록에서 과도한 파라핀을 줄일 필요는 없습니다.
   참고: 하나의 큰 섹션 대신 더 얇은 단일 섹션이 버퍼 반응을 가속화합니다. O₂ 노출로 인해 첫 번째 섹션을 버리십시오. 더 큰 샘플의 경우 더 적은 섹션을 사용할 수도 있습니다.
2. 이 튜브를 벤치 탑 원심분리기에서 원심분리하고 실온에서 1분 동안 5,000 x g 로 설정하여 튜브 바닥에 있는 각 샘플을 수집합니다.
   주의: 너무 긴 원심분리는 샘플의 응고를 유발하고 용해를 복잡하게 만듭니다.

2. 지질 용해 및 탈파라핀화

참고: 이 단계는 탈파라핀화 및 지질 분해에 필요합니다. 사용된 완충액은 상업용 탈파라핀화 용액보다 독성이 적습니다.

1. 각 튜브에 시판되는 인큐베이션 버퍼 300 μL와 1-티오글리세롤 6 μL를 추가합니다.
   알림: 자동화 시스템 카트리지의 최대 부피인 300μL 이상을 사용하지 마십시오.
2. 10초 동안 와류를 일으키고 파라핀을 가용화하기 위해 가열 블록에서 80°C 및 500rpm에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
   주의 : 조직은 결국 완전히 용해되어야 합니다. 필요한 경우 배양 중에 여러 번 와류를 일으킵니다.

3. 샘플 및 단백질 소화

참고: 프로테아제 K를 사용한 천연 소화는 단백질이 없는 깨끗한 DNA 추출물을 갖는 데 중요합니다. 또한 존재하는 오염 단백질을 줄입니다. 또한, 뉴클레아제는 DNA를 저장하기 위해 파괴됩니다³⁴. 이 하룻밤 단계는 완전한 시료 분해를 위해서도 필요합니다.

1. 샘플을 60°C로 식힌 다음 제공된 Proteinase K 용액 30μL를 추가합니다.
2. 다시 와류를 일으키고 가열 블록에서 65 ° C 및 500 rpm에서 하룻밤 (4-20 시간) 혼합물을 배양합니다. 완전한 시료 분해를 위해 때때로 배양 중 시료를 소용돌이치십시오.
   참고: 하룻밤 배양하면 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 혼합 단계는 30-60분마다 권장됩니다. 결국, 튜브 내부에 시각 조직 조각이 없어야 합니다.

4. 세포 용해

1. 혈액 키트에 제공된 400μL의 용해 완충액을 추가하고 곧 와류를 일으킵니다.
2. 65°C에서 500rpm으로 30분 동안 샘플을 다시 배양합니다.
3. 샘플을 실온으로 식히십시오. 파라핀은 위에서 굳어집니다.
   주의 : 파라핀을 샘플에서 분리하기 위해 다시 와류하지 마십시오. 그렇지 않으면 파라핀이 조직과 혼합되어 샘플이 파괴됩니다. 샘플은 6.1단계에서 수집됩니다.

5. 미리 분배된 카트리지의 준비

1. 기기 및 연결된 태블릿 컴퓨터를 켭니다.
2. 소프트웨어 앱을 시작하고 도어 버튼을 클릭하여 기기를 엽니다.
3. 기기에서 랙을 제거하고 미리 채워진 카트리지를 프로브 랙에 삽입합니다. 카트리지가 제자리에 고정될 때 두 번 딸깍 소리가 나는지 확인하고 밀봉 호일을 제거합니다.
4. 카트리지의 마지막(8) 웰에 플런저를 추가합니다. 기기에서 피펫 팁 역할을 합니다.
5. 키트와 함께 제공된 65μL의 용리 버퍼로 제공된 0.5mL 용출 튜브를 채웁니다. 튜브를 열어 두고 카트리지 뒤의 랙 앞부분에 있는 전용 위치에 삽입합니다.
   참고: 용리를 위한 최소 부피는 60μL입니다. 시스템은 추가된 용리 부피의 5–10 μL를 잃게 됩니다.

6. 자동화된 DNA 추출

1. 4.3단계에서 1.5mL 튜브 상단의 파라핀을 조심스럽게 구멍을 뚫어 파라핀과 다시 섞지 않고 튜브 바닥의 깨끗한 샘플에 도달합니다.
2. 준비된 샘플의 전체 혼합물(730μL)을 카트리지의 첫 번째 웰로 옮깁니다.
3. 자동 DNA 추출 기계에 랙을 삽입합니다. 랙이 먼저 시스템 후면에 잠기고 그 후에 앞쪽에 잠기는지 확인합니다.
4. 소프트웨어에서 왼쪽 상단의 주황색 시작 버튼을 클릭하여 실행을 시작합니다. 사전 설치된 다른 프로토콜이 있는 창이 열립니다. 기기에서 Blood DNA protocol 을 선택합니다. 소프트웨어에서 '예'를 클릭하여 플런저, 용리 튜브 및 샘플이 추가되었는지 확인합니다. 기기의 도어가 자동으로 닫히고 실행이 시작됩니다(표시등이 녹색으로 바뀝니다). 운행 시간은 약 38분입니다. 추가 보정이 필요하지 않습니다.
   알림: 시스템이 모든 샘플에 대한 플런저를 집어올릴 때까지 지켜보십시오.amp랙에 있습니다. 그렇지 않으면 시스템이 자동으로 중지되고 머신 프로토콜을 다시 시작해야 합니다.
5. 시스템이 카트리지의 첫 번째 웰에서 자동 용해 단계를 수행한 다음 웰 3에서 7까지 세척 단계를 수행하는지 확인합니다. 추가 프로그래밍 단계는 필요하지 않습니다. 전체 프로그램은 회사에서 사전 설치합니다.
6. 완료되면 시스템이 추가된 플런저를 통해 준비된 용출 튜브의 DNA를 용리시키는지 확인합니다. 자성 입자는 플런저에 남아 있습니다. 결국 플런저는 카트리지의 마지막 웰로 돌아갑니다.

7. 달리기 끝내기

1. 실행이 완료되면(기기에 녹색 깜박임 표시등이 표시됨) 열기 버튼(도어 사인)을 클릭하여 기기를 열고 시스템에서 랙을 제거합니다.
2. 카트리지를 폐기하십시오.
3. 빈 랙을 기기에 다시 삽입하고 오른쪽 상단 모서리에 있는 도어 버튼을 통해 도어를 닫습니다. 소프트웨어 앱을 닫고 기기와 태블릿 컴퓨터를 끕니다.
4. 장기 보관의 경우 -20°C, 단기 보관의 경우 4°C에서 용리액을 보관하거나 다운스트림 분석 또는 농도 측정에 직접 사용할 수 있습니다.

결과

프로토콜의 확립을 위해 경동맥 죽상동맥경화증 환자의 FFPE 조직 블록 5개를 사용했습니다. DNA는 최적화된 반자동 프로토콜(키트 C)과 상업적으로 이용 가능한 두 개의 수동 컬럼 기반 프로토콜(키트 A 및 키트 B, 재료 표 참조)을 사용하여 분리되었습니다. 키트 A와 B를 사용한 DNA 추출은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 시판되는 두 키트(키트 A ?...

토론

FFPE 조직에 대한 DNA 추출 방법은 분리된 DNA의 질과 양이 다양하며, 이는 필연적으로 추가 다운스트림 분석의 수행에 영향을 미칩니다. 따라서 자동화는 워크플로우와 표준화, 품질 관리를 개선하기 위해 필수적이 되고 있습니다. 따라서 본 연구에서는 FFPE 샘플에서 DNA를 추출하는 반자동 방법을 평가하여 테스트된 다른 수동 컬럼 기반 프로토콜보다 더 나은 결과를 보여?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes for sample incubation	Eppendorf, Hamburg, Germany	30120086
1-Thioglycerol	Promega, Walldorf, Germany	A208
Agilent tape station software 3.2	Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS Kit	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q32851
FFPE DNA Purification Kits (Kit A)	Norgene Biotek, Heidelberg, Germany	47400
FFPE tissue samples n=5	Munich Vascular Biobank,Munich, Germany
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)	Qiagen, Hilden, Germany	180134
Heating blocks, set to 80°C and 65°C	VWR,Darmstadt,Germany	460-0250
High Sensitivity D5000 reagents	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5593
High Sensitivity D5000 ScreenTape	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5592
Incubation Buffer	Promega, Walldorf, Germany	D920
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase K	Promega, Walldorf, Germany	AS1400
Maxwell RSC 48 Instrument	Promega, Walldorf, Germany	AS8500
Microcentrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c Spectrometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	ND-2000C
Optical caps	Agilent, Waldbronn, Germany	401425
Optical tube strips	Agilent, Waldbronn, Germany	401428
Pipettors and pipette tips	Eppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 for statistics, version 6.01	GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q33216
TapeStation 4200	Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan, Männedorf, Swizerland	IN-MNANO