Elettroporazione a cella singola attraverso diverse culture di fette organotipiche di neuroni eccitatori ippocampali del topo e specifici della classe

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per l'elettroporazione a singola cellula in grado di fornire geni sia nei neuroni eccitatori che inibitori in una vasta gamma di età della coltura di fette ippocampali in vitro. Il nostro approccio fornisce un'espressione precisa ed efficiente dei geni nelle singole cellule, che può essere utilizzata per esaminare le funzioni cellulari autonome e intercellulari.

Abstract

L'elettroporazione si è affermata come un metodo critico per trasferire geni specifici nelle cellule per comprenderne la funzione. Qui descriviamo una tecnica di elettroporazione a una cellula che massimizza l'efficienza (~80%) della trasfezione genica in vitro nei neuroni inibitori eccitatori e specifici della classe nella coltura di fette ippocampali organotipiche del topo. Utilizzando grandi elettrodi di vetro, liquido cerebrospinale artificiale contenente tetrodotossine e impulsi elettrici lievi, abbiamo fornito un gene di interesse in neuroni piramidali CA1 ippocampali coltivati e internauri inibitori. Inoltre, l'elettroporazione potrebbe essere effettuata in fette ippocampali coltivate fino a 21 giorni in vitro senza alcuna riduzione dell'efficienza di trasfezione, consentendo lo studio di varie fasi di sviluppo della coltura delle fette. Con l'interesse crescente nell'esaminare le funzioni molecolari dei geni in una vasta gamma di tipi di cellule, il nostro metodo dimostra un approccio affidabile e diretto alla trasfezione genica in vitro nel tessuto cerebrale del topo che può essere eseguita con le apparecchiature e le tecniche di elettrofisiologia esistenti.

Introduzione

In biologia molecolare, una delle considerazioni più importanti per uno studio è come fornire un gene di interesse in una cellula o popolazione di cellule per chiarire la sua funzione. I diversi metodi di somministrazione possono essere classificati come biologici (ad esempio, un vettore virale), chimici (ad esempio, fosfato di calcio o lipidi) o fisici (ad esempio, elettroporazione, microiniezione o biolistici)^1,2. I metodi biologici sono altamente efficienti e possono essere specifici del tipo cellulare, ma sono limitati dallo sviluppo di specifici strumenti genetici. Gli approcci chimici sono molto potenti in vitro, ma le trasfettenze sono generalmente casuali; inoltre, questi approcci sono per lo più riservati solo alle cellule primarie. Tra gli approcci fisici, la biolistica è la più semplice e semplice da un punto di vista tecnico, ma ancora una volta produce risultati di trasfezione casuali con un'efficienza relativamente bassa. Per applicazioni che richiedono il trasferimento in cellule specifiche senza la necessità di sviluppare strumenti genetici, guardiamo all'elettroporazione a^{singola cella 3,4}.

Mentre l'elettroporazione si riferiva solo all'elettroporazione sul campo, negli ultimi vent'anni sono stati sviluppati protocolli multipli di elettroporazione a singola cella in vitro e in vivo per migliorare la^{specificità e l'efficienza 5,6,7}, dimostrando che l'elettroporazione può essere utilizzata per trasferire geni a singole cellule e può quindi essere estremamente precisa. Tuttavia, le procedure sono tecnicamente impegnative, dispendiose in termini di tempo e relativamente inefficienti. In effetti, documenti più recenti hanno studiato la fattibilità dei carri meccanizzati di elettroporazione^8,9, che possono aiutare ad eliminare molte di queste barriere per gli investigatori interessati all'installazione di tale robotica. Ma per coloro che cercano mezzi più semplici, i problemi con l'elettroporazione, vale a dire la morte cellulare, il fallimento della trasfezione e l'intasamento delle pipette, rimangono una preoccupazione.

Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di elettroporazione che utilizza pipette di vetro con punta più grande, parametri di impulsi elettrici più lievi e un passaggio di ciclo della pressione unico, che ha generato un'efficienza di trasfezione molto più elevata nei neuroni eccitatori rispetto ai metodi precedenti, e ci ha permesso per la prima volta di trasfetto geni in internauri inibitori, tra cui internauri inibitori che esprimono somatostatina nella regione ippocampale CA1 della coltura organotipica del topo¹⁰. Tuttavia, l'affidabilità di questo metodo di elettroporazione in diversi tipi di internauron inibitori e stadi di sviluppo neuronale non è stata affrontata. Qui, abbiamo dimostrato che questa tecnica di elettroporazione è in grado di trasfetto i geni sia nei neuroni eccitatori che in diverse classi di internauri. È importante sottolineare che l'efficienza della trasfezione era elevata indipendentemente dai giorni in vitro (DIV) di coltura delle fette testate. Questa tecnica consolidata e di facile utilizzo è altamente raccomandata a qualsiasi ricercatore interessato a utilizzare l'elettroporazione a singola cellula per diversi tipi di cellule nel contesto del tessuto cerebrale del topo in vitro.

Protocollo

Tutti i protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la University of Massachusetts Medical School. La preparazione della coltura delle fette, la preparazione del plasmide e l'elettroporazione sono anche dettagliate nei nostri metodi precedentemente pubblicati e possono essere indirizzate per ulteriori^{informazioni 10}.

1. Preparazione della coltura delle fette

1. Preparare le colture di fette ippocampali organotipiche del topo^{come descritto in precedenza 11}, usando topi postnatali di 6-7 giorni di entrambi i sessi.
   1. Preparare i mezzi di dissezione per la coltura di fette organotipiche costituite da (in mM): 238 saccarosio, 2,5 KCl, 1 CaCl₂,₄MgCl 2 , 26 NaHCO_3,1 NaH₂PO₄e 11 glucosio in acqua deionizzata, quindi gas con 5% CO₂/95% O₂ a un pH di 7,4.
   2. Preparare supporti di coltura a fette organotipiche costituiti da: 78,8% (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, Siero di cavallo 20% (v/v), 17,9 mM NaHCO₃, 26,6 mM di glucosio, 2 M CaCl₂, 2 M MgSO₄, 30 mM HEPES, insulina (1 μg/mL) e 0,06 mM di acido ascorbico, pH regolato a 7,3. Regolare l'osmolarità a 310-330 osmol usando un osmometro.
   3. Seziona gli ippocampi da tutto il cervello usando due spatole e affetta (400 μm) usando un elicottero tissutale. Separare le fette utilizzando due forcep e trasferire a inserti di coltura cellulare da 30 mm in una piastra di 6 po 'riempita con mezzi di coltura (950 μL) sotto gli inserti.
2. Conservare le colture di fette organotipiche in un incubatore di colture tissutali (35°C, 5% CO₂₎e cambiare il supporto di coltura delle fette ogni due giorni.

2. Preparazione plasmide

1. Preparare il plasmide per il gene di interesse.
   1. Gene di proteina fluorescente verde potenziata subclone (EGFP) in un vettore pCAG.
   2. Purificare il plasmide pCAG-EGFP con un kit di purificazione privo di endotossine e dissolversi in una soluzione interna costituita da acqua trattata con pirocarbonato dietile contenente 140 mM K-metanosolfonato, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl₂e 10 mM HEPES, regolati in pH 7.3 con KOH (concentrazione di plasmidi: 0,1 μg/μL).

3. Preparazione pipetta di vetro

1. Tirare pipette di vetro borosilicato (4,5 - 8 MΩ) su un estrattore di micropipette (Figura 1A).
   NOTA: Le pipette in vetro utilizzate per le registrazioni di morsetti patch a celle intere sono ideali per l'elettroporazione.
2. Cuocere pipette di vetro durante la notte a 200 °C per sterilizzare.
3. Controllare le dimensioni della punta della pipetta sotto un microscopio a dissezione per approssimare la resistenza elettrica.
   1. Facoltativo:Verificare la resistenza delle pipette collegando la pipetta all'elettrodo di elettroporazione e utilizzare il micromanipolatore per manovrare la punta della pipetta in liquido cerebrospinale artificiale sterilizzato a filtro (aCSF) contenente (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ e 11 glucosio in acqua deionizzata, gassato con il 5% di CO₂/95% O₂ a un pH di 7,4. Confermare la resistenza effettiva utilizzando la lettura sull'elettroporatore.
      NOTA: Più nitida è la punta della pipetta, maggiore è la resistenza elettrica. La resistenza della pipetta dovrebbe essere inferiore a 10 MΩ. Pipette di vetro ad alta resistenza alla pipetta(Figura 1B)spesso si ostruiscono sulla punta durante l'elettroporazione ripetuta.

4. Configurazione del carro di elettroporazione

1. Installare l'elettroporatore su un impianto di elettrofisiologia standard a celle intere, dotato di un microscopio verticale montato su un tavolo di cambiata con micromanipolatore e pompa peristaltica.
2. Installare il headstage dell'elettroporatore su un micromanipolatore e collegare un paio di altoparlanti all'elettroporatore. Collegare l'elettroporatore a un pedale che può essere utilizzato per inviare un impulso quando è pronto.
   NOTA: Gli altoparlanti emettono un tono quando sono accesi, che è un indicatore della resistenza elettrica all'elettrodo. Ciò consente di determinare i relativi cambiamenti nella resistenza senza allontanare l'attenzione dalla procedura.

5. Preparazione dell'elettroporazione

1. Trasferire inserti di coltura a fette da 6 piastre di pozzo a 3 cm piastre di Petri caricate con 900 μL di mezzi di coltura e conservare in un incubatore di CO₂ da tavolo fino a quando non sono pronti per eseguire l'elettroporazione.
   1. Preincubare inserti di coltura fresca con mezzi di coltura a fette (1 mL) per almeno 30 minuti in una piastra di Petri da 3,5 cm a fette di coltura dopo l'elettroporazione.
2. Pulire e preparare il carro per l'elettroporazione.
   1. Perfondere le linee con candeggina al 10% per 5 minuti per sterilizzare i tubi e la camera prima di iniziare l'esperimento per la giornata.
   2. Perfondere le linee con acqua autoclavata deionizzata per almeno 30 minuti per risciacquare completamente.
   3. Perfondere le linee con aCSF sterilizzato con filtro contenente tetrodotossine da 0,001 mM (TTX).
      NOTA: TTX riduce al minimo la tossicità cellulare e la morte dovuta all'eccitazione troppo troppo degli internanti¹⁰.
3. Impostare i parametri dell'impulso dell'elettroporatore: ampiezza di -5 V, impulso quadrato, treno di 500 ms, frequenza di 50 Hz e una larghezza dell'impulso di 500 μs.
4. Riempire pipetta di vetro con 5 μL di soluzione interna contenente plasmidi.
   1. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate dalla punta della pipetta svolazzando e toccando delicatamente la punta più volte.
   2. Controllare la punta per eventuali danni visualizzandola al microscopio a dissezione o ripetendo il passaggio 3.3.1 per verificare la resistenza delle pipette.
      NOTA: Se la punta è danneggiata, la pipetta di vetro deve essere scartata e questo passaggio deve essere ripetuto con una nuova pipetta di vetro precedentemente preparata al passaggio 3.
5. Fissare saldamente la punta della pipetta all'elettrodo e accendere gli altoparlanti. Registrare la lettura (resistenza della pipetta) dell'elettroporatore quando la punta ha preso contatto con il mezzo aCSF.
6. Tagliare la membrana di inserimento della coltura utilizzando una lama affilata e isolare una coltura di fette. Trasferire con cura la coltura della fetta nella camera di elettroporazione utilizzando forcep angolate affilate e fissarne la posizione con un'ancora a fette.
   1. Non mantenere la coltura della fetta al di fuori dell'incubatore per più di 30 minuti alla volta per prevenire effetti collaterali come cambiamenti nella salute neuronale o^{nella funzione 12}.

6. Cellule elettroporate di interesse

1. Applicare una pressione positiva sulla pipetta con la bocca o utilizzando una siringa da 1 ml (pressione 0,2 - 0,5 ml) attaccata al tubo.
2. Utilizzare i comandi della manopola tridimensionale del micromanipolatore per manovrare la punta della pipetta vicino alla superficie della coltura della fetta.
3. Scegli una cellula bersaglio e avvicinati, mantenendo visibile al microscopio la pressione positiva applicata fino a quando non si forma una fossetta sulla superficie cellulare.
4. Eseguire cicli di pressione.
   1. Applicare rapidamente una leggera pressione negativa per bocca in modo che si formi una guarnizione sciolta tra la punta della pipetta e la membrana plasmatica, indicata visivamente dalla membrana che sale in qualche modo nella punta della pipetta. Osservare un aumento (~2,5 volte la resistenza iniziale) nella resistenza delle pipette ascoltando un aumento del tono proveniente dagli altoparlanti. Riimposi rapidamente la pressione positiva in modo che la fossette si ri-forma.
   2. Completare immediatamente almeno altri due cicli di pressione senza fermarsi, quindi tenere premuta la pressione negativa per 1 s.
      NOTA: Fermarsi tra un ciclo e l'altro, applicare troppa pressione o mantenere la pressione negativa per troppo tempo può causare danni significativi alle cellule e possibilmente causare la morte della cellula durante l'elettroporazione.
5. Pulsare rapidamente l'elettroporatore una volta che si utilizza il pedale quando il tono degli altoparlanti raggiunge un apice stabile nel passo, indicando un picco di resistenza elettrica. Non aspettare al picco di resistenza per più di 1 s prima di inviare l'impulso.
   NOTA: Non abbiamo osservato alcuna elettroporazione off-target quando si utilizza questo protocollo¹⁰. Solo le celle a contatto con la pipetta di vetro durante i cicli di pressione sono state trasfette. Il posizionamento della pipetta vicino ad altri neuroni non si trasfezione genica.
6. Ritrarre delicatamente la pipetta a circa 100 μm dalla cella senza applicare pressione.
7. Riapplicazionere la pressione positiva, verificando che la resistenza sia simile alla lettura registrata nel passaggio 5.5, quindi avvicinarsi alla cella successiva.
   1. Rimuovere i potenziali zoccoli, indicati visivamente o da una resistenza alle pipette significativamente aumentata (>15% in più) dopo l'elettroporazione, applicando una pressione positiva.
      NOTA: Se non c'è intasamento visibile e la resistenza è ancora significativamente più alta, scartare la pipetta e usarne una nuova. In media, una pipetta può essere utilizzata per un massimo di 20 eventi di elettroporazione se l'utente è attento¹⁰.
8. Dopo l'elettroporazione, trasferire la coltura della fetta su un inserto di coltura fresco e incubare a 35 °C nell'incubatore per un massimo di 3 giorni.

7. Fissazione, colorazione e imaging di colture organotipiche di fette ippocampali

1. Fissare le colture di fette organotipiche elettroporate 2 - 3 giorni dopo la trasfezione con paraformaldeide al 4% e saccarosio al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato 0,01 M (1x PBS) per 1,5 h a temperatura ambiente.
2. Rimuovere le fette fissive e incubare in saccarosio al 30% in tampone fosfato da 0,1 M (1x PB) per 2 ore.
3. Posizionare le fette su un vetro scorrevole e congelarle mettendo il vetro scorrevole sopra il ghiaccio secco schiacciato. Scongelare le fette a temperatura ambiente e trasferirle in una piastra da 6 pomp po' riempita con 1x PBS.
4. Macchiare le fette con anticorpi anti-GFP e coniglio anti-RFP nel tampone GDB (0,1% gelatina, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl e 32% 1x PB, pH 7,4) per 2 ore a temperatura ambiente.
5. Lavare le fette con 1x PBS tre volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno di lavaggio.
6. Incubare le fette con anticorpo secondario coniugato anti-topo Alexa 488 e anticorpo secondario coniugato anti-coniglio Alexa 594 nel tampone GDB per 1 h a temperatura ambiente. Incubare le fette con DAPI (4 μg/mL) in 1x PBS per 10 min a temperatura ambiente.
7. Lavare le fette con 1x PBS tre volte a temperatura ambiente per 3 minuti ogni lavaggio.
8. Montare le fette su vetrini utilizzando il mezzo di montaggio ed eseguire l'imaging a fluorescenza.

Risultati

La nostra elettroporazione a una cellula è in grado di fornire con precisione geni in neuroni eccitatori e inibitori visivamente identificati. Abbiamo elettroporato tre diversi tipi di cellule neuronali in tre diversi punti di tempo. Parvalbumin (Pv) o glutammato vescicolare di tipo 3 (VGT3) che esprimono neuroni sono stati visualizzati incrociando linee Pv^cre (JAX #008069) o VGT3^cre (JAX #018147) con linee TdTomato (una variante di proteina fluorescente rossa) (Jax #007905), rispettivamente chiama...

Discussione

Descriviamo qui un metodo di elettroporazione che trasfetta sia i neuroni eccitatori che inibitori con alta efficienza e precisione. Il nostro protocollo di elettroporazione ottimizzato ha tre innovazioni innovative per ottenere una trasfezione genica altamente efficiente. La nostra prima modifica è stata l'aumento delle dimensioni delle pipette rispetto ai protocolli^{precedentemente pubblicati 3,5,6}. Questo cambiamento ci ha pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710