Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.

Resumen

La electroporación se ha establecido como un método crítico para transferir genes específicos a las células para entender su función. Aquí, se describe una técnica de electroporación unicelular que maximiza la eficiencia (~ 80%) de la transfección genética in vitro en las neuronas inhibitorias excitatorias y específicas de la clase en el cultivo organotípico de la rebanada del hipocampo de ratón. Usando los electrodos de cristal grandes, el líquido cerebroespinal artificial tetrodotoxina-que contenía y los pulsos eléctricos suaves, entregamos un gene del interés en las neuronas piramidales hippocampal cultivadas CA1 y las interneuronas inhibitorias. Por otra parte, la electroporación podría llevarse a cabo en rodajas de hipocampo cultivadas hasta 21 días in vitro sin reducción en la eficiencia de transfección, lo que permite el estudio de diferentes etapas de desarrollo del cultivo en rodajas. Con el creciente interés en examinar las funciones moleculares de los genes a través de una amplia gama de tipos de células, nuestro método demuestra un enfoque confiable y sencillo para la transfección de genes in vitro en el tejido cerebral de ratón que se puede realizar con el equipo y las técnicas de electrofisiología existentes.

Introducción

En biología molecular, una de las consideraciones más importantes para un investigador es cómo entregar un gen de interés en una célula o población de células para dilucidar su función. Los diferentes métodos de administración pueden clasificarse como biológicos (por ejemplo, un vector viral), químicos (por ejemplo, fosfato de calcio o lípidos) o físicos (por ejemplo, electroporación, microinyección o biolística)^1,2. Los métodos biológicos son altamente eficientes y pueden ser específicos del tipo celular, pero están limitados por el desarrollo de herramientas genéticas específicas. Los enfoques químicos son muy potentes in vitro, pero las transfecciones son generalmente aleatorias; además, estos enfoques se reservan principalmente para las células primarias solamente. De los enfoques físicos, la biolística es la más simple y fácil desde un punto de vista técnico, pero de nuevo produce resultados de transfección aleatoria con una eficiencia relativamente baja. Para aplicaciones que requieren transferencia a células específicas sin necesidad de desarrollar herramientas genéticas, miramos hacia la electroporación unicelular^3,4.

Mientras que la electroporación solía referirse únicamente a la electroporación de campo, en los últimos veinte años se han desarrollado múltiples protocolos de electroporación unicelular in vitro e in vivo para mejorar la especificidad y la eficiencia^5,6,7,demostrando que la electroporación puede utilizarse para transferir genes a células individuales y, por lo tanto, puede ser extremadamente precisa. Sin embargo, los procedimientos son técnicamente exigentes, lentos y relativamente ineficientes. De hecho, artículos más recientes han investigado la viabilidad de las plataformas de electroporación mecanizadas^8,9,que pueden ayudar a eliminar varias de estas barreras para los investigadores interesados en instalar dicha robótica. Pero para aquellos que buscan medios más simples, los problemas con la electroporación, a saber, la muerte celular, la falla de transfección y la obstrucción de pipetas, siguen siendo una preocupación.

Recientemente desarrollamos un método de electroporación que utiliza pipetas de vidrio de punta más grande, parámetros de pulso eléctrico más suaves y un paso único de ciclo de presión, que generó una eficiencia de transfección mucho mayor en las neuronas excitatorias que los métodos anteriores, y nos permitió por primera vez transfectar genes en interneuronas inhibitorias, incluidas las interneuronas inhibitorias que expresan somatostatina en la región ca1 hipocampal del cultivo de rebanadas organotípicas de ratón^10. Sin embargo, la confiabilidad de este método de electroporación en diferentes tipos de interneurona inhibitoria y etapas de desarrollo neuronales no se ha abordado. Aquí, hemos demostrado que esta técnica de electroporación es capaz de transfectar genes en las neuronas excitatorias y diferentes clases de interneuronas. Es importante destacar que la eficiencia de transfección fue alta, independientemente de los días de edad de cultivo en rodajas in vitro (DIV) probados. Esta técnica establecida y fácil de usar es muy recomendable para cualquier investigador interesado en el uso de electroporación unicelular para diferentes tipos de células en el contexto del tejido cerebral de ratón in vitro.

Protocolo

Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts. La preparación del cultivo en rodajas, la preparación del plásmido y la electroporación también se detallan en nuestros métodos publicados anteriormente y pueden ser referidos para obtener información adicional¹⁰.

1. Preparación del cultivo de la rebanada

1. Prepare los cultivos organotípicos de la rebanada hippocampal del ratón según lo descrito^{previamente 11,}usando los ratones postnatales de 6 a 7 días viejos de cualquier sexo.
   1. Preparar medios de disección para cultivo organotípico en rodajas consistentes en (en mM): 238 sacarosa, 2,5 KCl, 1 CaCl_2,4 MgCl_2,26 NaHCO_3,1 NaH2 PO_4,y 11 glucosa en agua desionizada, luego gas con 5% de_CO2/95%O2 a un pH de 7,4.
   2. Preparar medios organotípicos de cultivo en rodajas compuestos por: 78,8% (v/v) Mínimo Esencial Medio Águila, 20% (v/v) de suero de caballo, 17,9 mM NaHCO_3,26,6 mM de glucosa, 2 M CaCl_2,2 M MgSO_4,30 mM HEPES, insulina (1 μg/mL), y 0,06 mM de ácido ascórbico, pH ajustado a 7,3. Ajuste la osmolaridad a 310-330 osmol usando un osmómetro.
   3. Diseccione el hipocampo de todo el cerebro usando dos espátulas, y rebanada (400 μm) usando un helicóptero de tejido. Separe las rebanadas mediante el uso de dos fórceps y transfiera a 30 mm las inserciones de cultivo celular en una placa de 6 pozos llena de medios de cultivo (950 μL) debajo de las inserciones.
2. Almacene los cultivos organotípicos en rodajas en una incubadora de cultivos de tejidos (35 °C, 5% de_CO2)y cambie el medio de cultivo en rodajas cada dos días.

2. Preparación del plásmido

1. Preparar el plásmido para el gen de interés.
   1. Subclone aumentó el gen de la proteína fluorescente verde (EGFP) en un vector del pCAG.
   2. Purificar el plásmido pCAG-EGFP con un kit de purificación libre de endotoxinas y disolverlo en una solución interna que consiste en agua tratada con pirocarbonato de dietilo que contiene 140 mM de K-metanosulfonato, 0,2 mM de EGTA, 2 mM de MgCl₂y 10 mM de HEPES, ajustada a pH 7,3 con KOH (concentración de plásmido: 0,1 μg/μL).

3. Preparación de pipetas de vidrio

1. Tire de pipetas de vidrio de borosilicato (4.5 – 8 MΩ) en un tirador de micropipeta (Figura 1A).
   NOTA: Las pipetas de vidrio utilizadas para grabaciones de abrazaderas de parches de celda entera son ideales para la electroporación.
2. Hornear pipetas de vidrio durante la noche a 200 °C para esterilizar.
3. Compruebe el tamaño de la punta de la pipeta bajo un microscopio de disección para aproximarse a la resistencia eléctrica.
   1. Opcional: Verifique la resistencia de la pipeta uniendo la pipeta al electrodo de electroporación y use el micromanipulador para maniobrar la punta de la pipeta en el líquido cefalorraquídeo artificialesterilizado por filtro (aCSF) que contiene (en mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl_{2, 5}MgCl 2, 26 NaHCO_3,1 NaH₂PO₄ y 11 glucosa en agua desionizada, gaseado con 5% de CO₂/ 95% O₂ a un pH de 7.4. Confirme la resistencia real utilizando la lectura en el electroporador.
      NOTA: Cuanto más nítida sea la punta de la pipeta, mayor será la resistencia eléctrica. La resistencia de la pipeta debe estar por debajo de 10 MΩ. Las pipetas de vidrio con alta resistencia a las pipetas(Figura 1B)a menudo se obstruyen en la punta durante la electroporación repetida.

4. Configuración de la plataforma de electroporación

1. Instale el electroporador en un equipo de electrofisiología de celda entera estándar, equipado con un microscopio vertical montado en una mesa de cambio con un micromanipulador y una bomba peristáltica.
2. Instale el cabezal del electroporador en un micromanipulador y conecte un par de altavoces al electroporador. Conecte el electroporador a un pedal de pie que se puede utilizar para enviar un pulso cuando esté listo.
   NOTA: Los altavoces emiten un tono cuando se encienden, que es un indicador de la resistencia eléctrica en el electrodo. Esto permite determinar los cambios relativos en la resistencia sin desviar la atención del procedimiento.

5. Preparación de electroporación

1. Transfiera los insertos de cultivo de rebanadas de 6 placas de pozo a placas de Petri de 3 cm cargadas con 900 μL de medios de cultivo y guárdelos en una incubadora de CO₂ de mesa hasta que esté listo para realizar la electroporación.
   1. Preincubar inserciones de cultivo fresco con medios de cultivo en rodajas (1 mL) durante al menos 30 min en una placa de Petri de 3,5 cm para cultivar rodajas después de la electroporación.
2. Limpie y prepare la plataforma para la electroporación.
   1. Perfundir las líneas con 10% de lejía durante 5 minutos para esterilizar el tubo y la cámara antes de comenzar el experimento para el día.
   2. Perfunda las líneas con agua autoclave desionizada durante al menos 30 minutos para enjuagar completamente.
   3. Perfunda las líneas con aCSF esterilizado por filtro que contiene 0,001 mM de tetrodotoxina (TTX).
      NOTA: TTX minimiza la toxicidad celular y la muerte debido a la sobreexcitación de interneuronas¹⁰.
3. Establezca los parámetros de pulso del electroporador: amplitud de –5 V, pulso cuadrado, tren de 500 ms, frecuencia de 50 Hz y un ancho de pulso de 500 μs.
4. Llene la pipeta de vidrio con 5 μL de solución interna que contenga plásmido.
   1. Retire las burbujas de aire atrapadas de la punta de la pipeta moviendo y tocando suavemente la punta varias veces.
   2. Compruebe si hay daños en la punta visualizándolo con un microscopio de disección o repitiendo el paso 3.3.1 para comprobar la resistencia de la pipeta.
      NOTA: Si la punta está dañada, la pipeta de vidrio debe desecharse, y este paso debe repetirse con una nueva pipeta de vidrio previamente preparada en el paso 3.
5. Acople de forma segura la punta de la pipeta al electrodo y encienda los altavoces. Registre la lectura (la resistencia de la pipeta) del electroporador cuando la punta haya hecho contacto con el medio aCSF.
6. Corte la membrana del inserto de cultivo usando una cuchilla afilada y aísle una rebanada. Transfiera cuidadosamente el cultivo de la rebanada a la cámara de electroporación mediante el uso de autorórceps en ángulo agudo y fije su posición con un anclaje de rebanada.
   1. No mantenga el cultivo en rodajas fuera de la incubadora durante más de 30 minutos a la vez para prevenir efectos secundarios como cambios en la salud neuronal o la función^12.

6. Celdas electroporadas de interés

1. Aplique presión positiva a la pipeta con la boca o usando una jeringa de 1 ml (0.2 - 0.5 mL de presión) unida a la tubería.
2. Utilice los controles de perilla de 3 dimensiones del micromanipulador para maniobrar la punta de la pipeta cerca de la superficie del cultivo de rebanadas.
3. Elija una célula diana y acérquese a ella, manteniendo la presión positiva aplicada hasta que se forme un hoyuelo en la superficie celular, visible en el microscopio.
4. Realizar ciclos de presión.
   1. Aplique rápidamente una presión negativa leve por vía oral para que se forme un sello suelto entre la punta de la pipeta y la membrana plasmática, indicado visualmente por la membrana que sube un poco en la punta de la pipeta. Observe un aumento (~ 2.5x la resistencia inicial) en la resistencia de la pipeta escuchando un aumento en el tono proveniente de los altavoces. Vuelva a aplicar rápidamente la presión positiva para que el hoyuelo se vuelva a formar.
   2. Complete inmediatamente al menos dos ciclos de presión más sin pausar, luego mantenga la presión negativa durante 1 s.
      NOTA: Hacer una pausa entre ciclos, aplicar demasiada presión o mantener la presión negativa durante demasiado tiempo puede causar daño celular significativo y posiblemente causar que la celda muera durante la electroporación.
5. Pulse rápidamente el electroporador una vez usando el pedal del pie cuando el tono de los altavoces alcanza un ápice estable en el tono, lo que indica una resistencia eléctrica máxima. No espere en la resistencia máxima durante más de 1 s antes de enviar el pulso.
   NOTA: No hemos observado electroporación fuera del objetivo cuando se utiliza este protocolo¹⁰. Solamente las células en contacto con la pipeta de cristal durante ciclos de la presión fueron transfectadas. Colocar la pipeta cerca de otras neuronas no resulta en la transfección de genes.
6. Retraiga suavemente la pipeta aproximadamente 100 μm de la célula sin aplicar presión.
7. Vuelva a aplicar presión positiva, verificando que la resistencia sea similar a la lectura registrada en el paso 5.5, luego acerque a la siguiente celda.
   1. Eliminar los zuecos potenciales, indicados visualmente o por una resistencia a la pipeta significativamente mayor (>15% mayor) después de la electroporación, mediante la aplicación de presión positiva.
      NOTA: Si no hay obstrucción visible y la resistencia sigue siendo significativamente mayor, deseche la pipeta y utilice una nueva. En promedio, una pipeta se puede utilizar para hasta 20 eventos de electroporación si el usuario tiene cuidado¹⁰.
8. Después de la electroporación, transfiera el cultivo en rodajas a un inserto de cultivo fresco e incube a 35 °C en la incubadora durante un período de hasta 3 días.

7. Fijación, tinción e imágenes de cultivos organotípicos de rebanadas del hipocampo

1. Fijar cultivos organotípicos electroporados en rodajas 2 – 3 días después de la transfección con paraformadehído al 4% y sacarosa al 4% en solución salina tamponada con fosfato de 0,01 M (1x PBS) durante 1,5 h a temperatura ambiente.
2. Retirar el fijador e incubar rodajas en sacarosa al 30% en tampón de fosfato de 0,1 M (1x PB) durante 2 h.
3. Coloque las rebanadas en un vaso de diapositivas y congele poniendo el vidrio deslizante encima del hielo seco triturado. Descongele las rebanadas a temperatura ambiente y transfiételas a una placa de 6 pocillos llena de 1x PBS.
4. Manche las rebanadas con anticuerpos anti-GFP de ratón y anti-RFP de conejo en tampón GDB (gelatina al 0,1%, Tritón X-100 al 0,3%, NaCl de 450 mM y 32% 1x PB, pH 7,4) durante 2 h a temperatura ambiente.
5. Lave las rodajas con 1x PBS tres veces a temperatura ambiente durante 10 min cada lavado.
6. Incubar rebanadas con anticuerpo secundario conjugado anti-ratón Alexa 488 y anticuerpo secundario conjugado anti-conejo Alexa 594 en tampón GDB durante 1 h a temperatura ambiente. Incubar rodajas con DAPI (4 μg/mL) en 1x PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
7. Lavar las rodajas con 1x PBS tres veces a temperatura ambiente durante 3 min cada lavado.
8. Monte las rebanadas en las diapositivas de cristal usando el medio de montaje y realice la proyección de imagen de la fluorescencia.

Resultados

Nuestra electroporación unicelular es capaz de entregar genes con precisión en neuronas excitatorias e inhibitorias identificadas visualmente. Hemos electroporated tres tipos diferentes de células neuronales en tres puntos de tiempo diferentes. Parvalbumin (Pv) o glutamato vesicular tipo 3 (VGT3) que expresan las neuronas se visualizaron cruzando Pv^cre (JAX #008069) o VGT3^cre (JAX #018147) líneas con TdTomato (una variante de la proteína fluorescente roja) línea reportero (Jax #007905), respec...

Discusión

Describimos aquí un método de electroporación que transfecta las neuronas excitatorias e inhibitorias con alta eficiencia y precisión. Nuestro protocolo de electroporación optimizado tiene tres avances innovadores para lograr una transfección génica altamente eficiente. Nuestra primera modificación fue aumentar el tamaño de la pipeta en comparación con los protocolos publicados anteriormente^3,5,6. Este cambio nos permi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710