אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.

Abstract

אלקטרופורציה ביססה את עצמה כשיטה קריטית להעברת גנים ספציפיים לתאים כדי להבין את תפקודם. כאן, אנו מתארים טכניקת אלקטרופורציה של תא יחיד שממקסמת את היעילות (~ 80%) של טרנספקטציה בגן במבחנה בנוירונים מעכבים מעוררים ומעמדיים בתרבות פרוסת ההיפוקמפוס האורגנוטיפית של העכבר. באמצעות אלקטרודות זכוכית גדולות, נוזל שדרתי מלאכותי המכיל טטרודוטוקסין ופולסים חשמליים קלים, העברנו גן מעניין לנוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס CA1 ואינטראורונים מעכבים. יתר על כן, אלקטרופורציה יכולה להתבצע בפרוסות היפוקמפוס בתרבית עד 21 ימים במבחנה ללא ירידה ביעילות transfection, המאפשרת מחקר של שלבים התפתחותיים שונים של תרבות פרוסה. עם העניין הגובר בבחינת הפונקציות המולקולריות של גנים על פני מגוון רחב של סוגי תאים, השיטה שלנו מדגימה גישה אמינה וישירה לתחילת הגנים במבחנה ברקמת מוח העכבר שניתן לבצע עם ציוד וטכניקות אלקטרופיזיולוגיות קיימות.

Introduction

בביולוגיה מולקולרית, אחד השיקולים החשובים ביותר לחוקר הוא כיצד להעביר גן של עניין לתא או לאוכלוסיית תאים כדי לברוח את תפקידו. שיטות המסירה השונות יכולות להיות מסווגות כביולוגיות (למשל, וקטור ויראלי), כימיות (למשל, סידן פוספט או שומנים), או פיזיות (למשל, אלקטרופורציה, מיקרו-הנדסה או ביוליסטית)^1,2. שיטות ביולוגיות יעילות מאוד ויכולות להיות ספציפיות לסוג התא אך מוגבלות על ידי פיתוח של כלים גנטיים ספציפיים. גישות כימיות הן חזקות מאוד במבחנה, אבל transfections הם בדרך כלל אקראיים; יתר על כן, גישות אלה שמורות בעיקר לתאים ראשיים בלבד. מתוך הגישות הפיזיות, הביוליסטיקה היא הפשוטה והקלה ביותר מבחינה טכנית, אך שוב מייצרת תוצאות טרנספקטיות אקראיות ביעילות נמוכה יחסית. עבור יישומים הדורשים העברה לתאים ספציפיים ללא צורך בפיתוח כלים גנטיים, אנו מסתכלים לכיוון אלקטרופורציה חד-תאית^3,4.

בעוד אלקטרופורציה המשמשת להתייחס רק אלקטרופורציה שדה, במהלך עשרים השנים האחרונות, פרוטוקולי אלקטרופורציה מרובים במבחנה ו in vivo חד תא פותחו כדי לשפר את הספציפיות ואת היעילות 5^,6,7, להוכיח כי electroporation יכול לשמש להעברת^גניםלתאים בודדים יכול, ולכן, להיות מדויק מאוד. עם זאת, ההליכים תובעניים מבחינה טכנית, גוזלים זמן רב ולא יעילים יחסית. ואכן, מאמרים עדכניים יותר חקרו את ההיתכנות של אסדות אלקטרופורציה ממוכנות^8,9, אשר יכול לעזור לחסל כמה מחסומים אלה לחוקרים המעוניינים להתקין רובוטיקה כזו. אבל עבור אלה המחפשים אמצעים פשוטים יותר, הבעיות עם אלקטרופורציה, כלומר מוות תאים, כשל transfection, וסתימת פיפטה, להישאר דאגה.

לאחרונה פיתחנו שיטת אלקטרופורציה המשתמשת בפיפטות זכוכית בעלות קצה גדול יותר, פרמטרים מתונים יותר של פעימות חשמליות, וצעד רכיבה על אופניים ייחודי בלחץ, שיצר יעילות transfection גבוהה בהרבה בתאי עצב מעוררים מאשר שיטות קודמות, ואיפשר לנו לראשונה להעביר גנים באינטראורונים מעכבים, כולל אינטראורונים מעכבים המבטאים סומטוסטטין באזור CA1 ההיפוקמפוס של תרבות פרוסת האורגנוטיפית של העכבר¹⁰. עם זאת, האמינות של שיטת אלקטרופורציה זו בסוגי פנימיות מעכבות שונות ושלבים התפתחותיים עצביים לא טופלה. כאן, הדגמנו שטכניקת אלקטרופורציה זו מסוגלת להעביר גנים הן לנוירונים מעוררים והן למעמדות שונים של אינטראורונים. חשוב לציין, יעילות טרנספקטו הייתה גבוהה ללא קשר לימים במבחנה (DIV) פרוסת גיל תרבות נבדק. טכניקה מבוססת וידידותית למשתמש זו מומלצת מאוד לכל חוקר המעוניין להשתמש באלקטרופורציה של תא יחיד לסוגי תאים שונים בהקשר של רקמת מוח של עכבר במבחנה.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס. הכנת תרבות פרוסה, הכנת פלסמיד ואלקטרופורציה מפורטים גם בשיטות שלנו שפורסמו בעבר וניתן להתייחס אליהם לקבלת מידע נוסף¹⁰.

1. הכנת תרבות פרוסה

1. הכן תרביות פרוסת היפוקמפוס אורגנוטיפית עכבר כפי שתואר בעבר¹¹, באמצעות עכברים לאחר הולדות 6- עד 7 ימים של כל מין.
   1. הכן מדיה ביתור עבור תרבות פרוסה organotypic המורכב (ב mM): 238 סוכרוז, 2.5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄, ו 11 גלוקוז במים deionized, ולאחר מכן גז עם 5% CO₂/95% O₂ ל- pH של 7.4.
   2. הכן מדיה תרבית פרוסה organotypic המורכבת: 78.8% (v/v) נשר בינוני חיוני מינימלי, 20% (v/ v) סרום סוס, 17.9 מ"מ NaHCO₃, 26.6 mM גלוקוז, 2 M CaCl₂, 2 M MgSO₄, 30 mM HEPES, אינסולין (1 מיקרוגרם / מ"ל), ו 0.06 מ"מ חומצה אסקורבית, pH מותאם ל 7.3. התאימו את האוסמולאריות ל-310-330 אוסמול באמצעות אוסמומטר.
   3. לנתח היפוקמפי מתוך המוח כולו באמצעות שתי מריות, ולחתוך (400 מיקרומטר) באמצעות מסוק רקמה. הפרד פרוסות באמצעות שני מלקחיים והעבר לתרביות תאים של 30 מ"מ בצלחת 6 היטב מלאה במדיה תרבותית (950 μL) מתחת לתוספות.
2. אחסנו תרביות פרוסות אורגנוטיפיות באינקובטור תרבית רקמות (35 מעלות צלזיוס, 5% CO₂₎ושנו את מדיית תרבות הפרוסה כל יומיים.

2. הכנת פלסמיד

1. הכן את הפלסמיד לגן העניין.
   1. גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) של תת-קלון לווקטור pCAG.
   2. לטהר pCAG-EGFP plasmid עם ערכת טיהור ללא אנדוטוקסין להתמוסס בתמיסה פנימית המורכבת מים מטופלים דיאתיל pyrocarbonate המכיל 140 mM K-מתנסולפונט, 0.2 מ"מ EGTA, 2 מ"מ MgCl₂, ו 10 mM HEPES, מותאם pH 7.3 עם KOH (ריכוז plasmid: 0.1 μg / μL).

3. הכנת פיפטה מזכוכית

1. משכו פיפטות זכוכית בורוסיליקט (4.5 – 8 MΩ) על פולר מיקרופיפט(איור 1A).
   הערה: צינורות הזכוכית המשמשים להקלטות מהדק תיקון של תאים שלמים אידיאליים לאלקטרופורציה.
2. אופים פיפטות זכוכית למשך הלילה ב-200 מעלות צלזיוס כדי לעקר.
3. בדוק את גודל קצה הפיפטה תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי להעריך את ההתנגדות החשמלית.
   1. אופציונלי:אמת עמידות פיפטה על ידי חיבור הפיפטה לאלקטרודה אלקטרופורציה והשתמש במיקרו-מניפולטור כדי לתמרן את קצה הפיפטה לנוזל השדרתי המלאכותי המעוקר במסנן (aCSF) המכיל (ב- mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ ו- 11 גלוקוז במים דה-יונים, בגז עם 5% CO₂/95% O₂ ל- pH של 7.4. אשר את ההתנגדות בפועל באמצעות הקריאה על האלקטרופורטור.
      הערה: ככל שקצה הפיפטה חד יותר, כך ההתנגדות החשמלית גדולה יותר. התנגדות הפיפטה צריכה להיות מתחת ל-10 MΩ. פיפטות זכוכית עם עמידות גבוהה לפיפטה(איור 1B)סותמות לעתים קרובות בקצה במהלך אלקטרופורציה חוזרת ונשנית.

4. התקנת אסדת אלקטרופורציה

1. התקן את האלקטרופורטור לאסדת אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטית של תאים שלמים, המצוידת במיקרוסקופ זקוף המותקן על שולחן משתנה עם מיקרו-מניפולטור ומשאבה פריסטרלית.
2. התקן את הבמה של האלקטרופורטור על מיקרו-מניפולטור וחבר זוג רמקולים לאלקטרופורטור. חבר את האלקטרופורטור לדוושת רגל שניתן להשתמש בה כדי לשלוח דופק כאשר הוא מוכן.
   הערה: הרמקולים פולטים צליל כאשר הם מופעלים, המהווה אינדיקטור להתנגדות החשמלית באלקטרודה. זה מאפשר לקבוע שינויים יחסיים בהתנגדות מבלי למשוך תשומת לב מההליך.

5. הכנת אלקטרופורציה

1. מעבירים את תרבות הפרוסה מ-6 צלחות באר ל-3 ס"מ של מנות פטרי עמוסות ב-900 μL של מדיה תרבותית ומאחסנים בחממה CO₂ שולחן עד שמוכנה לביצוע אלקטרופורציה.
   1. מראש תוסיפי תרבות טרייה עם מדיה של תרבות פרוסות (1 מ"ל) למשך 30 דקות לפחות בצלחת פטרי 3.5 ס"מ לפרוסות תרבות לאחר אלקטרופורציה.
2. לנקות ולהכין את האסדה לאלקטרופורציה.
   1. לשוטט את הקווים עם 10% אקונומיקה במשך 5 דקות כדי לעקר את הצינורות ואת התא לפני תחילת הניסוי במשך היום.
   2. לטפטף את הקווים עם מים autoclaved deionized במשך 30 דקות לפחות לשטוף לחלוטין.
   3. תחדיר את הקווים עם aCSF מעוקר מסנן המכיל 0.001 mM tetrodotoxin (TTX).
      הערה: TTX ממזער רעילות תאית ומוות עקב ניסיון יתר של interneurons¹⁰.
3. הגדר את פרמטרי הדופק של האלקטרופורטור: משרעת של -5 V, פעימה מרובעת, רכבת של 500 אלפיות שני, תדירות של 50 הרץ ורוחב דופק של 500 מיקרו.
4. מלא פיפטה זכוכית עם 5 μL של פתרון פנימי המכיל plasmid.
   1. הסר את כל בועות האוויר הלכודות מקצה הפיפטה על-ידי הבהוב והקשה עדינה על הקצה מספר פעמים.
   2. בדוק את הקצה עבור נזק על ידי הדמייתו תחת מיקרוסקופ ניתוח או על ידי חזרה על שלב 3.3.1 כדי לבדוק את התנגדות pipette.
      הערה: אם הקצה פגום, יש להשליך את פיפטת הזכוכית, ויש לחזור על שלב זה עם פיפטת זכוכית חדשה שהוכנה בעבר בשלב 3.
5. חברו את קצה הפיפטה לאלקטרודה והדליקו את הרמקולים. הקלט את הקריאה (ההתנגדות של pipette) של אלקטרופורטור כאשר הקצה יצר קשר עם מדיום aCSF.
6. חותכים את הממברנה התרבותית באמצעות להב חד ומבודדים תרבית פרוסה אחת. מעבירים בזהירות את תרבות הפרוסה לתא האלקטרופורציה באמצעות מלקחיים חדים בזווית ומתקנים את מיקומה עם עוגן פרוסה.
   1. אין לשמור את תרבות הפרוסה מחוץ לאינקובטור במשך יותר מ -30 דקות בכל פעם כדי למנוע תופעות לוואי כגון שינויים בבריאות העצבית או פונקציה¹².

6. תאי אלקטרופוראט מעניינים

1. יש להפעיל לחץ חיובי על הפיפטה בפה או באמצעות מזרק של 1 מ"ל (לחץ של 0.2 - 0.5 מ"ל) המחובר לצינורות.
2. השתמש בבקרות הידית התלת מימדיות של המיקרו-מניפולטור כדי לתמרן את קצה הפיפטה ליד פני השטח של תרבות הפרוסה.
3. בחר תא יעד והתקרב אליו, תוך שמירה על הלחץ החיובי המופעל עד שנוצרת גומה על משטח התא, הנראית על המיקרוסקופ.
4. בצע מחזורי לחץ.
   1. במהירות להחיל לחץ שלילי מתון על ידי הפה, כך חותם רופף צורות בין קצה pipette לבין קרום הפלזמה, המצוין חזותית על ידי הממברנה עולה לתוך קצה פיפטה במקצת. שים לב לעלייה (~ 2.5x ההתנגדות הראשונית) בהתנגדות pipette על ידי האזנה לעלייה בטון מגיע מהרמקולים. יש להפעיל מחדש במהירות לחץ חיובי כך שגומות הגומה ייווצרו מחדש.
   2. מיד להשלים לפחות שני מחזורי לחץ נוספים ללא הפסקה, ולאחר מכן להחזיק לחץ שלילי עבור 1 s.
      הערה: השהייה בין מחזורים, הפעלת לחץ רב מדי, או החזקת הלחץ השלילי במשך זמן רב מדי יכול לגרום נזק משמעותי לתא ואולי לגרום לתא למות במהלך electroporation.
5. פעמו במהירות את האלקטרופורטור פעם אחת באמצעות דוושת כף הרגל כאשר הטון מהרמקולים מגיע לשיא יציב בגובה המגרש, המציין התנגדות חשמלית שיא. אין להמתין בהתנגדות השיא במשך יותר מ 1 s לפני שליחת הדופק.
   הערה: לא ראינו אלקטרופורציה מחוץ למטרה בעת שימוש בפרוטוקול זה¹⁰. רק התאים במגע עם פיפטת הזכוכית במהלך מחזורי לחץ הועברו. מיקום הפיפטה ליד נוירונים אחרים אינו גורם להדבקת גנים.
6. בעדינות לסגת את pipette כ 100 מיקרומטר מהתא מבלי להפעיל לחץ.
7. הפעל מחדש לחץ חיובי, ודא שההתנגדות דומה לקריאה המוקלטת בשלב 5.5, ולאחר מכן התקרב לתא הבא.
   1. הסר קבקבים פוטנציאליים, המצוין חזותית או על ידי התנגדות פיפטה מוגברת באופן משמעותי (>15% לאחר אלקטרופורציה, על ידי הפעלת לחץ חיובי.
      הערה: אם אין סתימה גלויה וההתנגדות עדיין גבוהה משמעותית, השלך את הפיפטה והשתמש בצינור חדש. בממוצע, pipette יכול לשמש עד 20 אירועי אלקטרופורציה אם המשתמש זהיר¹⁰.
8. לאחר אלקטרופורציה, להעביר את תרבות הפרוסה על תוספת תרבות טרי, ודגור ב 35 מעלות צלזיוס באינקובטור עד 3 ימים.

7. קיבעון, הכתמה והדמיה של תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות

1. לתקן תרביות פרוסה אורגנוטיפית אלקטרופורציה 2 – 3 ימים לאחר transfection עם 4% paraformaldehyde ו 4% סוכרוז 0.01 M תמיסת מלח חוצץ פוספט (1x PBS) עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
2. הסר פרוסות קבועות ודגרה ב 30% סוכרוז במאגר פוספט 0.1 M (1x PB) במשך 2 שעות.
3. מניחים פרוסות על שקופית ומקפיאים אותן על ידי הצבת זכוכית השקופית על גבי קרח יבש כתוש. מפשירים את הפרוסות בטמפרטורת החדר ומעבירים אותן לצלחת 6 היטב מלאה ב- PBS 1x.
4. הכתימו את הפרוסות בנוגדנים נגד עכברים נגד GFP וארנבות נגד RFP במאגר GDB (0.1% ג'לטין, 0.3% טריטון X-100, 450 מ"מ NaCl ו-32% 1x PB, pH 7.4) למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף פרוסות עם 1x PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כל לשטוף.
6. דגירה פרוסות עם נוגדן משני נגד עכבר אלכסה 488-מצומד אנטי ארנב אלכסה 594-מצומד חיץ GDB עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. דגירה פרוסות עם DAPI (4 מיקרוגרם / מ"ל) ב 1x PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
7. לשטוף פרוסות עם 1x PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות כל לשטוף.
8. הרכב פרוסות על שקופיות זכוכית באמצעות בינוני הרכבה ולבצע הדמיה פלואורסצנטית.

תוצאות

האלקטרופורציה החד-תאית שלנו מסוגלת להעביר גנים בדיוק לנוירונים מעוררים ומעכבים שזוהו חזותית. עברנו אלקטרופורנציה של שלושה סוגי תאים עצביים שונים בשלוש נקודות זמן שונות. Parvalbumin (Pv) או ארסקולי גלוטמט סוג 3 (VGT3) ביטוי נוירונים היו דמיינו על ידי חציית Pv^cre (JAX #008069) או VGT3^cre (JAX #018147) קווי?...

Discussion

אנו מתארים כאן שיטת אלקטרופורציה המעבירה נוירונים מעוררים ומעכבים ביעילות ודיוק גבוהים. פרוטוקול האלקטרופורציה הממוטב שלנו כולל שלוש פריצות דרך חדשניות להשגת עבירות גנים יעילות ביותר. השינוי הראשון שלנו היה להגדיל את גודל הפיפטה בהשוואה לפרוטוקולים שפורסמו בעבר^3,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710