Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Resumo

A eletroporação estabeleceu-se como um método crítico para transferir genes específicos para as células para entender sua função. Aqui, descrevemos uma técnica de eletroporação unicelular que maximiza a eficiência (~80%) da transfesão genética in vitro em neurônios inibitórios excitatórios e específicos de classe na cultura de fatia hipocampal organotipada do camundongo. Usando grandes eletrodos de vidro, fluido cerebrospinal artificial contendo tetrodotoxina e pulsos elétricos leves, entregamos um gene de interesse em neurônios piramimatais de CA1 hipocampal e interneurônios inibitórios. Além disso, a eletroporação poderia ser realizada em fatias hipocampais cultivadas até 21 dias in vitro sem redução na eficiência da transfecção, permitindo o estudo de diferentes estágios de desenvolvimento da cultura de fatias. Com o interesse crescente em examinar as funções moleculares dos genes em uma variedade diversificada de tipos celulares, nosso método demonstra uma abordagem confiável e direta para a transfecção genética in vitro no tecido cerebral do camundongo que pode ser realizada com equipamentos e técnicas de eletrofisiologia existentes.

Introdução

Na biologia molecular, uma das considerações mais importantes para um pesquisador é como entregar um gene de interesse em uma célula ou população de células para elucidar sua função. Os diferentes métodos de parto podem ser categorizados como biológicos (por exemplo, um vetor viral), químicos (por exemplo, fosfato de cálcio ou lipídico) ou físicos (por exemplo, eletroporação, microinjeção ou biolística)^1,2. Os métodos biológicos são altamente eficientes e podem ser específicos do tipo celular, mas são limitados pelo desenvolvimento de ferramentas genéticas específicas. Abordagens químicas são muito poderosas in vitro, mas transfecções são geralmente aleatórias; além disso, essas abordagens são principalmente reservadas apenas para células primárias. Das abordagens físicas, a biolística é a mais simples e fácil do ponto de vista técnico, mas novamente produz resultados aleatórios de transfecção com uma eficiência relativamente baixa. Para aplicações que requerem transferência para células específicas sem a necessidade de desenvolver ferramentas genéticas, buscamos eletroporação unicelular^3,4.

Considerando que a eletroporação usada para se referir apenas à eletroporação de campo, nos últimos vinte anos, vários protocolos de eletroporação unicelular in vitro e in vivo foram desenvolvidos para melhorar a especificidade e eficiência^5,6,7, demonstrando que a eletroporação pode ser usada para transferir genes para células individuais e pode, portanto, ser extremamente precisa. No entanto, os procedimentos são tecnicamente exigentes, demorados e relativamente ineficientes. De fato, trabalhos mais recentes têm investigado a viabilidade das plataformas de eletroporação mecanizadas^8,9, que podem ajudar a eliminar várias dessas barreiras para pesquisadores interessados em instalar tal robótica. Mas para aqueles que procuram meios mais simples, os problemas com eletroporação, ou seja, morte celular, falha de transfecção e entupimento de pipetas, permanecem uma preocupação.

Recentemente desenvolvemos um método de eletroporação que usa pipetas de vidro de ponta maior, parâmetros de pulso elétrico mais suaves e uma etapa de ciclismo de pressão única, que gerou uma eficiência de transfeção muito maior em neurônios excitatórios do que os métodos anteriores, e nos permitiu pela primeira vez transfectar genes em interneurônios inibitórios, incluindo interneurônios inibidores expressivos na região hipocampal ca1 da cultura organotipica do rato¹⁰. No entanto, a confiabilidade deste método de eletroporação em diferentes tipos inibitórios e estágios de desenvolvimento neuronal não foi abordada. Aqui, demonstramos que essa técnica de eletroporação é capaz de transfetar genes tanto em neurônios excitatórios quanto em diferentes classes de interneurônios. É importante ressaltar que a eficiência da transfecção foi alta independentemente dos dias in vitro (DIV) da idade da cultura da fatia testada. Esta técnica estabelecida e fácil de usar é altamente recomendada para qualquer investigador interessado em usar eletroporação unicelular para diferentes tipos de células no contexto do tecido cerebral in vitro do rato.

Protocolo

Todos os protocolos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Massachusetts. A preparação da cultura de fatias, a preparação plasmida e a eletroporação também estão detalhadas em nossos métodos publicados anteriormente e podem ser encaminhadas para informações adicionais¹⁰.

1. Preparação para cultura de fatias

1. Prepare culturas de fatias hipocampais organotípicas do rato como descrito anteriormente¹¹, usando camundongos pós-natal de 6 a 7 dias de idade de ambos os sexos.
   1. Preparar a mídia de dissecção para a cultura de fatia organotipípica composta (em mM): 238 sacarose, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄, e 11 glicose em água desionizada, depois gás com 5% DE CO₂/95% O₂ a um pH de 7,4.
   2. Prepare a mídia de cultura de fatia organotipípica composta por: 78,8% (v/v) Águia Média Essencial Mínima, 20% (v/v) soro de cavalo, 17,9 mM NaHCO₃, 26,6 mM de glicose, 2 M CaCl₂, 2 M MgSO_4,30 mM HEPES, insulina (1 μg/mL) e 0,06 mM ácido ascórbico, pH ajustado para 7,3. Ajuste a osmolaridade para 310-330 osmol usando um osmômetro.
   3. Disseque hipocampi de todo o cérebro usando duas espátulas, e corte (400 μm) usando um helicóptero de tecido. Separe as fatias usando duas fórceps e transfira para inserções de cultura celular de 30 mm em uma placa de 6 poços cheia de mídia de cultura (950 μL) sob as pastilhas.
2. Armazene culturas de fatias organotipíticas em uma incubadora de cultura de tecidos (35°C, 5% CO₂) e mude a mídia de cultura de fatias a cada dois dias.

2. Preparação plasmid

1. Prepare o plasmídeo para o gene de interesse.
   1. Subclone aprimorou o gene da proteína fluorescente verde (EGFP) em um vetor pCAG.
   2. Purifique o plasmídeo pCAG-EGFP com um kit de purificação livre de endotoxinas e dissolva-se em uma solução interna que consiste em água tratada com pirocarbonato de dietilo contendo 140 mM K-metanosulfonato, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl₂e 10 mM HEPES, ajustado para pH 7.3 com KOH (concentração plasmida: 0,1 μg/μL).

3. Preparação de pipeta de vidro

1. Puxe pipetas de vidro borossilicato (4,5 – 8 MΩ) em um puxador de micropipette(Figura 1A).
   NOTA: As pipetas de vidro usadas para gravações de grampos de remendo de células inteiras são ideais para eletroporação.
2. Asse pipetas de vidro durante a noite a 200°C para esterilizar.
3. Verifique o tamanho da ponta da pipeta sob um microscópio de dissecção para aproximar a resistência elétrica.
   1. Opcional:Verifique a resistência da pipeta anexando a pipeta ao eletrodo de eletroporação e use o micromanipulador para manobrar a ponta da pipeta em fluido cerebrospinal artificial esterilizado por filtro (aCSF) contendo (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ e 11 glicose em água desionizada, gaseado com 5% de CO₂/95% O₂ a um pH de 7,4. Confirme a resistência real usando a leitura no eletroporador.
      NOTA: Quanto mais nítida a ponta da pipeta, maior a resistência elétrica. A resistência à pipeta deve estar abaixo de 10 MΩ. Pipetas de vidro com alta resistência à pipeta(Figura 1B) muitas vezes entupem na ponta durante a eletroporação repetida.

4. Configuração da plataforma de eletroporação

1. Instale o eletroporador em uma plataforma padrão de eletrofisiologia de células inteiras, equipada com um microscópio vertical montado em uma mesa de mudança com uma bomba micromanipuladora e peristáltica.
2. Instale o headstage do eletroporador em um micromanipulador e conecte um par de alto-falantes ao eletroporador. Conecte o eletroporador a um pedal de pé que pode ser usado para enviar um pulso quando estiver pronto.
   NOTA: Os alto-falantes emitem um tom quando ligados, que é um indicador da resistência elétrica no eletrodo. Isso permite determinar mudanças relativas na resistência sem afastar a atenção do procedimento.

5. Preparação para eletroporação

1. Transfira as pastilhas de cultura de fatias de 6 placas de poço para 3 cm de placas de Petri carregadas com 900 μL de mídia cultural e armazene em uma incubadora de CO₂ até estar pronta para realizar a eletroporação.
   1. Pré-inser em que a cultura fresca insira com meios de cultura fatia (1 mL) por pelo menos 30 min em uma placa de Petri de 3,5 cm para fatias de cultura após a eletroporação.
2. Limpe e prepare a plataforma para eletroporação.
   1. Perfunda as linhas com alvejante de 10% por 5 minutos para esterilizar o tubo e a câmara antes de iniciar o experimento para o dia.
   2. Perfumar as linhas com água autoclavada deionizada por pelo menos 30 minutos para enxaguar completamente.
   3. Perfunda as linhas com aCSF esterilizado por filtro contendo tetrodotoxina de 0,001 mM (TTX).
      NOTA: O TTX minimiza a toxicidade celular e a morte devido à superexcitação dos interneurons¹⁰.
3. Defina os parâmetros de pulso do eletroporador: amplitude de –5 V, pulso quadrado, trem de 500 ms, frequência de 50 Hz e uma largura de pulso de 500 μs.
4. Encha a pipeta de vidro com 5 μL de solução interna contendo plasmídeos.
   1. Remova quaisquer bolhas de ar presas da ponta da pipeta piscando e tocando suavemente a ponta várias vezes.
   2. Verifique se há danos na ponta visualizando-a sob um microscópio de dissecção ou repetindo o passo 3.3.1 para verificar a resistência da pipeta.
      NOTA: Se a ponta estiver danificada, a pipeta de vidro deve ser descartada, e esta etapa deve ser repetida com uma nova pipeta de vidro previamente preparada na etapa 3.
5. Conecte com segurança a ponta da pipeta ao eletrodo e ligue os alto-falantes. Registo a leitura (resistência da pipeta) do eletroporador quando a ponta tiver feito contato com o meio aCSF.
6. Corte a membrana de inserção de cultura usando uma lâmina afiada e isole uma cultura de fatia. Transfira cuidadosamente a cultura da fatia para a câmara de eletroporação usando fórceps angulares afiados e fixe sua posição com uma âncora de fatia.
   1. Não mantenha a cultura da fatia fora da incubadora por mais de 30 minutos de cada vez para evitar efeitos colaterais, como alterações na saúde neuronal ou função¹².

6. Células eletroporadas de interesse

1. Aplique pressão positiva na pipeta com boca ou usando uma seringa de 1 mL (pressão de 0,2 - 0,5 mL) presa à tubulação.
2. Use os controles de botão tridimensional do micromanipulador para manobrar a ponta da pipeta perto da superfície da cultura da fatia.
3. Escolha uma célula-alvo e aproxime-a, mantendo a pressão positiva aplicada até que uma covinha se forme na superfície da célula, visível no microscópio.
4. Realize ciclos de pressão.
   1. Aplique rapidamente uma leve pressão negativa pela boca de modo que uma vedação solta se forme entre a ponta da pipeta e a membrana plasmática, indicada visualmente pela membrana subindo um pouco na ponta da pipeta. Observe um aumento (~2,5x a resistência inicial) na resistência à pipeta ouvindo um aumento no tom proveniente dos alto-falantes. Aplice rapidamente a pressão positiva para que a covinha se reeme.
   2. Imediatamente complete pelo menos mais dois ciclos de pressão sem pausar, em seguida, mantenha pressão negativa para 1 s.
      NOTA: Pausar entre ciclos, aplicar muita pressão ou segurar a pressão negativa por muito tempo pode causar danos celulares significativos e possivelmente causar a morte da célula durante a eletroporação.
5. Pulso rápido do eletroporador uma vez usando o pedal do pé quando o tom dos alto-falantes atinge um ápice estável no tom, indicando pico de resistência elétrica. Não espere no pico de resistência por mais de 1 s antes de enviar o pulso.
   NOTA: Não observamos eletroporação fora do alvo ao usar este protocolo¹⁰. Apenas as células em contato com a pipeta de vidro durante os ciclos de pressão foram transfecidas. Posicionar a pipeta perto de outros neurônios não resulta em transfecção genética.
6. Retire suavemente a pipeta aproximadamente 100 μm da célula sem aplicar pressão.
7. Reaplousa a pressão positiva, verificando se a resistência é semelhante à leitura registrada na etapa 5.5 e, em seguida, aproxime-se da célula seguinte.
   1. Remova os potenciais tamancos, indicados visualmente ou por uma resistência significativa (>15% maior) à pipeta após a eletroporação, aplicando pressão positiva.
      NOTA: Se não houver entupimento visível e a resistência ainda for significativamente maior, descarte a pipeta e use uma nova. Em média, uma pipeta pode ser usada para até 20 eventos de eletroporação se o usuário tiver^{cuidado 10}.
8. Após a eletroporação, transfira a cultura da fatia para uma inserção de cultura fresca e incubar a 35°C na incubadora por até 3 dias.

7. Fixação, coloração e imagem de culturas de fatias hipocampais organotípicas

1. Fixar culturas de fatia organofíspica eletroporada 2 – 3 dias após a transfecção com 4% de paraformaldeído e 4% de sacarose em 0,01 M de salina tamponada de fosfato (1x PBS) por 1,5 h à temperatura ambiente.
2. Remova as fatias fixativas e incubadas em 30% de sacarose em 0,1 M tampão fosfato (1x PB) por 2 h.
3. Coloque fatias em um copo de slides e congele-as colocando o vidro de deslizamento em cima de gelo seco esmagado. Descongele as fatias em temperatura ambiente e transfira-as para uma placa de 6 poços cheia de 1x PBS.
4. Manche as fatias com anticorpos anti-GFP e coelhinho em tampão GDB (0,1% gelatina, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl e 32% 1x PB, pH 7,4) por 2h a temperatura ambiente.
5. Lave as fatias com 1x PBS três vezes à temperatura ambiente por 10 minutos cada lavagem.
6. Incubar fatias com anticorpo secundário alexa 488 conjugado e anticorpo secundário alexa 594 conjugados em tampão GDB por 1 h à temperatura ambiente. Incubar fatias com DAPI (4 μg/mL) em 1x PBS por 10 min a temperatura ambiente.
7. Lave as fatias com 1x PBS três vezes à temperatura ambiente por 3 minutos cada lavagem.
8. Monte fatias em lâminas de vidro usando meio de montagem e realize imagens de fluorescência.

Resultados

Nossa eletroporação unicelular é capaz de fornecer genes precisamente em neurônios excitatórios e inibitórios visualmente identificados. Eletroporamos três tipos diferentes de células neuronais em três pontos de tempo diferentes. Linhas de glutamato parvalbumin (Pv) ou glutamato vesicular tipo 3 (VGT3) expressando neurônios foram visualizados cruzando linhas de^cre Pv (JAX #008069) ou VGT3^cre (JAX #018147) com linhas repórter TdTomato (uma variante de proteína fluorescente vermelha) (Jax ...

Discussão

Descrevemos aqui um método de eletroporação que transfecta neurônios excitatórios e inibitórios com alta eficiência e precisão. Nosso protocolo de eletroporação otimizado tem três avanços inovadores para alcançar transfecção genética altamente eficiente. Nossa primeira modificação foi aumentar o tamanho da pipeta em comparação com os protocolos publicados anteriormente^3,5,6. Essa mudança nos permitiu eletrop...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710