Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für die Einzelzellelektroporation vorgestellt, das Gene sowohl in exzitatorischen als auch in inhibitorischen Neuronen über eine Reihe von In-vitro-Hippocampus-Schichtkulturaltern hinweg liefern kann. Unser Ansatz bietet eine präzise und effiziente Expression von Genen in einzelnen Zellen, mit denen zellautonome und interzelluläre Funktionen untersucht werden können.

Zusammenfassung

Die Elektroporation hat sich als kritische Methode etabliert, um bestimmte Gene in Zellen zu übertragen, um ihre Funktion zu verstehen. Hier beschreiben wir eine Einzelzell-Elektroporationstechnik, die die Effizienz (~ 80%) der In-vitro-Gentransfektion in exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen in organotypischer Hippocampus-Slice-Kultur von Mäusen maximiert. Mit großen Glaselektroden, Tetrodotoxin-haltiger künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit und milden elektrischen Impulsen lieferten wir ein interessantes Gen in kultivierte Hippocampus-CA1-Pyramidenneuronen und inhibitorische Interneuronen. Darüber hinaus konnte die Elektroporation in kultivierten Hippocampus-Scheiben bis zu 21 Tage in vitro ohne Verringerung der Transfektionseffizienz durchgeführt werden, was die Untersuchung unterschiedlicher Entwicklungsstadien der Scheibenkultur ermöglichte. Mit wachsendem Interesse an der Untersuchung der molekularen Funktionen von Genen in einer Vielzahl von Zelltypen zeigt unsere Methode einen zuverlässigen und unkomplizierten Ansatz für die In-vitro-Gentransfektion im Gehirngewebe von Mäusen, der mit vorhandenen elektrophysiologischen Geräten und Techniken durchgeführt werden kann.

Einleitung

In der Molekularbiologie ist eine der wichtigsten Überlegungen für einen Forscher, wie man ein Gen von Interesse in eine Zelle oder Zellpopulation liefert, um seine Funktion aufzuklären. Die verschiedenen Verabreichungsmethoden können entweder als biologisch (z. B. ein viraler Vektor), chemisch (z. B. Calciumphosphat oder Lipid) oder physikalisch (z. B. Elektroporation, Mikroinjektion oder Biolistik)^1,2kategorisiert werden. Biologische Methoden sind hocheffizient und können zelltypspezifisch sein, sind aber durch die Entwicklung spezifischer genetischer Werkzeuge begrenzt. Chemische Ansätze sind in vitro sehr leistungsfähig, aber Transfektionen sind im Allgemeinen zufällig; Darüber hinaus sind diese Ansätze meist nur Primärzellen vorbehalten. Von den physikalischen Ansätzen ist die Biolistik aus technischer Sicht die einfachste und einfachste, produziert aber wiederum zufällige Transfektionsergebnisse mit einer relativ geringen Effizienz. Für Anwendungen, die den Transfer in bestimmte Zellen erfordern, ohne dass genetische Werkzeuge entwickelt werden müssen, schauen wir uns die Einzelzellelektroporation^{an 3,4}.

Während sich die Elektroporation früher nur auf die Feldelektroporation bezog, wurden in den letzten zwanzig Jahren mehrere in vitro und in vivo Einzelzellelektroporationsprotokolle entwickelt, um die Spezifität und Effizienz zu verbessern^5,6,7, die zeigen, dass die Elektroporation verwendet werden kann, um Gene auf einzelne Zellen zu übertragen und daher äußerst präzise sein kann. Die Verfahren sind jedoch technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig und relativ ineffizient. In der Tat haben neuere Arbeiten die Machbarkeit von mechanisierten Elektroporationsrigs⁸,^9untersucht,die dazu beitragen können, mehrere dieser Barrieren für Forscher zu beseitigen, die an der Installation solcher Robotik interessiert sind. Aber für diejenigen, die nach einfacheren Mitteln suchen, bleiben die Probleme mit der Elektroporation, nämlich Zelltod, Transfektionsversagen und Pipettenverstopfung, ein Problem.

Wir haben kürzlich eine Elektroporationsmethode entwickelt, die größere Glaspipetten, mildere elektrische Pulsparameter und einen einzigartigen Druckzyklusschritt verwendet, der eine viel höhere Transfektionseffizienz in exzitatorischen Neuronen erzeugte als frühere Methoden und es uns zum ersten Mal ermöglichte, Gene in inhibitorischen Interneuronen zu transfizieren, einschließlich somatostatin-exprimierender inhibitorischer Interneuronen in der Hippocampus-CA1-Region der organotypischen Scheibenkultur der Maus¹⁰. Die Zuverlässigkeit dieser Elektroporationsmethode in verschiedenen inhibitorischen Interneurontypen und neuronalen Entwicklungsstadien wurde jedoch nicht untersucht. Hier haben wir gezeigt, dass diese Elektroporationstechnik in der Lage ist, Gene sowohl in exzitatorische Neuronen als auch in verschiedene Klassen von Interneuronen zu transfizieren. Wichtig ist, dass die Transfektionseffizienz unabhängig von den getesteten Tagen in vitro (DIV) Scheibenkultur hoch war. Diese etablierte und benutzerfreundliche Technik wird jedem Forscher empfohlen, der daran interessiert ist, die Einzelzellelektroporation für verschiedene Zelltypen im Zusammenhang mit In-vitro-Mausgehirngewebe zu verwenden.

Protokoll

Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Massachusetts Medical School überprüft und genehmigt. Scheibenkulturvorbereitung, Plasmidvorbereitung und Elektroporation sind ebenfalls in unseren zuvor veröffentlichten Methoden detailliert beschrieben und können für zusätzliche Informationen¹⁰erwähnt werden.

1. Zubereitung der Scheibenkultur

1. Bereiten Sie organotypische Hippocampus-Scheibenkulturen der Maus wie zuvor beschrieben¹¹vor, wobei postnatale 6 bis 7 Tage alte Mäuse beiderlei Geschlechts verwendet werden.
   1. Präpariermittel für die organotypische Scheibenkultur bestehend aus (in mM): 238 Saccharose, 2,5 KCl, 1_CaCl2,4_MgCl2,26 NaHCO3, 1_NaH2PO4und 11 Glucose in entionisiertem Wasser, dann Gas mit 5%_CO2/95% O2 bis zu_einem pH-Wert von 7,4.
   2. Organotypische Scheibenkulturmedien werden hergestellt, bestehend aus: 78,8% (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, 20% (v/v) Pferdeserum, 17,9 mM NaHCO_3,26,6 mM Glucose, 2 M CaCl_2,2 M MgSO_4,30 mM HEPES, Insulin (1 μg/ml) und 0,06 mM Ascorbinsäure, pH-Wert auf 7,3 eingestellt. Stellen Sie die Osmolarität mit einem Osmometer auf 310-330 Osmol ein.
   3. Sezieren Sie Hippocampi aus dem gesamten Gehirn, indem Sie zwei Spatel verwenden, und schneiden Sie (400 μm) mit einem Gewebehäcksler. Trennen Sie die Scheiben mit zwei Zinnen und geben Sie sie auf 30 mm Zellkultureinsätze in einer 6-Well-Platte, die mit Nährmedien (950 μL) unter den Einsätzen gefüllt ist.
2. Lagern Sie organotypische Scheibenkulturen in einem Gewebekultur-Inkubator (35°C, 5% CO₂₎und wechseln Sie die Scheibenkulturmedien alle zwei Tage.

2. Plasmidpräparation

1. Bereiten Sie das Plasmid für das interessierende Gen vor.
   1. Subclone enhanced green fluorescent protein (EGFP) Gen in einen pCAG-Vektor.
   2. Reinigen Sie das pCAG-EGFP-Plasmid mit einem endotoxinfreien Reinigungskit und lösen Sie es in einer internen Lösung auf, die aus mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser besteht, das 140 mM K-Methansulfonat, 0,2 mM EGTA, 2 mM_MgCl2und 10 mM HEPES enthält, eingestellt auf pH 7,3 mit KOH (Plasmidkonzentration: 0,1 μg/μL).

3. Glaspipettenvorbereitung

1. Ziehen Sie Borosilikatglaspipetten (4,5 – 8 MΩ) auf einem Mikropipettenzieher (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Die Glaspipetten, die für Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufnahmen verwendet werden, sind ideal für die Elektroporation.
2. Glaspipetten über Nacht bei 200°C backen, um sie zu sterilisieren.
3. Überprüfen Sie die Größe der Pipettenspitze unter einem Seziermikroskop, um den elektrischen Widerstand anzunähern.
   1. Optional:Überprüfen Sie den Pipettenwiderstand, indem Sie die Pipette an der Elektroporationselektrode befestigen und den Mikromanipulator verwenden, um die Pipettenspitze in filtersterilisierte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) zu manövrieren, die (in mM) enthält: 119 NaCl,_2,5KCl, 0,5 CaCl2, 5_MgCl2,26 NaHCO_3,1 NaH2PO4 und 11 Glucose in entionisiertem Wasser, vergast mit 5%_CO2/95%_O2 bis zu einem pH-Wert von 7,4. Bestätigen Sie den tatsächlichen Widerstand mit der Ablesung am Elektroporator.
      HINWEIS: Je schärfer die Pipettenspitze, desto größer der elektrische Widerstand. Der Pipettenwiderstand sollte unter 10 MΩ liegen. Glaspipetten mit hohem Pipettenwiderstand (Abbildung 1B) verstopfen bei wiederholter Elektroporation oft an der Spitze.

4. Einrichtung der Elektroporationsanlage

1. Installieren Sie den Elektroporator in einem Standard-Ganzzellen-Elektrophysiologie-Rig, das mit einem aufrechten Mikroskop ausgestattet ist, das auf einem Schalttisch mit einem Mikromanipulator und einer Peristaltikpumpe montiert ist.
2. Installieren Sie die Kopfbühne des Elektroporators auf einem Mikromanipulator und verbinden Sie ein Paar Lautsprecher mit dem Elektroporator. Verbinden Sie den Elektroporator mit einem Fußpedal, mit dem bei Bereitschaft ein Impuls gesendet werden kann.
   HINWEIS: Die Lautsprecher geben beim Einschalten einen Ton ab, der einen Indikator für den elektrischen Widerstand an der Elektrode ist. Dies ermöglicht es, relative Widerstandsänderungen zu bestimmen, ohne die Aufmerksamkeit vom Verfahren abzuwenden.

5. Elektroporationsvorbereitung

1. Übertragen Sie die Scheibenkultureinsätze von 6 Well-Platten auf 3 cm Petrischalen, die mit 900 μL Nährmedien beladen sind, und lagern Sie sie in_einem CO 2-Inkubator auf der Tischplatte, bis sie zur Elektroporation bereit sind.
   1. Frische Kultureinsätze mit Scheibenkulturmedien (1 ml) für mindestens 30 min in einer 3,5 cm Petrischale zu Kulturscheiben nach der Elektroporation vorbestellen.
2. Reinigen und bereiten Sie das Rig für die Elektroporation vor.
   1. Durchseuchen Sie die Linien mit 10% Bleichmittel für 5 Minuten, um den Schlauch und die Kammer zu sterilisieren, bevor Sie mit dem Experiment für den Tag beginnen.
   2. Die Leitungen mindestens 30 Minuten lang mit entionisiertem autoklaviertem Wasser durchträgen, um sie vollständig abzuspülen.
   3. Durchtuchen Sie die Leitungen mit filtersterilisiertem aCSF, das 0,001 mM Tetrodotoxin (TTX) enthält.
      HINWEIS: TTX minimiert die zelluläre Toxizität und den Tod durch Übererregung der Interneuronen¹⁰.
3. Stellen Sie die Pulsparameter des Elektroporators ein: Amplitude von –5 V, quadratischer Impuls, Zug von 500 ms, Frequenz von 50 Hz und eine Pulsbreite von 500 μs.
4. Glaspipette mit 5 μL plasmidhaltiger Innenlösung füllen.
   1. Entfernen Sie alle eingeschlossenen Luftblasen von der Pipettenspitze, indem Sie mehrmals streichen und vorsichtig auf die Spitze tippen.
   2. Überprüfen Sie die Spitze auf Beschädigungen, indem Sie sie unter einem Dissektionsmikroskop visualisieren oder Schritt 3.3.1 wiederholen, um den Pipettenwiderstand zu überprüfen.
      HINWEIS: Wenn die Spitze beschädigt ist, muss die Glaspipette entsorgt werden, und dieser Schritt muss mit einer neuen Glaspipette wiederholt werden, die zuvor in Schritt 3 vorbereitet wurde.
5. Befestigen Sie die Pipettenspitze sicher an der Elektrode und schalten Sie die Lautsprecher ein. Notieren Sie die Auslesung (den Widerstand der Pipette) des Elektroporators, wenn die Spitze mit dem aCSF-Medium in Kontakt gekommen ist.
6. Schneiden Sie die Kultureinsatzmembran mit einer scharfen Klinge ab und isolieren Sie eine Scheibenkultur. Übertragen Sie die Scheibenkultur vorsichtig mit einer scharf abgewinkelten Schärfe in die Elektroporationskammer und fixieren Sie ihre Position mit einem Scheibenanker.
   1. Halten Sie die Scheibenkultur nicht mehr als 30 Minuten am Stück außerhalb des Inkubators, um Nebenwirkungen wie Veränderungen der neuronalen Gesundheit oder Funktion zu vermeiden¹².

6. Elektropulverzellen von Interesse

1. Drücken Sie mit dem Mund oder mit einer 1-ml-Spritze (0,2 - 0,5 ml Druck), die am Schlauch befestigt ist, auf die Pipette.
2. Verwenden Sie die 3-dimensionalen Knopfsteuerungen des Mikromanipulators, um die Pipettenspitze in der Nähe der Oberfläche der Scheibenkultur zu manövrieren.
3. Wählen Sie eine Zielzelle und nähern Sie sich ihr, wobei der übermässige Druck ausgeübt wird, bis sich ein Grübchen auf der Zelloberfläche bildet, das auf dem Mikroskop sichtbar ist.
4. Führen Sie Druckzyklen durch.
   1. Schnell leichten Unterdruck durch den Mund ausüben, so dass sich zwischen der Pipettenspitze und der Plasmamembran eine lose Versiegelung bildet, die optisch durch die Membran angezeigt wird, die etwas in die Pipettenspitze hinaufgeht. Beobachten Sie eine Erhöhung (~ 2,5x des Anfangswiderstands) des Pipettenwiderstands, indem Sie auf eine Tonerhöhung von den Lautsprechern hören. Wenden Sie schnell wieder Überdruck an, damit sich der Grübchen neu bildet.
   2. Schließen Sie sofort mindestens zwei weitere Druckzyklen ohne Pause ab und halten Sie dann den Unterdruck für 1 s.
      HINWEIS: Eine Pause zwischen den Zyklen, zu viel Druck oder zu langes Halten des Unterdrucks kann zu erheblichen Zellschäden führen und möglicherweise dazu führen, dass die Zelle während der Elektroporation stirbt.
5. Pulsieren Sie den Elektroporator schnell mit dem Fußpedal, wenn der Ton der Lautsprecher einen stabilen Scheitelpunkt in der Tonhöhe erreicht, was den maximalen elektrischen Widerstand anzeigt. Warten Sie nicht länger als 1 s am Spitzenwiderstand, bevor Sie den Impuls senden.
   HINWEIS: Wir haben bei Verwendung dieses Protokolls¹⁰keine Off-Target-Elektroporation beobachtet. Nur die Zellen, die während der Druckzyklen mit der Glaspipette in Kontakt kamen, wurden transfiziert. Die Positionierung der Pipette in der Nähe anderer Neuronen führt nicht zu einer Gentransfektion.
6. Ziehen Sie die Pipette vorsichtig ca. 100 μm aus der Zelle zurück, ohne Druck auszuüben.
7. Wenden Sie erneut einen positiven Druck an, um sicherzustellen, dass der Widerstand dem aufgezeichneten Auslesen in Schritt 5.5 ähnelt, und nähern Sie sich dann der nächsten Zelle.
   1. Entfernen Sie potenzielle Verstopfungen, die visuell oder durch einen signifikant erhöhten (>15% höheren) Pipettenwiderstand nach der Elektroporation angezeigt werden, indem Sie einen positiven Druck ausüben.
      HINWEIS: Wenn es keine sichtbare Verstopfung gibt und der Widerstand immer noch deutlich höher ist, entsorgen Sie die Pipette und verwenden Sie eine neue. Im Durchschnitt kann eine Pipette für bis zu 20 Elektroporationsereignisse verwendet werden, wenn der Benutzer vorsichtig ist¹⁰.
8. Nach der Elektroporation die Scheibenkultur auf einen frischen Kultureinsatz übertragen und bei 35°C im Inkubator bis zu 3 Tage inkubieren.

7. Fixierung, Färbung und Bildgebung von organotypischen Hippocampus-Scheibenkulturen

1. Elektroporierte organotypische Scheibenkulturen 2 – 3 Tage nach der Transfektion mit 4% Paraformaldehyd und 4% Saccharose in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) für 1,5 h bei Raumtemperatur fixieren.
2. Fixiermittel entfernen und Scheiben in 30% Saccharose in 0,1 M Phosphatpuffer (1x PB) für 2 h inkubieren.
3. Legen Sie die Scheiben auf ein Diaglas und frieren Sie sie ein, indem Sie das Diaglas auf zerkleinertes Trockeneis legen. Die Scheiben bei Raumtemperatur auftauen und auf eine 6-Well-Platte geben, die mit 1x PBS gefüllt ist.
4. Die Scheiben mit Maus-Anti-GFP- und Kaninchen-Anti-RFP-Antikörpern in GDB-Puffer (0,1% Gelatine, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl und 32% 1x PB, pH 7,4) für 2 h bei Raumtemperatur einfärben.
5. Waschen Sie die Scheiben mit 1x PBS dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 10 min.
6. Inkubieren Sie Scheiben mit Anti-Maus Alexa 488-konjugiertem sekundären Antikörper und Anti-Kaninchen Alexa 594-konjugiertem sekundären Antikörper im GDB-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie Scheiben mit DAPI (4 μg/ml) in 1x PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
7. Waschen Sie die Scheiben mit 1x PBS dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 3 min.
8. Montieren Sie Scheiben mit einem Montagemedium auf Glasobjektträgern und führen Sie eine Fluoreszenzbildgebung durch.

Ergebnisse

Unsere Einzelzellelektroporation ist in der Lage, Gene präzise in visuell identifizierte exzitatorische und hemmende Neuronen zu liefern. Wir haben drei verschiedene neuronale Zelltypen zu drei verschiedenen Zeitpunkten elektroporiert. Parvalbumin (Pv) oder vesikuläre Glutamat Typ 3 (VGT3) exprimierende Neuronen wurden visualisiert, indem Pv^cre (JAX #008069) oder VGT3^cre (JAX #018147) Linien mit TdTomato (eine Variante des rot fluoreszierenden Proteins) Reporterlinie (Jax #007905) überquert wurde...

Diskussion

Wir beschreiben hier eine Elektroporationsmethode, die sowohl exzitatorische als auch hemmende Neuronen mit hoher Effizienz und Präzision transfiziert. Unser optimiertes Elektroporationsprotokoll verfügt über drei innovative Durchbrüche, um eine hocheffiziente Gentransfektion zu erreichen. Unsere erste Modifikation bestand darin, die Pipettengröße im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten Protokollen^3,5,^6zuerhöhen. Dies...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710