Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de tranches organotypiques de neurones excitateurs excitateurs de l’hippocampe de souris et de neurones inhibiteurs spécifiques à une classe

Résumé

Présenté ici est un protocole pour l’électroporation unicellulaire qui peut livrer des gènes dans les neurones excitateurs et inhibiteurs à travers une gamme d’âges in vitro de culture de tranche hippocampique. Notre approche fournit une expression précise et efficace des gènes dans des cellules individuelles, qui peuvent être utilisées pour examiner les fonctions cellulaires autonomes et intercellulaires.

Résumé

L’électroporation s’est établie comme une méthode critique pour transférer des gènes spécifiques dans les cellules afin de comprendre leur fonction. Ici, nous décrivons une technique d’électroporation unicellulaire qui maximise l’efficacité (~ 80%) de la transfection in vitro de gène dans les neurones inhibiteurs excitateurs et classe-spécifiques dans la culture organotypique de tranche hippocampique de souris. Utilisant de grandes électrodes de verre, le fluide céphalo-rachidien artificiel tetrodotoxin-contenant et les impulsions électriques douces, nous avons livré un gène d’intérêt dans les neurones pyramidaux CA1 hippocampiques cultivés et les interneurones inhibiteurs. De plus, l’électroporation pourrait être effectuée dans des tranches hippocampiques cultivées jusqu’à 21 jours in vitro sans réduction de l’efficacité de la transfection, ce qui a permis d’étudier les différents stades de développement de la culture de tranches. Avec un intérêt croissant pour l’examen des fonctions moléculaires des gènes dans une gamme variée de types de cellules, notre méthode démontre une approche fiable et simple de la transfection in vitro des gènes dans le tissu cérébral de la souris qui peut être effectuée avec l’équipement et les techniques d’électrophysiologie existants.

Introduction

En biologie moléculaire, l’une des considérations les plus importantes pour un chercheur est de savoir comment délivrer un gène d’intérêt dans une cellule ou une population de cellules pour élucider sa fonction. Les différentes méthodes d’administration peuvent être classées comme biologiques (p. ex., un vecteur viral), chimiques (p. ex., phosphate de calcium ou lipides) ou physiques (p. ex., électroporation, microinjection ou biolistique)^1,2. Les méthodes biologiques sont très efficaces et peuvent être spécifiques au type de cellule, mais sont limitées par le développement d’outils génétiques spécifiques. Les approches chimiques sont très puissantes in vitro, mais les transfections sont généralement aléatoires; de plus, ces approches sont principalement réservées aux cellules primaires seulement. Parmi les approches physiques, la biolistique est la plus simple et la plus facile d’un point de vue technique, mais produit à nouveau des résultats de transfection aléatoires à une efficacité relativement faible. Pour les applications qui nécessitent un transfert dans des cellules spécifiques sans avoir besoin de développer des outils génétiques, nous nous tournons vers l’électroporation unicellulaire^3,4.

Alors que l’électroporation ne se référait qu’à l’électroporation sur le terrain, au cours des vingt dernières années, de multiples protocoles d’électroporation unicellulaire in vitro et in vivo ont été développés pour améliorer la spécificité et l’efficacité^5,6,7,démontrant que l’électroporation peut être utilisée pour transférer des gènes à des cellules individuelles et peut, par conséquent, être extrêmement précise. Cependant, les procédures sont techniquement exigeantes, longues et relativement inefficaces. En effet, des articles plus récents ont étudié la faisabilité des plates-formes d’électroporation mécanisées^8,9, qui peuvent aider à éliminer plusieurs de ces obstacles pour les chercheurs intéressés par l’installation d’une telle robotique. Mais pour ceux qui recherchent des moyens plus simples, les problèmes d’électroporation, à savoir la mort cellulaire, l’échec de la transfection et le colmatage de la pipette, restent préoccupants.

Nous avons récemment développé une méthode d’électroporation qui utilise des pipettes en verre à plus grande pointe, des paramètres d’impulsion électrique plus doux et une étape de cycle de pression unique, qui a généré une efficacité de transfection beaucoup plus élevée dans les neurones excitateurs que les méthodes précédentes, et nous a permis pour la première fois de transfecter des gènes dans des interneurones inhibiteurs inhibiteurs, y compris des interneurones inhibiteurs exprimant la somatostatine dans la région CA1 hippocampique de la culture de tranches organotypiques de souris^10. Cependant, la fiabilité de cette méthode d’électroporation dans différents types inhibiteurs d’interneurones et stades de développement neuronaux n’a pas été abordée. Ici, nous avons démontré que cette technique d’électroporation est capable de transfecter des gènes à la fois dans des neurones excitateurs et dans différentes classes d’interneurones. Il est important de savoir que l’efficacité de la transfection était élevée, quels que soient les jours in vitro (DIV) d’âge de culture de tranche testés. Cette technique établie et conviviale est fortement recommandée à tout chercheur intéressé par l’utilisation de l’électroporation unicellulaire pour différents types de cellules dans le contexte du tissu cérébral in vitro de souris.

Protocole

Tous les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la faculté de médecine de l’Université du Massachusetts. La préparation de la culture de tranches, la préparation du plasmide et l’électroporation sont également détaillées dans nos méthodes précédemment publiées et peuvent être mentionnées pour plus d’informations¹⁰.

1. Préparation de la culture de tranches

1. Préparer des cultures organotypiques de tranches d’hippocampe de souris comme décrit précédemment¹¹, en utilisant des souris postnatales âgées de 6 à 7 jours de l’un ou l’autre sexe.
   1. Préparer des milieux de dissection pour la culture de tranches organotypiques constitués de (en mM) : 238 saccharose, 2,5 KCl, 1_CaCl2,4_MgCl2,26 NaHCO3, 1_NaH2PO4,et 11 glucose dans de l’eau désionisée, puis gazeux à 5 %_CO2/95%_O2 à un pH de 7,4.
   2. Préparer des milieux de culture de tranches organotypiques composés de : 78,8 % (v/v) minimum essentiel moyen Eagle, 20 % (v/v) de sérum de cheval, 17,9 mM de NaHCO_3,26,6 mM de glucose, 2 M_CaCl2,2 M MgSO_4,30 mM d’HEPES, insuline (1 μg/mL) et 0,06 mM d’acide ascorbique, pH ajusté à 7,3. Ajustez l’osmolarité à 310-330 osmol à l’aide d’un osmomètre.
   3. Disséquer l’hippocampe de tout le cerveau à l’aide de deux spatules et trancher (400 μm) à l’aide d’un hachoir à tissus. Séparez les tranches à l’aide de deux pinces et transférez-les dans des inserts de culture cellulaire de 30 mm dans une plaque de 6 puits remplie de milieux de culture (950 μL) sous les inserts.
2. Entreposer les cultures de tranches organotypiques dans un incubateur de culture tissulaire (35 °C, 5 % de_CO2)et changer le milieu de culture des tranches tous les deux jours.

2. Préparation du plasmide

1. Préparez le plasmide pour le gène d’intérêt.
   1. Subclone a augmenté le gène vert fluorescent de la protéine (EGFP) dans un vecteur de pCAG.
   2. Purifier le plasmide pCAG-EGFP avec un kit de purification sans endotoxine et dissoudre dans une solution interne composée d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle contenant 140 mM de K-méthanesulfonate, 0,2 mM d’EGTA, 2 mM MgCl₂et 10 mM d’HEPES, ajusté à un pH de 7,3 avec KOH (concentration de plasmide : 0,1 μg/μL).

3. Préparation de pipettes en verre

1. Tirez des pipettes en verre borosilicate (4,5 – 8 MΩ) sur un tireur à micropipette(figure 1A).
   REMARQUE: Les pipettes en verre utilisées pour les enregistrements de pinces de raccordement à cellules entières sont idéales pour l’électroporation.
2. Cuire des pipettes en verre pendant la nuit à 200 °C pour les stériliser.
3. Vérifiez la taille de la pointe de la pipette sous un microscope de dissection pour vous rapprocher de la résistance électrique.
   1. Facultatif:Vérifiez la résistance de la pipette en fixant la pipette à l’électrode d’électroporation et utilisez le micromanipulateur pour manœuvrer la pointe de la pipette dans du liquide céphalorachidien artificiel stérilisé par filtre (aCSF) contenant (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5_CaCl2,5_MgCl2,26 NaHCO3, 1 NaH2 PO₄ et 11 glucose dans de l’eau désionisée, gazé avec 5% de_CO2/95%_O2 à un pH de 7,4. Confirmez la résistance réelle à l’aide de la lecture sur l’électroporateur.
      REMARQUE: Plus la pointe de la pipette est nette, plus la résistance électrique est grande. La résistance de la pipette doit être inférieure à 10 MΩ. Les pipettes en verre à haute résistance à la pipette(figure 1B)se boucher souvent à l’extrémité lors d’une électroporation répétée.

4. Configuration de la plate-forme d’électroporation

1. Installez l’électroporateur sur une plate-forme d’électrophysiologie à cellules entières standard, équipée d’un microscope vertical monté sur une table de changement de vitesse avec un micromanipulateur et une pompe péristaltique.
2. Installez la scène d’tête de l’électroporateur sur un micromanipulateur et connectez une paire de haut-parleurs à l’électroporateur. Connectez l’électroporateur à une pédale qui peut être utilisée pour envoyer une impulsion lorsqu’elle est prête.
   REMARQUE: Les haut-parleurs émettent une tonalité lorsqu’ils sont allumés, ce qui est un indicateur de la résistance électrique à l’électrode. Cela permet de déterminer les changements relatifs de résistance sans détourner l’attention de la procédure.

5. Préparation par électroporation

1. Transférer les inserts de culture de tranches de 6 plaques de puits dans des boîtes de Petri de 3 cm chargées de 900 μL de milieux de culture et les conserver dans un incubateur de CO₂ sur table jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer l’électroporation.
   1. Pré-incuber des inserts de culture fraîche avec des milieux de culture en tranches (1 mL) pendant au moins 30 min dans une boîte de Petri de 3,5 cm pour les tranches de culture après électroporation.
2. Nettoyez et préparez la plate-forme pour l’électroporation.
   1. Parcourez les lignes avec 10% d’eau de Javel pendant 5 min pour stériliser le tube et la chambre avant de commencer l’expérience pour la journée.
   2. Perfuser les lignes avec de l’eau autoclavée désionisée pendant au moins 30 min pour rincer complètement.
   3. Impréfusez les lignes avec de l’aCSF stérilisé par filtre contenant 0,001 mM de tétrodotoxine (TTX).
      REMARQUE: TTX minimise la toxicité cellulaire et la mort due à la surexcitation des interneurones¹⁰.
3. Définissez les paramètres d’impulsion de l’électroporateur: amplitude de –5 V, impulsion carrée, train de 500 ms, fréquence de 50 Hz et largeur d’impulsion de 500 μs.
4. Remplissez la pipette en verre avec 5 μL de solution interne contenant du plasmide.
   1. Retirez toutes les bulles d’air piégées de la pointe de la pipette en feuilletant et en tapotant doucement la pointe plusieurs fois.
   2. Vérifiez la pointe pour les dommages en la visualisant sous un microscope de dissection ou en répétant l’étape 3.3.1 pour vérifier la résistance de la pipette.
      REMARQUE: Si la pointe est endommagée, la pipette en verre doit être jetée, et cette étape doit être répétée avec une nouvelle pipette en verre préalablement préparée à l’étape 3.
5. Fixez solidement la pointe de la pipette à l’électrode et allumez les haut-parleurs. Enregistrer la lecture (résistance de la pipette) de l’électroporateur lorsque la pointe est entrée en contact avec le milieu aCSF.
6. Couper la membrane d’insertion de culture à l’aide d’une lame tranchante et isoler une culture de tranche. Transférer soigneusement la culture de tranche dans la chambre d’électroporation à l’aide d’une pince à angle vif et fixer sa position avec une ancre de tranche.
   1. Ne gardez pas la culture de tranches à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 30 minutes à la fois pour prévenir les effets secondaires tels que des changements dans la santé ou la fonction neuronale¹².

6. Cellules électroporate d’intérêt

1. Appliquer une pression positive sur la pipette avec la bouche ou à l’aide d’une seringue de 1 mL (pression de 0,2 à 0,5 mL) fixée au tube.
2. Utilisez les commandes de bouton en 3 dimensions du micromanipulateur pour manœuvrer la pointe de la pipette près de la surface de la culture de la tranche.
3. Choisissez une cellule cible et approchez-la, en gardant la pression positive appliquée jusqu’à ce qu’une fossette se forme à la surface de la cellule, visible au microscope.
4. Effectuer des cycles de pression.
   1. Appliquez rapidement une légère pression négative par la bouche de sorte qu’un joint lâche se forme entre la pointe de la pipette et la membrane plasmique, indiqué visuellement par la membrane qui monte quelque peu dans la pointe de la pipette. Observez une augmentation (~2,5x la résistance initiale) de la résistance de la pipette en écoutant une augmentation de la tonalité provenant des haut-parleurs. Réappliquez rapidement une pression positive afin que la fossette se reforme.
   2. Complétez immédiatement au moins deux cycles de pression supplémentaires sans faire de pause, puis maintenez la pression négative pendant 1 s.
      REMARQUE: Faire une pause entre les cycles, appliquer trop de pression ou maintenir la pression négative trop longtemps peut causer des dommages importants à la cellule et éventuellement provoquer la mort de la cellule pendant l’électroporation.
5. Pulsez rapidement l’électroporateur une fois à l’aide de la pédale lorsque la tonalité des haut-parleurs atteint un sommet stable en hauteur, indiquant une résistance électrique maximale. N’attendez pas au pic de résistance pendant plus de 1 s avant d’envoyer l’impulsion.
   REMARQUE: Nous n’avons observé aucune électroporation hors cible lors de l’utilisation de ce protocole¹⁰. Seules les cellules en contact avec la pipette de verre pendant les cycles de pression ont été transfectées. Le positionnement de la pipette près d’autres neurones n’entraîne pas de transfection génétique.
6. Retirez délicatement la pipette à environ 100 μm de la cellule sans appliquer de pression.
7. Réappaucez la pression positive, en vérifiant que la résistance est similaire à la lecture enregistrée à l’étape 5.5, puis approchez-vous de la cellule suivante.
   1. Enlever les colbots potentiels, indiqués visuellement ou par une résistance significativement accrue (>15% plus élevée) de la pipette après électroporation, en appliquant une pression positive.
      REMARQUE: S’il n’y a pas de sabot visible et que la résistance est encore significativement plus élevée, jetez la pipette et utilisez-en une nouvelle. En moyenne, une pipette peut être utilisée pour un nombre allant jusqu’à 20 événements d’électroporation si l’utilisateur fait attention¹⁰.
8. Après l’électroporation, transférer la culture de tranches sur un insert de culture frais et incuber à 35 °C dans l’incubateur jusqu’à 3 jours.

7. Fixation, coloration et imagerie des cultures organotypiques de tranches d’hippocampe

1. Fixer des cultures de tranches organotypiques électroporées 2 à 3 jours après la transfection avec 4% de paraformaldéhyde et 4% de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate 0,01 M (1x PBS) pendant 1,5 h à température ambiante.
2. Retirer les tranches fixatrices et incuber dans 30% de saccharose dans un tampon phosphate 0,1 M (1x PB) pendant 2 h.
3. Placez les tranches sur un verre lame et congelez-les en plaçant le verre de la lame sur de la glace carbonique écrasée. Décongelez les tranches à température ambiante et transférez-les sur une plaque de 6 puits remplie de 1x PBS.
4. Colorer les tranches avec des anticorps anti-GFP de souris et anti-RFP de lapin dans un tampon GDB (gélatine à 0,1%, 0,3% Triton X-100, NaCl 450 mM et 32% 1x PB, pH 7,4) pendant 2 h à température ambiante.
5. Laver les tranches avec 1x PBS trois fois à température ambiante pendant 10 min chaque lavage.
6. Incuber des tranches avec de l’anticorps secondaire conjugué Alexa 488 anti-souris et de l’anticorps secondaire conjugué Alexa 594 anti-lapin dans un tampon GDB pendant 1 h à température ambiante. Incuber des tranches avec du DAPI (4 μg/mL) dans 1x PBS pendant 10 min à température ambiante.
7. Laver les tranches avec 1x PBS trois fois à température ambiante pendant 3 min chaque lavage.
8. Montez des tranches sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage et effectuez une imagerie par fluorescence.

Résultats

Notre électroporation unicellulaire est capable de délivrer avec précision des gènes dans des neurones excitateurs et inhibiteurs visuellement identifiés. Nous avons électroporé trois types de cellules neuronales différents à trois points de temps différents. La parvalbumine (Pv) ou les neurones exprimant le glutamate vésiculaire de type 3 (VGT3) ont été visualisés en croisant des lignes Pv^cre (JAX #008069) ou VGT3^cre (JAX #018147) avec tdTomato (une variante de la protéine fluorescen...

Discussion

Nous décrivons ici une méthode d’électroporation qui transfecte les neurones excitateurs et inhibiteurs avec l’efficacité et la précision élevées. Notre protocole d’électroporation optimisé comporte trois percées innovantes pour atteindre une transfection génétique hautement efficace. Notre première modification a été d’augmenter la taille de la pipette par rapport aux protocoles précédemment publiés^3,5,6.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710